Молекулярная биология, 2020, T. 54, № 4, стр. 688-698

ВВЕДЕНИЕ

Основным критерием, определяющим необходимость выявления генеративного аллеля BRCA1/2 (gBRCA) и проведения генетического консультирования, является наследственная предрасположенность к развитию опухолей молочной железы и/или яичников. За последнее десятилетие многочисленные клинические исследования показали, что пациентки с высокозлокачественным серозным раком яичников (HGSOC) и патогенными вариантами gBRCA чувствительны к ингибиторам поли(АDP-рибозa)-полимеразы (PARPi) и химиотерапии препаратами на основе платины, что повышает общую выживаемость [1]. Кроме того, ингибиторы PARP эффективны у пациенток с BRCA-специфическими патогенными вариантами в опухолевой ДНК [2, 3]. Тестирование BRCA в фиксированных формалином образцах, заключенных в парафин, или в образцах замороженной ткани позволяет оценивать одновременно как соматические, так и наследственные изменения в структуре гена, и имеет большое диагностическое и клиническое значение при HGSOC. В настоящее время во многих лабораториях, где для тестирования gBRCA применяют технологии секвенирования нового поколения (NGS), внедрен анализ BRCA в тканях опухолей (tBRCA) [4].

В генах BRCA обнаружены вариации числа копий (CNV), известные также как крупные геномные перестройки (LGR), включающие делеции, дупликации или вставки размером более 1000 т.п.н. В популяциях с сильным эффектом основателя частота CNV значительно варьирует (от менее 1 до более 24%) [5]. В гене BRCA1 LGR встречаются чаще, вероятно, из-за более высокой частоты Alu-элементов и/или из-за событий гомологичной рекомбинации между BRCA1 и его псевдогеном [6]. Следовательно, LGR составляют значительную часть патогенных вариантов BRCA, и их исследование включено в молекулярный анализ BRCA. Методы лабораторной диагностики LGR BRCA включают Саузерн-блотинг, количественную ПЦР, конкурентный анализ кривых плавления с высоким разрешением, анализ на ДНК-микрочипах и мультиплексную амплификацию лигированных зондов (MLPA) [7–11]. На сегодняшний день NGS применяют для выявления структурных изменений ДНК, поскольку генерирование миллионов одинаковых последовательностей геномных областей-мишеней в сочетании с соответствующими биоинформатическими инструментами и количественным анализом чтений (ридов) секвенирования может использоваться для оценки и прогнозирования наследственных LGR (gLGR) [12–14].

Тем не менее, обнаружение LGR в целевых генах, основанное на данных NGS и наиболее часто используемое в диагностических протоколах, остается несовершенным, главным образом, в силу того, что все методики обнаружения LGR в данных целевого секвенирования базируются на подходе, основанном на глубине покрытия. Этот подход предполагает, что количество целевых прочтений коррелирует, как правило, с количеством копий последовательности в соответствующем районе генома. При этом LGR детектируют путем расчета покрытия каждого ампликона и обнаружения выбросов. Однако оценка глубины покрытия имеет ряд недостатков, которые искажают покрытие, включая: 1) неравномерную амплификацию; 2) влияние GC-состава 3) неоднозначное картирование коротких фрагментов. Следует отметить, что перед введением в клиническую практику метод обнаружения LGR с помощью NGS должен быть валидирован.

Применение NGS для анализа LGR в опухоли осложняется гетерогенностью опухолевой ткани, загрязнением образца нормальными клетками и низким количеством клеток. Как следствие, некоторые риды, картированные на определенную область, могут не принадлежать опухолевым клеткам, а значения числа прочтений могут не совсем точно отражать CNV в опухолевых клетках, что создает трудности при определении сегментов, содержащих CNV.

