1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Молекулярная биология
  4. T. 54, № 4, 2020

Молекулярная биология, 2020, T. 54, № 4, стр. 643-652

Изменения структуры титина при его агрегации

А. Г. Бобылёв a, *, Э. И. Якупова a, Л. Г. Бобылёва a, О. В. Галзитская a, b, А. Д. Никулин b, С. А. Шумейко a, Д. А. Юршенас a, И. М. Вихлянцев a, **

a Институт теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук
142290 Московская обл., Пущино, Россия

b Институт белка Российской академии наук
142290 Московская обл., Пущино, Россия

* E-mail: bobylev1982@gmail.com
** E-mail: ivanvikhlyantsev@gmail.com

Поступила в редакцию 04.12.2019
После доработки 03.02.2020
Принята к публикации 14.02.2020

Полный текст (PDF)

Аннотация

Изучена способность мышечного белка титина формировать in vitro особого рода амилоидо-подобные агрегаты. Основное отличие этих агрегатов от известных амилоидных состоит в образовании четвертичной структуры, напоминающей кросс-β-структуру, при отсутствии изменений во вторичной структуре. Высказаны предположения об изменениях в структуре титина, происходящих при формировании амилоидо-подобных агрегатов. Результаты рентгеноструктурного изучения агрегатов титина позволяют предположить, что β-участки в агрегатах располагаются не перпендикулярно оси фибриллы, как у других амилоидных белков, а параллельно. При этом расстояние между β-листами может варьировать, а сами β-листы не ориентированы строго по одной из осей, что может приводить к появлению диффузного кольцевого рефлекса ~8–12 Å. В связи с этим агрегаты титина следует называть не амилоидными, а амилоидо-подобными с четвертичной структурой, напоминающей кросс-β. Нельзя исключить, что формирование подобной четвертичной структуры может происходить и за счет частичного разворачивания доменов титина с последующим взаимодействием открытых β-стрендов между соседними доменами и/или доменами соседних молекул белка.

Ключевые слова: титин, амилоидо-подобные агрегаты, функциональные амилоиды, рентгеновская дифракция, кросс-β структура

ВВЕДЕНИЕ

Известно, что формирование пространственной структуры белков имеет важное значение для выполнения ими своей функции и, следовательно, для нормальной жизнедеятельности клетки [1, 2]. Белки с двумя или более доменами распространены у высших организмов, они составляют до 70% всех белков эукариотических клеток. При этом белки с повторяющимися доменами составляют около 20% протеома многоклеточных организмов [3, 4]. Однако из-за сходства аминокислотных последовательностей соседних доменов, имеющих одинаковую структуру, например, β-складчатость, многодоменные белки чаще подвержены неправильному сворачиванию (misfolding/мисфолдингу) [5]. Накопление подобных форм белков или их агрегатов может приводить к нарушению жизнедеятельности и гибели клеток. Неправильное сворачивание белков и дальнейшая их агрегация – хорошо известный патологический процесс, который ассоциирован с такими заболеваниями, как амилоидозы [6, 7]. К наиболее известным заболеваниям, связанным с амилоидной агрегацией белков, относятся амилоидозы почек, печени, селезенки, болезни Альцгеймера и Паркинсона, сахарный диабет типа II, прионные заболевания, а также системные амилоидозы [8–11].

Нами изучены амилоидные свойства мультидоменного мышечного белка титина (тайтина/коннектина). Молекулярные массы изоформ титина в гладких и поперечно-полосатых мышцах составляют 500–3800 кДа [12, 13]. В саркомерах поперечно-полосатых мышц титин взаимодействует как с миозиновыми (толстыми), так и с актиновыми (тонкими) нитями (рис. 1). Его молекулы длиной около 1 мкм и диаметром 3–4 нм перекрывают половину саркомера от М-зоны до Z-диска, формируя третий тип нитей, получивших название эластичных. Локализация титина в гладких мышцах не установлена. Титин – самый большой из известных мультидоменных белков. Наиболее высокомолекулярная изоформа титина, синтезируемая в саркомерах скелетных мышц, содержит 283 домена, бóльшая часть которых (до 90%) представлена повторяющимися иммуноглобулин-подобными (Ig) и фибронектин III-подобными (FnIII) доменами с β-складчатой структурой [14, 15].

Рис. 1.

Схематическое строение саркомера поперечно-полосатых мышц. а – Локализация титина внутри саркомера (показана зеленым цветом). б – Внутренняя структура титина на примере трех доменов белка (двух иммуноглобулин-подобных и одного фибронектин III-подобного), расположенных в А-диске саркомера. Источник: https://www.uniprot.org/uniprot/Q8WZ42.

