Молекулярная биология, 2020, T. 54, № 2, стр. 262-266

Контакты генов рРНК в области, содержащей ген FANK1 в хромосоме 10

На рис. 1 представлена область длиной 260 т.п.н. хромосомы 10. Она содержит несколько генов, расположенных на плюс- и минус-цепях. Видно, что в области первого интрона гена FANK1 и перед ним расположены сайты контактов кластеров генов рРНК. Эта группа контактов большей частью находится в районе длиной около 40 т.п.н. (показана красной рамкой на рис. 1).

Рис. 1.

Физическая карта района 260 т.п.н. субтеломерной области хромосомы 10 человека в браузере IGB (координаты по версии hg19). Вверху указаны места контактов данной области с генами рРНК. По оси Y приведены значения lg числа картированных чтений глубокого секвенирования – 4C-рДНК, полученные для исходных клеток HEK293T (HS-), и клеток, подвергнутых тепловому шоку (HS+). Пики контактов рДНК показаны синим или красным соответственно. Ниже указаны гены, расположенные в этом сегменте хромосомы 10 (на плюс- и минус-цепях), а также приведены эпигенетические метки (браузер UCSC), включающие метку активного хроматина H3K27ac, гиперчувствительные к ДНКазе I сайты, сайты связывания факторов транскрипции, данные ChIA-PET для CTCF и РНК-полимеразы II. Кроме того, указаны сайты картированных малых некодирующих РНК и позиции нуклеосом в этом районе. На треках ChromHMM зеленым показаны области транскрипции; красным – промоторы; серым и белым – репрессированный хроматин.

Небольшие пики меток активного хроматина H3K27ac видны в нескольких районах указанного фрагмента хромосомы 10. Эти отчасти перекрывающиеся между собой пики ацетилированного гистона H3 выявлены в семи линиях клеток человека разного происхождения, отобранных для такого анализа в проекте ENCODE. В 5'-концевой области гена FANK1 имеются узкие пики H3K27ac синего и фиолетового цвета, что соответствует линиям K562 и NHEK. В остальных пяти линиях клеток (GM12872, H1-hESC, HSMM, HUVEC, NHLF) данная гистоновая метка в гене FANK1 отсутствует. Эти данные свидетельствуют о том, что в перечисленных пяти клеточных линиях ген FANK1 либо не активен, либо слабо активен.

Интересно, что область контактов генов рРНК точно совпадает с границей изменения состояний хроматина (дорожки ChromHMM, рис. 1). Белый цвет на этих дорожках указывает на репрессированный хроматин, а зеленый – на области транскрипции. Кроме того, здесь же расположены и границы как фазирования нуклеосом, так и паттерна распределения сайтов, гиперчувствительных к ДНКазе I. На вовлечение этой области гена FANK1 в межхромосомные взаимодействия независимо указывают данные ChIA-PET для CTCF и РНК-полимеразы II (рис. 1). Метод ChIA-PET (Chromatin Interaction Analysis by Paired-End Tag Sequencing) включает иммунопреципитацию препаратов хроматина после лигирования контактирующих областей хроматина [8]. Эти сигналы намного сильнее выражены в клетках HeLa.

Красные сигналы на дорожках ChromHMM указывают на промоторные области. Согласно ChromHMM (рис. 1), промотор в гене FANK1 не активен, поскольку в семи использованных линиях клеток не обнаружена его активная транскрипция (на дорожках ChromHMM показано зеленым цветом). Напротив, промотор гена DHX32, который транскрибируется с другой цепи ДНК, в этих клетках активен. Можно предположить, что ген FANK1 активно транскрибируется и в клетках HeLa, поскольку имеется сильный сигнал ChIA-PET для РНК-полимеразы II, соответствующий данному промотору. Интересно, что в области контактов картированы малые некодирующие РНК. Они соответствуют области репрессированного промотора гена FANK1.

Эти данные позволяют предположить, что контакты генов рРНК в области гена FANK1 могут приводить к эпигенетическому сайленсингу, имеющему четкую границу распространения у 5'‑концевой части гена. Для проверки этого предположения необходимо выяснить, активен ли ген FANK1 в клетках HEK293T, в которых мы обнаружили контакты генов рРНК.

Ген FANK1 не активен в клетках HEK293T

Для изучения активности транскрипции гена FANK1 и трех генов, расположенных перед ним – DHX32, BCCIP и UROS, использовали данные РНК-сек, полученные нами как для исходных клеток HEK293T, так и для клеток, подвергнутых тепловому шоку. Результаты 4С-рДНК, приведенные на рис. 1, указывают на то, что после теплового шока пропадает большая часть контактов генов рРНК в области гена FANK1. Остается лишь один пик в области 127582 т.п.н. Известно, что тепловой шок приводит к репрессии генов рРНК [9]. Поэтому было интересно выяснить, как репрессия генов рРНК и резкое уменьшение их контактов в области гена FANK1 скажется на его транскрипции. Оказалось, что исходные клетки содержат лишь единичные транскрипты гена (рис. 2). После теплового шока, который приводит к утрате большей части контактов генов рРНК, транскрипция существенно возрастает (почти в 4 раза). Транскрипты гена FANK1-AS1 в этих экспериментах не обнаружены. Ген DHX32, расположенный на расстоянии 5 т.п.н. от ближайшего к нему контакта генов рРНК, в исходных клетках транскрибируется значительно активнее (примерно в 140 раз), а более удаленный от района контактов ген BCCIP – более чем в 500 раз активнее гена FANK1. Эти данные позволяют сделать вывод о том, что контакты генов рРНК в исходных клетках могут вызывать сайленсиг гена FANK1. Контакты кластеров генов рРНК приводят к изменению состояния хроматина, которое имеет четкую границу у 5'-конца гена. Репрессирующее влияние этих контактов в указанной области хромосомы 10 не распространяется выше (upstream).

Рис. 2.

Транскрипция четырех генов в изучаемой области хромосомы 10 человека в клетках HEK293T. Представлена активность гена FANK1 и генов, расположенных перед ним – DHX32, BCCIP и UROS. Приведены результаты РНК-сек (по две биологических реплики для исходных клеток и клеток, подвергнутых тепловому шоку (HS+)). В каждом случае указано число чтений, соответствующих данному гену, на 10 млн чтений РНК-сек. Масштабы по оси Y существенно отличаются. * – p < 0.05.

Гены BCCIP и UROS, указанные на рис. 1 и рис. 2, расположены на разных цепях в данной области хромосомы 10. Они имеют сближенные старты транскрипции (transcription start sites, TSS) и расположены в области активного хроматина. TSS этих генов отстоят только на 290 п.н., т.е. имеют небольшую область общего промотора. Однако в исходных клетках линии HEK293T они обнаруживают разную активность. Ген BCCIP транскрибируется примерно в 2.8 раза активнее, чем ген UROS. После теплового шока эти гены также ведут себя по-разному: BCCIP транскрибируется слабее (примерно в 1.6 раза), а ген UROS сильнее (примерно в 1.56 раза). Эти данные указывают на важную роль не только общей промоторной области в регуляции этих генов, но и каких-то других факторов. Кластеры генов рРНК являются только одним из эпигенетических регуляторов, которые могут избирательно вызывать репрессию в области гена FANK1.