Мутационные события в генах BRCA полностью соответствуют модели развития опухоли в рамках теории двойного удара Кнудсона. Соответственно, потеря немутантного аллеля локуса BRCA1 или BRCA2, называемая локус-специфической потерей гетерозиготности, обычно встречается в опухолях с мутациями в BRCA [15, 16]. Фактически, в первичной опухоли наследственные патогенные варианты могут появляться при инактивации обоих аллелей, вызывая нестабильность генома и нарушение роста [17]. Это относится и к патогенным gLGR, особенно к LGR, возникновение которых обусловлено делециями экзонов в BRCA.

Нами оптимизирован и валидирован протокол тестирования gBRCA, который включает набор Devyser BRCA NGS (“Devyser”, Швеция) для подготовки библиотеки ДНК, технологию Illumina MiSeq (“Illumina, США) для NGS и программное обеспечение Amplicon Suite (“SmartSeq”, Италия) для анализа данных. Подготовка библиотеки ДНК для секвенирования включала использование метода целевого обогащения, позволяющего получать перекрывающиеся ампликоны и обеспечивающего полное и равномерное покрытие всех экзонов и экзон-интронных соединений генов BRCA, что позволяет получить более высокое покрытие инсерций/делеций и провести точный анализ CNV. Нами показано, что эта методика позволяет со 100%-ной чувствительностью и специфичностью выявлять gCNV, она удовлетворяет клиническую потребность в обнаружении всех патогенных вариантов BRCA, включая LGR [11, 12].

В нашей работе оценена возможность использования разработанной методики NGS/BRCA для выявления семи различных gLGR BRCA1 в постоперационных образцах тканей HGSOC.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Выбор и подготовка образцов. Всего были отобраны семь пациентов с HGSOC с CNV BRCA1, ранее идентифицированными в образцах крови с помощью NGS и подтвержденными методом MLPA. От каждого пациента с помощью диагностической биопсии на первых стадиях заболевания или при проведении циторедуктивной хирургии получены образцы ткани, которые сразу же заморозили и проанализировали методом NGTS. Образцы ДНК выделяли из периферической крови и из срезов замороженной ткани HGSOC (содержание неопластических клеток не менее 70%) с использованием автоматического устройства MagCore HF16 Plus (“Diatech Lab Line”, Италия) в соответствии с руководством производителя. Концентрацию и качество дцДНК определяли с помощью высокочувствительного анализа с использованием флуориметра Qubit (“Thermo Fisher Scientific”, США). Каждый образец ДНК удовлетворял следующим требованиям: отношение OD_260/280 ≥ 1.7, концентрация ≥15 нг/мкл, отсутствие деградации по данным электрофореза в агарозном геле. Образцы ДНК хранили при –20°C. Все пациенты подписали информированное согласие на тестирование BRCA в образцах крови и опухолевой ткани в соответствии с принципами Хельсинкской декларации.

Анализ BRCA. BRCA анализировали с использованием набора Devyser BRCA (“Devyser”), как сообщалось ранее [18]. Реакции секвенирования проводили с использованием набора реагентов V2, 500 Cycles и системы Illumina MiSeq (“Illumina”). Результаты NGS интерпретировали при помощи программного обеспечения Amplicon Suite (SmartSeq s.r.l., Италия).

Анализ MLPA и номенклатура CNV BRCA1. Анализ MLPA проводили в соответствии с рекомендациями производителя (MRC-Holland, Нидерланды) с использованием наборов SALSA P002 BRCA1 и SALSA P045 BRCA2 MLPA. CNV BRCA1 называли в соответствии с требованиями руководства Human Genome Variation Society (http://www.HGVS.org/varnomen) для CNV (табл. 1). В качестве референсных последовательностей BRCA1 и BRCA2 использовали NG_005905.2, NM_007294.3 и NG_012772.3, NM_000059.3 соответственно.