Проведенные нами ранее исследования показали, что титин (м.м. 500 кДа) гладких мышц формирует in vitro амилоидные агрегаты [16, 17], которые оказывают токсическое действие на культуру гладкомышечных клеток [16]. Обнаружено также, что гладкомышечный титин способен формировать амилоидные агрегаты двух типов, которые имеют четвертичную кросс-β-структуру, но отличаются способностью связываться с красителем тиофлавином Т [17]. При этом у амилоидных агрегатов одного типа, имеющих низкую способность к связыванию с тиофлавином Т, обнаружена способность к дезагрегации. Методами кругового дихроизма не выявлено изменений во вторичной структуре гладкомышечного титина при формировании агрегатов указанного типа. Ранее [16, 17] мы утверждали, что титин формирует именно амилоидные агрегаты со свойственной им четвертичной кросс-β-структурой. Однако на сегодняшний день мы можем сказать, что это не совсем верное утверждение.

В данной работе мы предприняли попытку объяснить, почему агрегаты титина не являются амилоидными в классическом понимании этого термина. Предпосылкой к подобным рассуждениям стали результаты, полученные при исследовании структуры агрегатов титина методом рентгеновской дифракции.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Выделение титина из гладких мышц. Титин (м.м. 500 кДа) выделяли из гладких мышц желудка курицы согласно [18] с модификациями. Мышцы желудка гомогенизировали в 3–5-кратном (по отношению к массе мышц) объеме раствора, содержащего 50 мM KCl, 2 мM MgCl2, 1 мM EDTA, 1 мM EGTA, 10 мM имидазола, pH 7.0. Для уменьшения деградации белка в процессе выделения в раствор добавляли набор ингибиторов протеаз: 0.2 мM фенилметансульфонилфторид, 0.5 мM дитиотреитол (DTT), 0.05 мM леупептин. Гомогенат мышц центрифугировали в течение 10 мин при 5000 g. Супернатант удаляли, а процедуру промывки повторяли 3–5 раз. К промытому осадку добавляли трехкратный объем экстрагирующего раствора, содержащего 0.6 M KCl, 2 мM MgCl2, 1 мM EDTA, 1 мM EGTA, 0.5 мM DTT, 0.2 мM фенилметансульфонилфторид, 10 мM имидазол, pH 7.0, а также 0.05 мM леупептин. Экстракцию проводили при 4°С в течение 60 мин при непрерывном перемешивании. Экстракт осветляли в течение 60 мин при 15 000 g, супернатант разбавляли в 2.5 раза охлажденной бидистиллированной водой для преципитации актомиозина (конечная ионная сила ~0.2). Через 1 ч супернатант осветляли в течение 90 мин при 20 000 g. Для осаждения титина супернатант разбавляли в 4 раза охлажденной бидистиллированной водой (конечная ионная сила ~0.05). Через 60 мин осадок, содержащий преимущественно титин, собирали центрифугированием в течение 60 мин при 15 000 g. Осадок растворяли в небольшом объеме (не более 0.5 мл) колоночного буферного раствора, содержащего 0.6 M KCl, 30 мM KH2PO4, 0.5 мM DTT, 0.1 M NaN3, pH 7.0, и осветляли в течение 10 мин при 20 000 g. Титин очищали методом гель-фильтрации на колонке с носителем Sepharose-CL2B, уравновешенным в этом же буфере.

ДСН-гель-электрофорез и Вестерн-блотинг. Чистоту выделенного титина проверяли с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях (ДСН-ПААГ) по методу [19] с нашими модификациями. В частности, мы использовали разделяющий гель с 7%-ным содержанием полиакриламида, приготовленный согласно [19]. Концентрирующий гель содержал 4% ПААГ и был приготовлен согласно [20]. Вестерн-блотинг гладкомышечного титина проводили по [21] с модификациями, описанными в работе [16]. В частности, перенос белков из геля на PVDF-мембраны проводили в течение 24 ч. Использовали антитела 9D10 (моноклональные антитела на PEVK-область титина). В качестве вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой хрена, использовали антитела против IgG мышей (“Sigma”, США).

Электронная микроскопия и условия формирования амилоидных агрегатов. Агрегаты гладкомышечного титина формировали диализом в течение 3 и 24 ч при 4°С против раствора, содержащего 0.15 М глицин-КОН, рН 7.0–7.5, или раствора, содержащего 0.2 М KCl, 10 мМ имидазола, pH 7.0. Каплю суспензии белка в концентрации 0.1 мг/мл наносили на покрытую углеродом пленку коллодия на медной сетке и окрашивали 2%-ным водным раствором уранилацетата. Образцы исследовали на электронном микроскопе JEM-100B (Япония).

