1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Молекулярная биология
  4. T. 54, № 3, 2020

Молекулярная биология, 2020, T. 54, № 3, стр. 474-479

Структура нейроглобина холодноводной губки Halisarca dujardinii

К. И. Адамейко a, О. И. Кравчук a, *, А. Д. Финошин a, А. Н. Бончук b, А. А. Георгиев c, В. С. Михайлов a, Н. Г. Горностаев a, К. В. Михайлов c, d, А. В. Бачева c, М. И. Индейкина e, А. Е. Бугрова e, Г. Р. Газизова f, О. С. Козлова f, О. А. Гусев f, g, Е. И. Шагимарданова f, Ю. В. Люпина a

a Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова Российской академии наук
119334 Москва, Россия

b Институт биологии гена Российской академии наук
119334 Москва, Россия

c Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова
119991 Москва, Россия

d Институт проблем передачи информации им. А.А. Харкевича Российской академии наук
127051 Москва, Россия

e Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук
119334 Москва, Россия

f Казанский (Приволжский) федеральный университет
420008 Казань, Россия

g KFU-RIKEN Translational Genomics Unit
230-0045 Yokohama, Japan

* E-mail: kravchuk444@mail.ru

Поступила в редакцию 23.10.2019
После доработки 22.11.2019
Принята к публикации 02.12.2019

Полный текст (PDF)

Аннотация

Железосодержащий белок нейроглобин (Ngb), участвующий в транспорте кислорода, считается предшественником всех глобиновых белков животных. В настоящей работе изучена структура Ngb холодноводной губки Halisarca dujardinii. У губок, древнейших многоклеточных организмов, ген Ngb содержит три интрона, и его промотор в отличие от Ngb человека содержит TATA-бокс, а не CG-богатые участки. Белок Ngb H. dujardinii состоит из 169 аминокислотных остатков, имеет относительно низкое сходство с ортологами у млекопитающих и не содержит консервативных остатков Glu и Arg, необходимых для предотвращения апоптоза, вызванного гипоксией. При этом имеются проксимальные и дистальные консервативные гем-связывающие остатки гистидина. Первичная структура нейроглобина H. dujardinii, предсказанная секвенированием мРНК, подтверждена масс-спектрометрией рекомбинантного Ngb, экспрессированного в клетках Escherichia coli. Высокий уровень экспрессии Ngb в тканях губки указывает на его участие в газообмене и, возможно, в других метаболических процессах.

Ключевые слова: нейроглобин, Halisarca dujardinii, структура гена

Нейроглобин (Ngb) – железосодержащий гемопротеин, участвующий в транспорте кислорода. Впервые нейроглобин обнаружили в 2000 году в нервной системе позвоночных [1]. Оказалось, что этот белок способен обратимо связывать кислород и участвовать в его транспорте. Сродство Ngb позвоночных к кислороду выше, чем у гемоглобина, однако его содержание в мозге мало и поэтому значение в транспорте кислорода невелико. Предполагается, что Ngb человека может участвовать в защите мозга от повреждений в условиях гипоксии или ишемии [2], связывании свободных радикалов [3], защите от апоптоза [4], регуляции нитритредуктазы [5] и обмене кислорода в сетчатке [6]. Определена пространственная структура нейроглобина человека [7] и мыши [8].

Ранее Ngb считали белком, характерным для позвоночных. Однако за последнее десятилетие Ngb обнаружили у различных многоклеточных животных, в том числе у губок (Amphimedon queenslandica и Carterospongia foliascens) [9]. Примерный возраст Ngb, который считается возможным предшественником всех глобиновых белков животных [9], составляет 550 млн лет [10], т.е. это древний белок, функции которого могли сильно меняться на протяжении эволюции [11].

Губки (Porifera) – одни из древнейших многоклеточных организмов. Изучение белков губок, интересное с эволюционной точки зрения, помогает узнать как функционировали клетки первых многоклеточных. С использованием секвенирования ДНК и РНК нами изучена структура гена нейроглобина холодноводной морской губки Halisarca dujardinii. Получен также рекомбинантный белок Ngb H. dujardinii, предсказанная аминокислотная последовательность которого подтверждена с помощью спектрометрического и хромато-масс-спектрометрического анализа.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Образцы губок. Образцы губок H. dujardinii собраны на Беломорской биологической станции МГУ в ноябре 2017 г (66°34′ N 33°08′ E).

Выделение РНК, конструирование библиотек кДНК и секвенирование. РНК выделяли с использованием TRI Reagent (“Molecular Research Center, Inc.”, США), обрабатывали ДНКазой I (“Ambion”, США) и очищали с помощью Ribo-zero rRNA Removal Kit (Human/Mouse/Rat) (“Illumina”, США). Фрагменты кДНК для библиотек получали с использованием NEBNext® Ultra™ II Directional RNA Library Prep Kit для Illumina® (“New England Biolabs”, США), проверяли, используя Agilent 2100 DNA High Sensitivity Kit, и секвенировали на Illumina Hiseq2500 с парноконцевыми чтениями длиной 125 п.н. мРНК для одноконцевых прочтений длиной 50 п.н. выделяли из суммарной РНК с помощью NEBNext® Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module (“New England Biolabs”). Далее проводили конструирование библиотек кДНК и их секвенирование на приборе Illumina Hiseq2500.

Сборка транскриптома и анализ дифференциальной экспрессии. На основе парноконцевых прочтений проводили сборку транскриптома de novo с помощью программы Trinity v.2.8.4 [12]. По собранным транскриптам с помощью TransDecoder v.5.5 проводили предсказание белковых продуктов. Гомологи нейроглобина искали с помощью программ Blastp (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) и Exonerate (https://www.ebi.ac.uk/about/vertebrate-genomics/software/exonerate). Выравнивание аминокислотных последовательностей нейроглобина H. dujardinii и нейроглобинов других организмов проводили в программе Jalview 2.11.0. Последовательности для выравнивания брали из базы GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Одноконцевые прочтения (в двух повторах) для губки и диссоциированных клеток картировали на транскриптомную сборку. Уровень экспрессии генов рассчитывали после удаления генов с низкой экспрессией с помощью программы edgeR [13]. Использовали коррекцию значений M (усеченное среднее ‒ trimmed mean TMM) и определяли количество прочтений на миллион (CPM).

RACE-анализ. Полноразмерную кДНК нейроглобина H. dujardinii, фланкированную адаптерными последовательностями, получали по технологии Mint с использованием набора Mint RACE cDNA amplification set (“Евроген”, Россия) [14]. Первую цепь кДНК использовали в ПЦР (Step-Out PCR) [15] со специфическим праймером и набором Step-Out primer mix (“Евроген”). Полученный ПЦР-продукт клонировали в плазмиду pAL2-T (“Евроген”) и секвенировали.

Секвенирование ДНК. ДНК выделяли из образцов H. dujardinii. Геномные библиотеки готовили с помощью NebNext UltraDirectional II kit (NEB) и секвенировали на платформе Illumina Hiseq 4000.

Получение белка. ПЦР-фрагмент получали на матрице кДНК Ngb с праймерами, специфичными к кодирующей последовательности (5'-atgtcccaagacaactcagtg-3' и 5'-ttactccaaattgatgggctct-3'). ПЦР-фрагмент клонировали в плазмиду pET32v9, обработанную рестриктазами BamHI и XhoI, и трансформировали полученной плазмидой клетки E. coli штамм BL21. Белок Ngb H. dujardinii экспрессировали и выделяли с использованием хроматографии на Ni-NTA-агарозе (pET System Manual, “Novagen,” Великобритания), как описано ранее [16].

Регистрация спектра. Cпектры белка регистрировали на спектрофотометре U-2800A Hitachi (Япония). Раствор нейроглобина (500 мкл, 0.25 мг/мл) в 20 мМ Трис-HCl-буфере рН 7.4, содержащем 100 мМ NaCl, 1 мМ дитиотреитол, помещали в кварцевую кювету и регистрировали изменение оптической плотности раствора в диапазоне длин волн 200‒500 нм. В качестве раствора сравнения использовали тот же буфер.