Определение CNV BRCA1 с помощью NGS. CNV идентифицировали по данным секвенирования Illumina путем загрузки файлов FASTQ в программное обеспечение Amplicon Suite. Это программное обеспечение обнаруживает CNV на основе покрытия в определенных целевых областях, соответствующих каждому сегменту BRCA, после дизайна амплификации. Amplicon Suite Software использует собственный алгоритм для обнаружения ампликонов, покрытых несколькими прочтениями со значительными отличиями от ожидаемых значений. Тот же алгоритм использовали для каждого экзона с последующим объединением данных для всех перекрывающихся ампликонов. При таком подходе эффект от одного экзона минимизируется и не влияет на обнаружение CNV, если покрытие одного ампликона изменено из-за затрудненного отжига.

Соотношение, вычисленное по данным NGTS 100 образцов замороженной ткани с нормальным gCNV, составило 0.6–1.3. Этот диапазон соответствует части нормальной вариации. Как следствие, целевые области с такими соотношениями не считались делетированными или дублированными, что позволило избежать ложноположительных результатов из-за возможной нестабильности генома в образцах опухоли. Делеции BRCA1 идентифицировали только при средних соотношениях менее 0.6. Наконец, образцы опухолей с целевыми областями и средним соотношением 0.4 или менее считали гомозиготными делециями, возникающими в результате гетерозиготной герминальной делеции с потерей гетерозиготности другого аллеля. Для точной идентификации CNV анализировали не менее шести образцов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Чтобы обеспечить высокую точность определения CNV BRCA1, мы удостоверились в том, что все образцы, использованные нами, соответствовали техническим характеристикам с высоким средним показателем качества прочтения (показатель Q > 35) и минимальным покрытием 2000 прочтений на ампликон. Соответствие этим требованиям оценивали с помощью калькулятора покрытия последовательности (https://devyser.com/resources/tools/calculator/), который использовали при планировании каждого секвенирования. В частности, калькулятор покрытия использовали для оптимизации глубины прочтения каждого образца и емкости проточной ячейки для определения оптимальной глубины прочтения на основе количества образцов.

В образцах ткани больных HGSOC, полученных путем диагностической биопсии на начальных стадиях опухолевого процесса или при циторедуктивной хирургии, замороженных и проанализированных с помощью NGTS, выявлены семь различных gLGR BRCA1, идентифицированных ранее с помощью NGS и подтвержденных методом MLPA. Пять из этих LGR идентифицированы абсолютно однозначно, что указывает на потерю гетерозиготности de novo в опухоли. На рис. 1 приведены результаты нормирования данных определения CNV в экзонах BRCA1 с помощью программы Amplicon Suite в соответствии со ссылкой NM_007300.4. Данные визуализации CNV во всех ампликонах BRCA1, покрываемых набором Devyser, приведены в Приложении (рисунок).

Рис. 1.

Рис. 1.

Продолжение.

Рис. 1.

Продолжение.

Рис. 1.

CNV гена BRCA1 в образцах крови и опухолевой ткани семи пациенток с HGSOC, выявленные методом NGS. A1 (кровь) – A2 (ткань) экзоны 1–2; B1 (кровь) – B2 (ткань) экзоны 1–11; C1 (кровь) – C2 (ткань) экзон 14; D1 (кровь) – D2 (ткань) экзоны 15–16; E1 (кровь) – E2 (ткань) экзоны 17–18; F1 (кровь) – F2 (ткань) экзон 19; G1 (кровь) – G2 (ткань): экзоны 20–21. Показаны результаты выявления CNV генов BRCA1/2 полученные методом NGS и программного обеспечения Amplicon Suite. CNV в гене BRCA1 обнаружены в образцах крови и опухолевой ткани. Программное обеспечение Amplicon Suite нормирует данные CNV в экзонах BRCA1 по референсной последовательности NM_007300.4. CNV считали делецией только при среднем соотношении менее 0.6. Образцы опухолей с областями-мишенями со средним соотношением 0.4 или менее считали гомозиготной делецией (0 копий гена) в результате наследственной делеции одного аллеля с потерей гетерозиготности другого. Согласно этим критериям, в образцах B, C, D, E и F возможна потеря гетерозиготности.

В гене BRCA1 выявлены следующие патогенные делеции (gLGR): делеции экзонов 1–2, 1–11, 14, 15–16, 17–18, 19 и 20–21.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В нашей работе показаны возможности выявления делеций экзонов в гене BRCA1 в опухолевых тканях методами целевого обогащения и NGS. Проанализированы образцы, полученные от семи пациенток с HGSOC, у которых LGR в гене BRCA1 были обнаружены ранее и подтверждены методами NGS и MLPA. Замороженные образцы первичных опухолей проанализированы нами методом NGTS. Этот метод обеспечил детекцию gLGR BRCA1 во всех использованных образцах опухолевой ткани. Уменьшение глубины покрытия отдельных экзонов приблизительно вдвое предполагает существование гетерозиготных экзонных делеций. Кроме того, в пяти образцах выявлена потеря гетерозиготности, что указывает на гомозиготную экзонную делецию и на высокую эффективность идентификации LGR с помощью NGTS, поскольку патогенный gLGR ведет себя, как и любой патогенный вариант BRCA. Следует отметить, что для получения столь хороших результатов необходима точная оценка качества образцов ДНК.

NGS BRCA-кодирующих локусов широко используется в клинической практике. Этот метод стал обычным средством молекулярного анализа при определении стратегии персонализированной терапии рака яичников и молочной железы [19, 20]. Около двух третей патогенных вариантов BRCA, выявляемых при раке яичников, относятся к наследственным. В одной трети случаев патогенные варианты встречаются исключительно в опухолевой ткани [21, 22]. Как следствие, сравнение соматических и наследственных изменений структуры tBRCA, выявляемых методом NGS в образцах, полученных при диагностической биопсии или на ранних стадиях опухолевого процесса, или при циторедуктивной хирургии и в образцах нормальной ткани приобретает диагностическое значение. Однако LGR в BRCA, даже если они составляют значительную долю от общего количества патогенных вариантов в образцах опухоли, редко учитываются из-за несовершенства методики.

Все протоколы определения LGR с помощью NGS основаны на использовании глубины покрытия, критерия, действительно важного для определения LGR [12, 23]. Секвенирование на основе NGS–CNV имеет ряд преимуществ перед секвенированием по Сэнгеру и MLPA. Наиболее очевидно, что для полного скрининга генов BRCA необходим один метод, который позволит анализировать одновременно однонуклеотидные полиморфизмы/инсерции, делеции и CNV. В течение последних 15 лет золотым стандартом идентификации всех клинически значимых патогенных вариантов BRCA считалось секвенирование по Сэнгеру и MLPA [24]. Однако эти дорогостоящие, пошаговые и трудоемкие технологии постепенно были заменены NGS, методом, имеющим более высокую пропускную способность и масштабируемость, более короткое время проведения анализа, а также более дешевым в пересчете на образец. Также стоит упомянуть, что NGS требует меньшего количества ДНК (30–50 нг), чем секвенирование по Сэнгеру или MLPA. Более того, определение LGR с использованием прочтений, полученных с помощью NGS, позволяет избежать ложноположительных результатов из-за мутаций в сайте гибридизации праймеров MLPA [23]. Даже в том случае, когда мутации и/или полиморфизмы приводят к ошибкам при отжиге праймеров, потенциально вызывая изменения покрытия конкретного ампликона, маловероятно, что весь экзон будет покрыт одним ампликоном NGS, минимизируя таким образом эффекты полиморфизма нуклеотидов на уровне экзона, и способствуя сохранению точности обнаружения CNV [11, 12].

Для анализа структуры BRCA и обнаружения CNV стратегия NGS с использованием метода целевого обогащения превосходит NGS на основе мультиплексной ПЦР, при которой возможно выпадение ампликонов, что создает недостаточное покрытие области и приводит к отсутствию гомогенности нормированного покрытия в целевых регионах. Таким образом, использование стратегии мультиплексной ПЦР, которая способна охватить целевые области с помощью максимального количества ампликонов, имеет первостепенное значение. Набор Devyser, используемый в этом исследовании, охватывает 188 ампликонов со средней длиной прочтения 196 п.н. (диапазон от 120 до 278 п.н.). Более того, он создает библиотеки секвенирования полных генов BRCA в одной пробирке, обеспечивая полное перекрывание ампликонов в каждой таргетной области [24]. Оценка определения LGR BRCA с помощью набора Devyser показала лишь немного более низкую точность в случае ампликонов экзона 2 BRCA1, что свидетельствует о наличии сложной области и, следовательно, о склонности к ложноположительным результатам определения CNV [25].

Основанное на NGS определение CNV позволяет точно анализировать аллели в герминальных/диплоидных клетках, но имеет ограничения при анализе гетерогенных соматических образцов. Связанная с этим биоинформатическая проблема остается открытой. Фактически, контаминация нормальными клетками, плоидность опухолевых клеток и гетерогенность опухоли искажают взаимосвязь между количеством прочтений и наличием CNV. Не все прочтения, сопоставленные с определенной областью, относятся к опухолевым клеткам. В результате количества прочтений могут не коррелировать с наличием CNV в опухоли, что затрудняет определение CNV и приводит к ложноположительным результатам. Однако, даже если CNV, обнаруженные в образцах опухоли, действительно оказываются ложноположительными, то анализ крови пациентов позволит в дальнейшем исключить их наследственное происхождение, ограничивая ложное обнаружение только приобретенными перестройками.

Фиксированные формалином и заключенные в парафин образцы ткани стабильны при комнатной температуре, хорошо хранятся и пригодны для создания больших коллекций образцов. Из-за этого фиксация формалином и заключение в парафин является стандартным методом получения образца ткани, который в дальнейшем можно использовать в молекулярных тестах.

Однако в таких образцах образуются белок-белковые и белково-нуклеиновые сшивки [26, 27], что связано с фиксацией формалином и заключением в парафин [28]. Секвенирование и последующий анализ ДНК, выделенной из заключенных в парафин образцов, представляет серьезную задачу. В этой связи в лабораториях должны независимо тестировать различные протоколы выделения и амплификации ДНК и выбирать метод, наиболее подходящий для данной лаборатории.

Замороженные образцы трудно собирать и транспортировать, дорого хранить. Однако такие образцы содержат минимально поврежденную ДНК, что позволяет получать препараты, сопоставимые по качеству с ДНК, выделенной из крови, что исключено при использовании фиксированных формалином образцов. В ДНК, выделенных из замороженных образцов, ожидаются меньшие колебания покрытия таргетной последовательности, что снижает количество ложноположительных результатов. Исходя из этого, мы предпочитали использовать замороженные образцы для анализа структуры генов. Идентификация LGR BRCA методом NGTS в замороженном опухолевом материале остается сложной задачей, однако мы смогли показать возможность ее решения. Учитывая полученные нами результаты и постоянное совершенствование технологии секвенирования и биоинформатических инструментов, мы подчеркиваем, что NGTS можно рассматривать как эффективную стратегию обнаружения всех патогенных вариантов BRCA. По-видимому, NGTS может стать предпочтительным методом обнаружения как соматических, так и наследственных патогенных вариантов BRCA, включая gLGR.

Мы благодарны Franziska M. Lohmeyer за критические замечания и редактирование текста статьи.

Концепция и дизайн: A. Minucci, C. Marchetti, G. Scambia, A. Fagotti. Сбор данных: осуществлен A. Minucci и G. Mazzuccato, анализ и интерпретация A. Minucci. Написание рукописи – A. Minucci. В окончательном утверждении рукописи участвовали все авторы.

От всех пациентов получено письменное информированное согласие.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.