Рентгеновская дифракция. Каплю концентрированного (~10 мг/мл) препарата белка в буферном растворе 0.15 М глицин-КОН, рН 7.0–7.5 или 0.2 М KCl, 10 мМ имидазол, pH 7.0 помещали между двух стеклянных палочек, покрытых парафином и находящихся на расстоянии 3–5 мм. При высыхании капли белок предположительно ориентировался в одном направлении, вытягиваясь между двумя стеклянными палочками и превращаясь в тонкую нить. Буферные растворы помещали в специальные стеклянные капилляры “для рентгеновской дифракции”. После чего образцы высушивали с образованием бесцветных кристаллов, которые и использовали для получения дифракционных данных. Дифракционные изображения получали, используя генератор Microstar X-ray с оптикой HELIOX, оснащенный Platinun135 CCD detector (X8 Proteum system, Bruker AXS). Использовали CuKα-излучение с λ = 1.54 Å (1 Å = 0.1 нм). Образцы располагали под прямым углом к рентгеновскому лучу с применением четырехосного каппа-гониометра.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Электронно-микроскопическое исследование агрегации титина

В настоящей работе методом электронной микроскопии показано, что титин формирует крупные аморфные агрегаты уже через 3 ч после начала диализа в двух разных растворах (рис. 2а, б). Учитывая относительно мягкие условия агрегации (нейтральные значения pH, ионная сила, близкая к физиологической, температура 4°С), подобная скорость агрегации белка является достаточно высокой. Эти результаты согласуются с данными, полученными нами ранее [17]. Однако следует отметить, что на электронных микрофотографиях мы наблюдали не только аморфные агрегаты, но и олигомеры (промежуточные формы агрегатов) размером 100 нм и менее (рис. 2в, г), которых не было среди аморфных агрегатов титина, сформированных в течение 24 ч [17]. Присутствие олигомерной фракции среди молекулярной формы белка было обнаружено нами ранее методом динамического светорассеяния [16, 17]. Однако тогда мы не обратили на это внимания и приняли олигомеры за возможную примесь. Новые электронно-микроскопические данные указывают на присутствие олигомеров титина на более ранних сроках его агрегации. Мы полагаем, что совокупность полученных нами данных может объяснить высокую скорость агрегации титина. Известно, что присутствие олигомеров в препарате белка значительно ускоряет его агрегацию [22]. Учитывая полученные нами результаты, можно предположить, что высокая скорость агрегации титина обусловлена присутствием его олигомеров на начальных стадиях агрегации.

Рис. 2.

Электронные микрофотографии аморфных агрегатов титина (а, б) и олигомеров титина (в, г), сформированных в течение 3 ч при 4°C в растворе 0.15 М глицин-KOH, pH 7.0 (а, в) и 0.2 М KCl, 10 мМ имидазола, pH 7.0 (б, г). Для окрашивания использовали 2%-ный водный раствор уранилацетата. Шкала 500 и 100 нм.

Итак, нами показано, что титин имеет достаточно высокую скорость агрегации. При этом необходимо обратить внимание на то, что условия агрегации титина in vitro близки к физиологическим, что отличает его от других амилоидных белков. По условиям агрегации, скорости и обратимости [17] этого процесса агрегаты титина, на наш взгляд, схожи с функциональными амилоидами. И теперь следует обсудить особенности изменения структуры титина при его агрегации.

Исследование структуры агрегатов титина методом рентгеновской дифракции

Известно, что основное свойство всех амилоидных агрегатов – это наличие четвертичной кросс-β-структуры с отдельными слоями, ориентированными параллельно главной оси роста фибрилл [23, 24] (рис. 3а). Подобную структуру обнаруживают методом рентгеновской дифракции. На препаратах частично выровненных амилоидных фибрилл дифракция рентгеновских лучей дает характерную картину, которая состоит из двух дифракционных рефлексов, расположенных на взаимно перпендикулярных осях [25–28]. Первый тип дифракционных рефлексов, расположенных вертикально на дифракционной картине (меридиональное направление), соответствует периоду 4.7–4.8 Å. Этот период указывает на то, что полипептидные цепи расположены перпендикулярно оси фибриллы, и расстояние между ними соответствует 4.7–4.8 Å. Второй тип дифракционных рефлексов, расположенных по горизонтали дифракционной картины (экваториальное направление), соответствует периоду 10–11 Å. Данные рефлексы указывают на то, что полипептидные цепи организованы в β-листы, которые находятся на расстоянии 10–11 Å друг от друга [29, 30] (рис. 3а). Основное влияние на предложенную модель организации амилоидных фибрилл из β-листов оказали начатые в 30-е годы XX века исследования по рентгеноструктурному анализу ряда фибриллярных белков (фиброина, β-кератина, β-миозина, фибрина), а также фибрилл из глобулярного денатурированного белка альбумина [26, 31]. Получены сходные картины дифракции рентгеновских лучей. С помощью рентгеновской дифракции выявлены два экваториальных рефлекса 9.8 Å (“side-chain spacing”) и 4.65 Å (“backbone spacing”), характерных для фибриллярных и глобулярных денатурированных белков, а расстояние 3.4 Å отражало среднюю длину аминокислотного остатка в направлении главной цепи. До появления термина кросс-β-структура существовало понятие “pleated sheet” (“складчатый лист”) и “rippled sheet” (“рифленый лист”). В таких терминах описывали конфигурацию полипептидных цепей [31].