Масс-спектрометрия. Спектры белка, обработанного трипсином, получены с помощью время-пролетной масс-спектрометрии с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI/TOF) на спектрометре Ultraflextreme BRUKER (Германия). Идентификацию белков проводили с помощью программного обеспечения Mascot (www.matrixscience.com).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В сборке транскриптома губки H. dujardinii идентифицированы несколько последовательностей мРНК Ngb разной длины. 5'-Область мРНК гена Ngb клонирована и секвенирована при помощи RACE-анализа. Полученная полная нуклеотидная последовательность РНК депонирована в GenBank (идентификационный номер MK520984) и выровнена на черновой сборке генома (idbras.ru/lab/files33/file62.zip, неопубликованные данные) (рис. 1а). В отличие от промоторной области гена Ngb млекопитающих, содержащей два GC-бокса [17], в промоторной области Ngb H. dujardinii в положении –30 от старта транскрипции находится TATA-бокс [18]. В положении -1 от начала транскрипции находится остаток цитозина, а в положении +1 – аденина. Они фланкированы пиримидиновыми нуклеотидами, что соответствует мотиву инициации транскрипции (Inr) [18]. В промоторной области гена нейроглобина губки A. queenslandica (GenBank, идентификационный номер NW_003546451.1) находится также АТ-богатая последовательность, похожая на TATA-бокс, но не найден мотив Inr. Структура промоторной области гена Ngb указывает на то, что в инициации его транскрипции должны принимать участие ТАТА-связывающий белок (TBP) и факторы транскрипции TFIIA, TFIID, TFIIE, TFIIF и TFIIH. В отличие от губок, промоторная область гена нейроглобина млекопитающих не содержит ТАТА-бокс ‒ древний промоторный мотив эукариот. Последовательности, сходные с ТАТА-боксом, найдены даже у протистов, тогда как у позвоночных ТАТА-бокс распространен не столь широко. Ген Ngb H. dujardinii содержит три интрона, что соответствует структуре генов Ngb других организмов [19]. В 3'‑области гена находится длинная (4330 п.н.) нетранслируемая область. Нуклеотидная последовательность гена Ngb губки сильно отличается от Ngb млекопитающих и губки A. queenslandica (ген Ngb H. dujardinii более чем в 2 раза длиннее гена Ngb A. queenslandica в основном за счет более протяженных интронов). Молекула нейроглобина состоит из 169 аминокислотных остатков, что на 18 больше, чем у Ngb человека и мыши (151 аминокислотный остаток). Значение идентичности (identity) аминокислотных последовательностей белков Ngb H. dujardinii и A. queenslandica (XP_003387899.1) равно 39%. При сравнении с Ngb других беспозвоночных и позвоночных значение идентичности составляло около 30%. При этом идентичность аминокислотной последовательности Ngb человека и мыши достигает 94%, что выше, чем между ортологами гемоглобина и миоглобина, а также многих других белков у этих видов [1]. Белок Ngb H. dujardinii, несмотря на низкую консервативность его аминокислотной последовательности, содержит проксимальный и дистальный остатки гистидина, необходимые для связывания гема (рис. 1б). В Ngb H. dujardinii не найдены консервативные остатки глутамата (Glu) и аргинина (Arg), необходимые для защиты клеток позвоночных от апоптоза (программированной клеточной гибели) в условиях гипоксии [11].

Рис. 1.

Структура нейроглобина губки H. dujardinii. а ‒ Структура гена Ngb. TATA-бокс и Inr обведены рамками. Интроны показаны пунктирной линией. б ‒ Выравнивание аминокислотных последовательностей белков Ngb человека (HS), губок H. dujardinii (HD) и A. queenslandica (AQ). Идентификационные номера последовательностей, депонированных в GenBank ‒ NP_067080.1, MK520984 и XP_003387899.1 соответственно. Белыми стрелками обозначены консервативные остатки гистидина, звездочками – аминокислоты, участвующие в защите клеток позвоночных от апоптоза в условиях гипоксии. в ‒ Аминокислотная последовательность белка и пептиды, определенные с помощью масс-спектрометрии (серые линии). г ‒ Спектр поглощения белка Ngb.

С целью изучения свойств нейроглобина губки H. dujardinii мы получили конструкции для продукции белка Ngb в клетках E. coli. Белок был выделен и очищен, а его последовательность, предсказанная по результатам секвенирования мРНК и генома, подтверждена с помощью масс-спектрометрии (рис. 1в). В спектре поглощения нейроглобина H. dujardinii обнаружен пик при 412  нм (рис. 1г), что соответствует спектру гемсодержащего белка. Эти результаты подтверждают, что полученный белок H. dujardinii является нейроглобином. В дальнейшем мы планируем исследовать его свойства и определить пространственную структуру.

Поиск других генов глобинов в сборке транскриптома H. dujardinii привел к обнаружению гена андроглобина (ADGB), представленного в геноме многих беспозвоночных, в том числе губки A. queenslandica. Экспрессия андроглобина в интактной губке и в клеточной суспензии была в 2 раза ниже, чем у Ngb (табл. 1).

Таблица 1.  

Уровень экспрессии Ngb и ADGB в интактных губках и в суспензии клеток (опыт проведен в двух биологических повторах)

Ген Губка Клеточная суспензия
1 2 1 2
Ngb 47.31 55.01 27.01 32.14
ADGB 25.13 21.88 15.99 15.00

Примечание. Уровень экспрессии определен в CPM.

Относительно более высокая, по сравнению с ADGB, экспрессия Ngb говорит о его более значительном вкладе в газообмен и, возможно, в другие метаболические процессы у H. dujardinii.

Исследования проведены с использованием оборудования ЦКП ИБР РАН. Хромато-масс-спектрометрический анализ выполнен на оборудовании ЦКП ИБХФ РАН “Новые материалы и технологии”.

Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (грант № 19-34-50002) и государственным заданием ИБР РАН.

Все процедуры, выполненные в данной работе, соответствуют этическим стандартам институционального комитета по исследовательской этике и Хельсинкской декларации 1964 года и ее последующим изменениям или сопоставимым нормам этики.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Список литературы

  1. Burmester T., Weich B., Reinhardt S., Hankeln T. (2000) A vertebrate globin expressed in the brain. Nature. 407, 520–523.

  2. Burmester T., Gerlach F., Hankeln T. (2007) Regulation and role of neuroglobin and cytoglobin under hypoxia. Adv. Exp. Med. Biol. 618, 169–180.

  3. Li W., Wu Y., Ren C., Lu Y., Gao Y., Zheng X., Zhang C. (2011) The activity of recombinant human neuroglobin as an antioxidant and free radical scavenger. Proteins. 79, 115–125.

  4. Brittain T., Skommer J., Henty K., Birch N., Raychaudhuri S. (2010) A role for human neuroglobin in apoptosis. IUBMB Life. 62, 878–885.

  5. Tiso M., Tejero J., Basu S., Azarov I., Wang X., Simplaceanu V., Frizzell S., Jayaraman T., Geary L., Shapiro C., Ho C., Shiva S., Kim-Shapiro D.B., Gladwin M.T. (2011) Human neuroglobin functions as a redoxregulated nitrite reductase. J. Biol. Chem. 286, 18277–18289.

  6. Lechauve C., Augustin S., Cwerman-Thibault H., Bouaita A., Forster V., Célier C., Rustin P., Marden M.C., Sahel J.A., Corral-Debrinski M. (2012) Neuroglobin involvement in respiratory chain function and retinal ganglion cell integrity. Biochim. Biophys. Acta. 1823, 2261–2273.

  7. Pesce A., Dewilde S., Nardini M., Moens L., Ascenzi P., Hankeln T., Burmester T., Bolognesi M. (2003) Human brain neuroglobin structure reveals a distinct mode of controlling oxygen affinity. Structure. 11, 1087‒1095.

  8. Vallone B., Nienhaus K., Brunori M., Nienhaus G.U. (2004) The structure of murine neuroglobin: novel pathways for ligand migration and binding. Proteins. 56, 1087‒1095.

  9. Lechauve C., Jager M., Laguerre L., Kiger L., Correc G., Leroux C., Vinogradov S., Czjzek M., Marden M.C, Bailly X. (2013) Neuroglobins, pivotal proteins associated with emerging neural systems and precursors of metazoan globin diversity. J. Biol. Chem. 8, 6957‒6967.

  10. Casado B., Pannell L.K., Whalen G., Clauw D.J., Baraniuk J.N. (2005) Human neuroglobin protein in cerebrospinal fluid. Proteome Sci. 3, 2.

  11. Wakasugi K., Takahashi N., Uchida H., Watanabe S. (2011) Species-specific functional evolution of neuroglobin. Mar. Genomics. 4, 137‒142.

  12. Grabherr M.G., Haas B.J., Yassour M., Levin J.Z., Thompson D.A., Amit I., Adiconis X., Fan L., Raychowdhury R., Zeng Q., Chen Z., Mauceli E., Hacohen N., Gnirke A., Rhind N., di Palma F., Birren B.W., Nusbaum C., Lindblad-Toh K., Friedman N., Regev A. (2011) Full-length transcriptome assembly from RNA-Seq data without a reference genome. Nat. Biotechnol. 29, 644–652.

  13. McCarthy D.J., Chen Y., Smyth G.K. (2012) Differential expression analysis of multifactor RNA-Seq experiments with respect to biological variation. Nucl. Acids Res. 40, 4288–4297.

  14. Schmidt W.M., Mueller M.W. (2012) CapSelect: a highly sensitive method for 5' CAP-dependent enrichment of full-length cDNA in PCR-mediated analysis of mRNAs. Nucl. Acids Res. 27, e31.

  15. Matz M., Shagin D., Bogdanova E., Britanova O., Lukyanov S., Diatchenko L., Chenchik A. (1999) Amplification of cDNA ends based on template-switching effect and step-out PCR. Nucl. Acids Res. 27, 1558–1560.

  16. Bonchuk A., Denisov S., Georgiev P., Maksimenko O. (2011) Drosophila BTB/POZ domains of “ttk group” can form multimers and selectively interact with each other. J. Mol. Biol. 412, 423‒436.

  17. Zhang W., Tian Z., Sha S., Cheng L.Y., Philipsen S., Tan-Un K.C. (2011) Functional and sequence analysis of human neuroglobin gene promoter region. Biochim. Biophys. Acta. 1809, 236‒244.

  18. Smale S.T., Kadonaga J.T. (2003) The RNA polymerase II core promoter. Annu. Rev. Biochem. 72, 449‒479.

  19. Dröge J., Pande A., Englander E.W., Makałowski W. (2012) Comparative genomics of neuroglobin reveals its early origins. PLoS One. 7, e47972.

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Молекулярная биология

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал