Молекулярная биология, 2020, T. 54, № 3, стр. 355-361

КЛЕТОЧНОЕ СТАРЕНИЕ (CELL SENESCENCE) И МИТОХОНДРИИ

В 1961 году была опубликована статья Леонарда Хейфлика (L. Hayflick) об ограниченном пролиферативном потенциале клеток человека, получившем в дальнейшем название “предел Хейфлика” [1]. Сам Хейфлик в более поздней работе 1965 года предположил, что феномен клеток “фазы III” (после остановки делений), вероятно, связан с процессами старения in vivo [2]. Работы Хейфлика положили начало цитогеронтологии, поскольку в предшествующие 60 лет господствовало мнение Алексиса Карреля (A. Carrel) о клеточном бессмертии [3], и причины старения организмов было принято искать не внутри клеток, а в их взаимоотношениях со средой и друг с другом. С этого времени в англоязычной научной литературе закрепился термин “cell senescence”, первоначально обозначающий процессы, сопровождающие остановку пролиферации клеток в культуре.

Учитывая, что явление, называемое в последние 55 лет “cell senescence”, ‒ это активный процесс, имеющий вполне определенные механизмы, которые могут быть отключены, полагаю, что настала пора сделать перевод этого термина, чтобы отличать его от “cell aging”. Я предлагаю переводить “cell senescence”, как клеточная сенильность, поскольку такой термин уже знаком русскоязычным медикам.

“Cтарение клеток” ‒ очень общий термин. Обычно этим термином обозначают изменения, возникающие в клетках с течением времени без уточнения механизмов. Клеточная сенильность – это состояние, возникающее в клетке в ответ на повреждение или обнаружение неполадок, при котором клетка необратимо переходит в неделящееся состояние. С течением времени сенильность углубляется, на смену одним поддерживающим механизмам приходят другие [4‒6]. Полагают, что главной функцией клеточной сенильности является защита от новообразований [7].

Теломерная теория объяснила природу лимита Хейфлика, но сразу стало ясно, что недорепликация теломер это лишь один из механизмов, ведущих к клеточной сенильности. С течением времени клеточной сенильностью стали называть разнообразные явления. Помимо исчерпания пролиферативного потенциала к клеточной сенильности стали относить длительную остановку пролиферации под воздействием разнообразных повреждений, всякого рода стрессов [8, 9], конфликта регуляции при активации некоторых онкогенов [10] и даже явления, сопровождающие раневой процесс [11] и нормальное эмбриональное развитие [12, 13].

На каком-то этапе развития произошло объединение теломерной и свободно-радикальной теорий. К недорепликации добавилась недорепарация [14]. Было показано, что потери теломерной ДНК возрастают в условиях окислительного стресса, далее работают такие же механизмы, как и при клеточной сенильности [15, 16]. Появились работы, показывающие, что митохондрии, вероятно, определяют скорость укорачивания теломер, поскольку являются основным источником активных форм кислорода (АФК) [17]. Более того, снижение количества митохондрий в клетках ведет к уменьшению доли сенильных клеток in vivo [18].

Логичным шагом стали попытки направления антиоксидантов в митохондрии. Оказалось, что антиоксиданты удлиняют, хоть и незначительно, среднюю продолжительность жизни мышей и других организмов, а также снижают симптоматику многих ассоциированных со старением патологий [19, 20]. При этом в опытах in vitro увеличить пролиферативный потенциал клеток под влиянием антиоксиданта, направленного в митохондрии (MitoQ), удавалось только в условиях незначительного окислительного стресса [21].

Стоит отметить, что и обычные антиоксиданты часто не оказывает положительного воздействия на пролиферацию клеток в культуре. Заслуживают внимания две ранние работы L. Packer и J.R. Smith [22, 23]. В 1974 г. они показали положительное влияние витамина Е на пролиферативный потенциал фибробластов человека в культуре. Спустя 3 г. они же сообщили, что им не удалось воспроизвести собственные результаты [23].

В 1991 г. был опубликован обзор о том, что антиоксиданты не способны увеличить пролиферативный потенциал первичных клеток в культуре [24]. Но уже в 1994 г. показали, что антиоксидант карнозин увеличивает пролиферативный потенциал фибробластов [25]. Нам удалось повторить этот результат. Установлено, что при редком посеве карнозин увеличивает размер колоний клеток и замедляет их переход в неделящееся состояние [26]. Но справедливо возникает вопрос об особенностях карнозина, которые уходят далеко за пределы простого антиоксиданта.

Наконец в 2019 г. сообщили, что антиоксиданты подавляют сенильность клеток в культуре [27].

Анализ этих работ выявляет ограничения свободно-радикальной теории старения. В отсутствие окислительного стресса антиоксиданты не способны положительно влиять на показатели старения. Примерно такой же результат получен и на животных (мышах), значимое увеличение продолжительности жизни которых наблюдалось только в условиях обычного вивария [20], тогда как в свободном от патогенов виварии антиоксиданты не удлиняли продолжительность жизни [20]. Культура клеток в этом контексте напоминает чистую изолированную систему, лишенную стрессовых воздействий, которая существенно отличается от условий внутри организма, подверженного всевозможным стрессам, связанным с работой иммунной системы.

МИТОХОНДРИИ, ПРОДУКЦИЯ АФК И РАЗОБЩЕНИЕ

Существенная часть нормальных реакций в клетке представлена окислительно-восстановительными реакциями, поэтому есть множество источников АФК и активных форм азота. В первую очередь, это митохондрии (дыхательная цепь и оксидоредуктазы), к которым можно добавить пероксисомы, эндоплазматический ретикулум, плазматическую мембрану, цитозоль, лизосомы, микросомы и даже ядерную оболочку [28]. В некоторых ситуациях основными источниками АФК могут быть не митохондрии. Так, при дыхательном взрыве нейтрофилов главным источником АФК становится NADPH-оксидаза. В печени это может быть цитохром-Р450-монооксигеназная система микросом, при ишемии‒реперфузии существенную роль играет ксантиноксидаза, при развитии воспаления – циклооксигеназы и липооксигеназы [29].

Основным источником АФК принято считать дыхательную цепь митохондрий, хотя некоторые ученые полагают, что при измерениях in vitro продукция АФК дыхательной цепью завышается в результате неадекватных экспериментальных условий [30].

Известно, что продукция АФК митохондриями зависит от ряда обстоятельств, среди которых особо выделяют потенциал внутренней мембраны митохондрий; снижение потенциала ведет к уменьшению продукции АФК. Механизмы, связывающие потенциал внутренней мембраны и продукцию АФК, описаны многократно. Два наиболее очевидных механизма ‒ локальное снижение концентрации кислорода и замедление транспорта электронов. Разобщение усиливает дыхание, что уменьшает локальную концентрацию кислорода, а поэтому и продукцию АФК [31, 32].

Разобщители ‒ это вещества, которые увеличивают проницаемость внутренней мембраны митохондрий для протонов, что ведет к уменьшению протонного градиента. АТР-синтаза, также называемая комплексом V, – это фермент внутренней мембраны митохондрий, использующий энергию протонного градиента для синтеза АТР из АDP и фосфата. При критическом снижении градиента протонов синтез АТР становится невозможным. Реакции окисления при этом продолжаются, т.е. наступает разобщение окисления и фосфорилирования. Энергия перестает запасаться в виде АТР и расходуется в виде тепла.

Давно известно, что подавить продукцию АФК можно с помощью разобщителей [33]. Первоначально полагали, что функции разобщителей состоят только в генерации тепла, однако замечено, что окислительный стресс увеличивает экспрессию белков-разобщителей, которые встраиваются во внутреннюю мембрану, снижают градиент протонов, уменьшая тем самым продукцию АФК [34–36].

Наиболее хорошо изучен белок-разобщитель термогенин (UCP1) из бурого жира [37]. Действие холода ведет к повышению продукции АФК митохондриями, а термогенез (разобщение) включается только при условии окислительной модификации UCP1 по остатку цистеина 253. Инактивация АФК митохондриальным антиоксидантом MitoQ или восстановление редокс-потенциала с помощью N-ацетилцистеина блокирует термогенез. Возможно, что другие белки-разобщители (UCP2‒5) работают по аналогичной схеме: в ответ на окислительный стресс запускают разобщение, которое снижает продукцию АФК [38]. Известны варианты генов белков-разобщителей, связаные с долгожительством, что косвенно указывает на их роль в борьбе с окислительным стрессом [39].

ВЛИЯНИЕ РАЗОБЩИТЕЛЕЙ НА ЗДОРОВЬЕ

Динитрофенол (ДНФ) известен науке с 19-го века. В 1930-е годы ДНФ применяли для снижения веса, и в США с этой целью было выписано около 100 000 рецептов этого препарата. Потом ДНФ был запрещен из-за его побочных эффектов (летальный перегрев организма, возникновение катаракт). В наше время ведутся работы, направленные на модификацию ДНФ и ограничение его токсичности (“Mitochon Pharmaceuticals Inc.”, США). В 2013 г. о ДНФ сообщили как о предлекарстве, направляемом в печень [40]. Результаты оказались весьма обнадеживающими: жировое перерождение печени уходило, снижался уровень триглицеридов плазмы, уменьшалась резистентность к инсулину. Аналогичный результат достигнут и с помощью ДНФ, растворенного в масле [41]. Еще один разобщитель – никлозамид, разрешен к применению при глистных инвазиях. Он увеличивает энергетические затраты у мышей, уменьшает накопление жира в печени и снижает резистентность к инсулину – все это эффекты блокирования метаболического синдрома [42].

Показано, что ДНФ увеличивает продолжительность жизни мышей, как и направленные в митохондрии антиоксиданты. При этом наблюдалось повышение тканевого дыхания, уменьшение веса, снижение уровня глюкозы и триглицеридов в плазме. Все это достигалось при очень низкой дозировке ДНФ, примерно 100 мкг/день (в сотни раз ниже дозы, которую прописывали в 1930-е годы) [43]. ДНФ вызывал также увеличение средней продолжительности жизни мух, не влияя на максимальную [44].

Показано, что ДНФ снижает чрезмерное накопление кальция в митохондриях, уменьшая вероятность открытия митохондриальных пор и развития апоптоза при повреждениях [45]. ДНФ снижает активность mTOR и сигнального пути инсулина, активирует аутофагию и в 3 раза усиливает выработку BDNF. Возможно, эти эффекты ответственны за вызываемое ДНФ уменьшение повреждений нервной ткани при травме и в различных модельных системах ([46] и ссылки там).

ДАЛЬНЕЙШИЕ ПЕРСПЕКТИВЫ. ЖИРНЫЕ КИСЛОТЫ

На сегодняшний день можно выделить два, возможно три, выработанных естественным отбором принципиально разных механизма борьбы с избытком АФК:

1. Pазнообразные антиоксидантные системы;

2. Механизмы снижения потенциала внутренней мембраны митохондрий за счет увеличения ее проницаемости для протонов;

3. Действие теломеразы по еще не изученному механизму, связанному, видимо, с воздействием на митохондриальный геном.

В 21-ом веке было сделано удивительное открытие. Теломераза оказалась одним из участников ответа клеточного ядра на окислительный стресс. В условиях окислительного стресса теломеразный белок экспортируется из ядра и импортируется в митохондрии, вызывая снижение продукции АФК [47, 48].

Таким образом, оказалось, что две функции теломеразы ‒ противостояние недорепликации и недорепарации теломер ‒ логично связаны.

Замечательный результат получен на мышах со сверхдлинными теломерами (а значит, возможно, с повышенной активностью теломеразы, хотя эти данные не приведены [49]). Эти мыши обладают теми же особенностями, которые вызывают направленные в митохондрии антиоксиданты и разобщители, а именно, имеют увеличенную продолжительность жизни, сниженный вес, уменьшенное накопление липидов, сниженный уровень холестерина и липопротеидов плазмы, повышенную чувствительность к инсулину, у них быстрее снижается уровень глюкозы.

Одно из интересных свойств антиоксидантов, направленных в митохондрии, ‒ снижение потенциала внутренней мембраны [50, 51]. Возможно, что определенная доля их эффективности связана с действием на потенциал внутренней мембраны и соответствующим уменьшением продукции АФК.

В.П. Скулачев с коллегами в 2010 г. описал удивительный феномен направленного в митохондрии протонофора [52]. Оказалось, что направленный в митохондрии антиоксидант и свободная жирная кислота могут работать вместе сразу по двум механизмам (соединение механизмов 1 и 2 в одном).

К сожалению, ДНФ и аналогичные разобщители, действующие в одиночку и неспецифичные к различным мембранам, имеют ряд недостатков. Это, прежде всего, неравномерность распределения в организме, связанная с этим малая терапевтическая широта и, соответственно, побочные эффекты. Эффективность ДНФ сильно ограничена малым временем жизни, не позволяющим поддерживать его концентрацию в организме продолжительное время.

Известно, что свободные жирные кислоты являются природными разобщителями, которые работают во взаимодействии с разобщающими белками. При этом экспрессия разобщающих белков связана с окислительным стрессом. Таким образом, белки-разобщители нацеливают жирные кислоты именно на снижение окислительного стресса.

Возможно, что будет разработана технология введения определенных жирных кислот в организм с целью вызвать слабое разобщение. Большой успех достигнут при использовании дейтерированных полиненасыщенных жирных кислот. Замена атома водорода на дейтерий в определенных позициях (бис-аллильных) между двойными связями снижает вероятность окисления жирной кислоты за счет кинетического изотопного эффекта и тем самым тормозит распространение перекисного окисления липидов [53].

Перекисное окисление липидов – один из важных патогенетических механизмов развития ряда нейродегенеративных болезней, его торможение существенно снижает повреждение мембран и уменьшает проявления болезней в модельных системах, в том числе болезней Альцгеймера и Паркинсона, хореи Гентингтона и атаксии Фридрейха [54]. Показано, что дейтерированные жирные кислоты снижают окислительный стресс и удлиняют продолжительность жизни Caenorhabditis еlegans [54].

Вопрос о введении в организм свободных жирных кислот необычайно сложен ввиду разнообразных токсических последствий контакта определенных жирных кислот с разными типами клеток. Результаты опытов in vitro часто противоречивы, что в сумме можно объяснить недостаточным пониманием процессов, происходящих на пересечении физики, химии и биологии. Во всяком случае, нами показано, что накожная аппликация препарата, состоящего в основном из жирных кислот, вызывает разнообразные эффекты, ассоциированные с подавлением фенотипа старения in vivo [55].

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований в рамках научного проекта № 19-04-01071.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов исследований.

Автор заявляет об отсутствии конфликта интересов.