Рис. 3.

Исследование амилоидной кросс-β-структуры методом рассеяния рентгеновских лучей на частично ориентированных препаратах известных амилоидных белков (а) и амилоидных агрегатов гладкомышечного титина (б). Для амилоидных фибрилл известных белков рефлексы, расположенные по вертикали (меридиональное направление), соответствуют периоду 4.7–4.8 Å. Этот период указывает на то, что β-участки расположены перпендикулярно оси фибриллы, и расстояние между ними соответствует 4.7–4.8 Å. Рефлексы, расположенные по горизонтали дифракционной картины (экваториальное направление), соответствуют периоду 10–11 Å. Данные рефлексы указывают на расстояние между β-листами, которое равно 10–11 Å. Для амилоидных агрегатов титина характерна дифракционная картина с экваториальным расположением рефлекса 4.8 Å, вследствие чего мы делаем предположение о параллельной ориентации β-участков относительно оси фибриллы (в нашем случае к фибриллам мы относим отдельные молекулы титина). Рефлекс ~8–12 Å, характеризующий расстояние между β-листами, является диффузным и кольцевым. Мы предполагаем, что Ig- и FnIII-подобные домены, состоящие из двух антипараллельных β-листов, находятся под разными углами к рентгеновскому пучку, что и отображается диффузным рефлексом на дифракционной картине.

В случае менее ориентированных фибрилл оба типа рефлексов размываются и отображаются на дифракционной картинке в виде кольца [32]. Поэтому при исследовании амилоидных структур методом рентгеновской дифракции проводят специальную подготовку образца, позволяющую получить хорошо ориентированные фибриллы. В нашем исследовании структуры агрегатов титина методом рентгеновской дифракции применяли именно такую технику приготовления образца. В частности, каплю концентрированного препарата белка в буферном растворе помещали между двух стеклянных палочек, покрытых парафином и находящихся на расстоянии 3–5 мм. При высыхании капли белок ориентировался в одном направлении, вытягиваясь между двумя стеклянными палочками, превращаясь в тонкую нить. Подобная техника приготовления образца описана в работе [32]. Далее образец помещали в пучок рентгеновских лучей.

В табл. 1 (строки Б и Г) приведены полученные нами дифракционные рефлексы агрегатов гладкомышечного титина, сформированных в двух растворах: 0.2 М KCl, 10 мМ имидазол, pH 7.0 (Б) и 0.15 М глицин-KOH, pH 7.0 (Г). Как видно, оба типа агрегатов титина имеют схожую дифракционную картину с основными рефлексами (~8–12 и ~4.8 Å). Подобные рефлексы позволяют сделать вывод о том, что образцы титина имеют четвертичную кросс-β-структуру и являются амилоидными. Подобное заключение сделано нами ранее [17]. Однако мы столкнулись с рядом особенностей и трудностей интерпретации полученных результатов, ставших причиной некоторых дискуссионных моментов, о которых речь пойдет далее.

Таблица 1.  

Данные, полученные методом рентгеновской дифракции

Строка Дифракционная картина Кристаллы образца Состав образца Рефлексы
А Буферный раствор, содержащий 0.2 М KCl, 10 мМ имидазола 2.8; 3.2; 3.4; 3.7; 3.8, 3.9; 4.1; 4.4; 5.8; 6.3; 8.2 Å
Б Гладкомышечный титин (м.м. 500 кДа) в агрегированной форме в 0.2 М KCl, 10 мМ имидазоле (агрегация 24 ч) [17] 2.2; 2.4; 2.9;3.1; 3.7; 3.8; 4.3; 4.6; 4.8; 8.2–12.7 Å
В Буферный раствор, содержащий
0.15 М глицин-KOH 		Область диффузии
~3.7 Å
Г Гладкомышечный титин (м.м. 500 кДа) в агрегированной форме в 0.15 М глицин-KOH (агрегация 24 ч) [17] 2.2; 2.4; 2.5; 2.6; 2.8; 3.1; 3.7; 4.5; 4.8; 8.2–11.7 Å

Помимо указанных рефлексов обнаружены и другие (табл. 1 Б и Г), которые не удалось идентифицировать, т.е. определить, каким структурным элементам в агрегатах титина они соответствуют. Возможно, появление дополнительных рефлексов обусловлено присутствием примесей в виде кристаллов солей и других компонентов буферных растворов, от которых нам не удалось до конца избавиться на этапе приготовления препарата. Возникло сомнение в принадлежности основных рефлексов (~8–12 Å и ~4.8 Å) к исследуемому белку. Поэтому мы провели дополнительные исследования образцов буферных растворов методом рентгеновской дифракции.

В табл. 1 (строки А и В) приведены данные рентгеновской дифракции буферных растворов, использованных для агрегации титина. Как видно, компоненты буферного раствора (0.2 М KCl, 10 мМ имидазол, pH 7.0) тоже имеют рефлексы, из которых только 3.7 Å и 3.8 Å совпадают с рефлексами образца белка (табл. 1 А, Б). В буферном растворе глицина не обнаружено рефлексов, выявлена лишь область диффузии с центром ~3.7 Å (табл. 1 В). Другие рефлексы (кроме 3.7–3.8 Å) на картинах рентгеновской дифракции титина и буферных растворов не совпадают. Область диффузии с центром ~3.7 Å в образце с буферным раствором, содержащим 0.15 М глицин-KOH, может, вероятно, соответствовать расстоянию между атомами Сα в транс-конформации С–N-связи самого глицина. Таким образом, наше предположение о том, что дополнительные рефлексы (помимо ~8–12 Å и ~4.8 Å) на картинах рентгеновской дифракции титина обусловлены присутствием в образце примесей в виде кристаллов солей и других компонентов буферных растворов, не подтвердилось. Анализируя полученные результаты, стоит также отметить следующее. Известно, что рефлексы 9.47, 4.76 и 2.38 Å могут быть первым, вторым и четвертым порядками рефлекса 9.47 Å соответственно [33]. Рефлекс 2.4 Å, наблюдаемый на наших картинах рентгеновской дифракции титина, может соответствовать четвертому порядку указанного рефлекса (табл. 1 Б, Г). Также известно, что рефлекс 3.7 Å (табл. 1 Б, Г) соответствует парафину, с помощью которого крепится образец [34].

Другое наше затруднение было связано с интерпретацией основных “амилоидных” рефлексов на дифракционной диаграмме агрегатов титина. При вертикальной ориентации в пространстве образца с титином первый дифракционный рефлекс у обоих образцов (4.8 Å) располагался не по вертикали дифракционной картины (меридиональное направление), а по горизонтали (экваториальное направление) (рис. 3б, табл. 1 Б, Г). Исходя из этого, мы предположили, что β-участки в агрегатах титина располагаются не перпендикулярно оси фибриллы, как у других амилоидных белков (рис. 3а), а параллельно (рис. 3б). Второй рефлекс (~8–12 Å), характеризующий расстояние между β-листами, был диффузным и кольцевым (рис. 3б, табл. 1 Б, Г). Мы предполагаем, что расстояние между β-листами может варьировать, а сами β-листы не ориентированы строго по одной из осей (рис. 3б). Здесь следует отметить, что мы не встречали описания случаев, когда один из рефлексов, известных для кросс-β-структуры, кольцевой, а второй нет. Считается, что такое невозможно именно в случае кросс-β-структуры. Существует вероятность, что указанный диффузный рефлекс агрегированного белка может отображать не только расстояние между β-листами. Однако, что именно отображает этот рефлекс, мы пока не знаем. Полученные данные указывают на уникальность и сложность объекта нашего исследования – гигантского белка титина.

Известно, что Ig- и FnIII-подобные домены титина представляют собой β-сэндвич-домены, которые имеют два противоположных антипараллельных β-листа [35, 36]. Можно предположить, что в препаратах титина домены расположены под разными углами к рентгеновскому пучку, что приводит к появлению диффузного рефлекса на дифракционной картине (рис. 3б). Схематично представленные на рис. 3 структуры показывают лишь ориентацию листов и полипептидных цепей в них согласно полученной дифракционной картине. Реальная структура внутри агрегатов титина может быть иной. Одна из возможных структур титина при его агрегации описана в работе [37]. При исследовании неправильного сворачивания двух Ig-подобных (Ig27 и Ig28) доменов титина in vitro методом молекулярной динамики описаны группы конформаций, получившие название “внутримолекулярный амилоид”. Исходя из полученных нами данных, можно сделать вывод, что агрегированный титин имеет лишь близкую к кросс-β четвертичную структуру, а если учитывать данные кругового дихроизма об отсутствии изменений во вторичной структуре титина при его агрегации [16], то можно предположить, что в его агрегатах представлены лишь участки кросс-β-структуры. В связи с этим, агрегаты титина следует называть амилоидо-подобными, а не амилоидными.

Рассуждая о возможном механизме формирования амилоидо-подобных агрегатов титина с четвертичной структурой, напоминающей кросс-β, необходимо отметить следующее. Поскольку вторичная структура агрегированного титина не изменяется [16], то можно предположить, что формирование четвертичной структуры, напоминающей кросс-β, при его агрегации также может происходить за счет частичного разворачивания его доменов с последующим взаимодействием открытых β-стрендов между соседними доменами и/или доменами соседних молекул белка. Подобные изменения не кажутся маловероятными, учитывая данные, описывающие значения силы, необходимой для разворачивания доменов титина. В частности, методом атомно-силовой микроскопии показано, что разворачивание доменов Ig/FnIII титина скелетных мышц происходит при относительно невысоких значениях силы (примерно 30–150 pN) [15, 38, 39]. На интактных миофибриллах, выделенных из скелетных мышц, показано, что частичное разворачивание отдельных Ig-доменов титина в I-зоне саркомера происходит при значении силы около 10 pN [40, 41]. Таким образом, опубликованные данные свидетельствуют, что для разворачивания доменов титина как in situ, так и in vitro требуются относительно небольшие затраты энергии. Высказано предположение, что в работающей мышце происходит разворачивание доменов титина [40, 41]. Возможно, с подобным явлением мы столкнулись в наших in vitro экспериментах при изучении агрегации этого белка. Мы предполагаем, что при агрегации происходит взаимодействие отдельных молекул титина, в результате которого боковые полипептидные цепи отдельных частично развернутых доменов взаимодействуют друг с другом, формируя участки, имеющие амилоидо-подобную структуру. При этом сам белок в агрегатах сохраняет большую часть вторичной структуры. Вероятно, это необходимо для того, чтобы была возможность вернуться в исходное состояние. Подтверждением могут служить наши результаты, свидетельствующие о дезагрегации титиновых агрегатов, сформированных в растворе, содержащем KCl [17]. Возможно, что такая амилоидо-подобная обратимая агрегация титина играет некую роль в клетке. Полное разворачивание доменов титина как in vivo, так и in vitro маловероятно из-за наличия S-S-связей, а, следовательно, маловероятно и формирование амилоидных агрегатов этого белка в клетке.

Итак, результаты наших рентгеноструктурных исследований агрегатов титина позволяют сделать предположение, что β-участки в агрегатах этого белка располагаются не перпендикулярно оси фибриллы, как у других амилоидных белков, а параллельно. При этом расстояние между β-листами может варьировать, а сами β-листы не являются строго ориентированными по одной из осей, что может приводить к появлению диффузного кольцевого рефлекса ~8–12 Å. Поэтому агрегаты титина следует называть не амилоидными, а амилоидо-подобными, с четвертичной структурой, напоминающей кросс-β. Нельзя исключить, что формирование подобной четвертичной структуры может происходить и за счет частичного разворачивания доменов титина с последующим взаимодействием открытых β-стрендов между соседними доменами и/или доменами соседних молекул белка. Полученные результаты расширяют фундаментальные представления о белковой агрегации в широком понимании этого процесса и открывают перспективы изучения возможной функциональной роли агрегации амилоидо-подобного типа in vivo.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (№ 18-04-00125, № 19-34-90054 “Аспиранты”) и гранта Российского научного фонда (№ 19-74-10051 для Якуповой Э.И. (исполнитель)) с использованием оборудования Регионального Пущинского центра коллективного пользования “Структурно-функциональные исследования биосистем” Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН и Сектора электронной микроскопии ЦКП ПНЦБИ РАН.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с использованием животных в качестве объектов.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Список литературы

  1. Tsytlonok M., Craig P.O., Sivertsson E., Serquera D., Perrett S., Best R.B., Wolynes P.G., Itzhaki L.S. (2013) Complex energy landscape of a giant repeat protein. Structure. 21(11), 1954–1965. https://doi.org/10.1016/j.str.2013.08.028

  2. Tian P., Best R.B. (2016) Best structural determinants of misfolding in multidomain proteins. PLOS Comput. Biol. 12(5), e1004933. https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1004933

  3. Apic G., Gough J., Teichmann S.A. (2001) Domain combinations in archaeal, eubacterial and eukaryotic proteomes. J. Mol. Biol. 310(2), 311–325. https://doi.org/10.1006/jmbi.2001.4776

  4. Ekman D., Björklund A.K., Frey-Skött J., Elofsson A. (2005) Multi-domain proteins in the three kingdoms of life: orphan domains and other unassigned regions. J. Mol. Biol. 348(1), 231–243. https://doi.org/10.1016/j.jmb

  5. Han J.H., Batey S., Nickson A.A., Teichmann S.A., Clarke J. (2007) The folding and evolution of multidomain proteins. J. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8(4), 319–330. https://doi.org/10.1038/nrm2144

  6. Dobson C.M. (2003) Protein folding and misfolding. Nature. 426(6968), 884–890. https://doi.org/10.1038/nature02261

  7. Rousseau F., Schymkowitz J., Itzhaki L.S. (2012) Implications of 3D domain swapping for protein folding, misfolding and function. Adv. Exp. Med. Biol. 747, 137–152. https://doi.org/10.1007/978-1-4614-3229-6_9

  8. Knowles T.P., Vendruscolo M., Dobson C.M. (2014) The amyloid state and its association with protein misfolding diseases. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15(6), 384–396. https://doi.org/10.1038/nrm3810

  9. Dobson C.M. (2004) Experimental investigation of protein folding and misfolding. Methods. 34(1), 4–14. https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2004.03.002

  10. Buxbaum J.N., Linke R.P. (2000) A molecular history of the amyloidosis. J. Mol. Biol. 421(2–3), 142–159. https://doi.org/10.1016/j.jmb.2012.01.024

  11. Dobson C.M. (2004) Principles of protein folding, misfolding and aggregation. Semin. Cell Dev. Biol. 15(1), 3–16. https://doi.org/10.1016/j.semcdb.2003.12.008

  12. Freundt J.K., Linke W.A. (2019) Titin as a force-generating muscle protein under regulatory control. J. Appl. Physiol. 126(5), 1474–1482. https://doi.org/10.1152/japplphysiol.00865.2018

  13. Vikhlyantsev I.M., Podlubnaya Z.A. (2017) Nuances of electrophoresis study of titin/connectin. Biophys. Rev. 9(3), 189–199. https://doi.org/10.1007/s12551-017-0266-6

  14. Gregorio C.C., Granzier H., Sorimachi H., Labeit S. (1999) Muscle assembly: a titanic achievement? Curr. Opin. Cell Biol. 11(1), 18–25. https://doi.org/10.1016/s0955-0674(99)80003-9

  15. Giganti D., Yan K., Badilla C.L., Fernandez J.M., Alegre-Cebollada J. (2018) Disulfide isomerization reactions in titin immunoglobulin domains enable a mode of protein elasticity. Nat. Commun. 9(1), 185. https://doi.org/10.1038/s41467-017-02528-7

  16. Bobylev A.G., Galzitskaya O.V., Fadeev R.S., Boby-leva L.G., Yurshenas D.A., Molochkov N.V., Dovidchenko N.V., Selivanova O.M., Penkov N.V., Podlubnaya Z.A., Vikhlyantsev I.M. (2016) Smooth muscle titin forms in vitro amyloid aggregates. Biosci. Repts. 36(3), pii: e00334. https://doi.org/10.1042/BSR20160066

  17. Yakupova E.I., Vikhlyantsev I.M., Bobyleva L.G., Penkov N.V., Timchenko A.A., Timchenko M.A., Enin G.A., Khutzian S.S., Selivanova O.M., Bobylev A.G. (2018) Different amyloid aggregation of smooth muscles titin in vitro. J. Biomol. Struct. Dyn. 36(9), 2237–2248. https://doi.org/10.1080/07391102.2017.1348988

  18. Kim K., Keller T.C. 3rd (2002) Smitin, a novel smooth muscle titin-like protein, interacts with myosin filaments in vivo and in vitro. J. Cell. Biol. 156(1), 101–112. https://doi.org/10.1083/jcb.200107037

  19. Fritz J.D., Swartz D.R., Greaser M.L. (1989). Factors affecting polyacryamide gel electrophoresis and electroblotting of high-molecular-weight myofibrillar proteins. Anal. Biochem. 180(2), 205–210. https://doi.org/10.1016/0003-2697(89)90116-4

  20. Laemmli U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227(5259), 680–685. https://doi.org/10.1038/227680a0

  21. Towbin H., Staehelin T., Gordon J. (1989) Immunoblotting in the clinical laboratory. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 27(8), 495–501.

  22. Kumar S., Walter J. (2011) Phosphorylation of amyloid beta (Aβ) peptides – a trigger for formation of toxic aggregates in Alzheimer’s disease. Aging. 3(8), 803–812 https://doi.org/10.18632/aging.100362

  23. Sunde M., Serpell L.C., Bartlam M., Fraser P.E., Pepys M.B., Blake C.C. (1997) Common core structure of amyloid fibrils by synchrotron X-ray diffraction. J. Mol. Biol. 273(3), 729–739. https://doi.org/10.1006/jmbi.1997.1348

  24. Nelson R., Eisenberg D. (2006) Recent atomic models of amyloid fibril structure. Curr. Opin. Struct. Biol. 16(2), 260–265. https://doi.org/10.1016/j.sbi.2006.03.007

  25. Makin O.S., Serpell L.C. (2005) Structures for amyloid fibrils. FEBS J. 272(23), 5950–5961. https://doi.org/10.1111/j.1742-4658.2005.05025.x

  26. Astbury W.T., Dickinson S., Bailey K. (1935) The X-ray diffraction interpretation of denaturation and the structure of seed globulins. Biochem. J. 29(10), 2351–2360. https://doi.org/10.1042/bj0292351

  27. Eanes E.D., Glenner G.G. (1968) X-ray diffraction studies on amyloid filaments. J. Histochem. Cytochem. 16(11), 673–677. https://doi.org/10.1177/16.11.673

  28. Jahn T.R., Makin O.S., Morris K.L., Marshall K.E., Tian P., Sikorski P., Serpell L.C. (2010) The common architecture of cross-beta amyloid. J. Mol. Biol. 395(4), 717–727. https://doi.org/10.1016/j.jmb.2009.09.039

  29. Eisenberg D., Jucker M. (2012) The amyloid state of proteins in human diseases. Cell. 148(6), 1188–1203. https://doi.org/10.1016/j.cell.2012.02.022

  30. Wille H., Bian W., McDonald M., Kendall A., Colby D.W., Bloch L., Ollesch J., Borovinskiy A.L., Cohen F.E., Prusiner S.B., Stubbs G. (2009) Natural and synthetic prion structure from X-ray fiber diffraction. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106(40), 16990–16995. https://doi.org/10.1073/pnas.0909006106

  31. Pauling L., Corey R. (1953) Two rippled-sheet configurations of polypeptide chains, and a note about the pleated sheets. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 39(4), 253–256. https://doi.org/10.1073/pnas.39.4.253

  32. Morris K.L., Serpell L.C. (2012) X-ray fibre diffraction studies of amyloid fibrils. Methods Mol. Biol. 849, 121–135. https://doi.org/10.1007/978-1-61779-551-0_9

  33. Inouye H., Fraser P., Kirchner D. (1993) Structure of beta-crystallite assemblies formed by Alzheimer beta-amyloid protein analogues: analysis by X-ray diffraction. Biophys. J. 64(2), 502–519. https://doi.org/10.1016/S0006-3495(93)81393-6

  34. Selivanova O.M., Grigorashvili E.I., Suvorina M.Y., Dzhus U.F., Nikulin A.D., Marchenkov V.V., Surin A.K., Galzitskaya O.V. (2016) X-ray diffraction and electron microscopy data for amyloid formation of Aβ40 and Aβ42. Data Brief. 8, 108–113. https://doi.org/10.1016/j.dib.2016.05.020

  35. Clarke J., Cota E., Fowler S.B., Hamill S.J. (1999) Folding studies of immunoglobulin-like beta-sandwich proteins suggest that they share a common folding pathway. Structure. 7(9), 1145–1153 https://doi.org/10.1016/s0969-2126(99)80181-6

  36. Erickson H.P. (1994) Reversible unfolding of fibronectin type III and immunoglobulin domains provides the structural basis for stretch and elasticity of titin and fibronectin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91(21), 10114–10118. https://doi.org/10.1073/pnas.91.21.10114

  37. Borgia A., Kemplen K.R., Borgia M.B., Soranno A., Shammas S., Wunderlich B., Nettels D., Best R.B., Clarke J., Schuler B. (2015) Transient misfolding dominates multidomain protein folding. Nat. Commun. 6, 8861. https://doi.org/10.1038/ncomms9861

  38. Bianco P., Martonfalvi Z., Naftz K., Koszegi D., Kellermayer M. (2015) Titin domains progressively unfolded by force are homogenously distributed along the molecule. Biophys. J. 109(2), 340–345. https://doi.org/10.1016/j.bpj.2015.06.002

  39. Martonfalvi Z., Bianco P., Naftz K., Ferenczy G.G., Kellermayer M. (2017) Force generation by titin folding. Protein Sci. 26(7), 1380–1390. https://doi.org/10.1002/pro.3117

  40. Rivas-Pardo J.A., Eckels E.C., Popa I., Kosuri P., Linke W.A., Ferna’ndez J.M. (2016) Work done by titin protein folding assists muscle contraction. Cell Reports. 14(6), 1339–1347. https://doi.org/10.1016/j.celrep.2016.01.025

  41. Eckels E.C., Haldar Sh., Tapia-Rojo R., Rivas-Pardo J.A., Ferna’ndez J.M. (2019) The mechanical power of titin folding. Cell Reports. 27(6), 1836–1847. https://doi.org/10.1016/j.celrep.2019.04.046

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Молекулярная биология

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал