Молекулярная биология, 2020, T. 54, № 4, стр. 626-633

sFRP1 индуцирует микроРНК, модулирующие сигналы Wnt, в клетках хронического миелоидного лейкоза

M. Pehlivan a*, M. Soyoz bc, B. Cerci bc, H. I. K. Coven bc, Z. Yuce d, H. O. Sercan d

a Vocational School of Health Services, Izmir Katip Celebi University
Izmir, Turkey

b Medical Biology Department, Faculty of Medicine, Izmir Katip Celebi University
Izmir, Turkey

c Tissue Typing Laboratory, Health Science University Tepecik Education and Research Hospital
Izmir, Turkey

d Medical Biology Department, Faculty of Medicine, Dokuz Eylul University
Izmir, Turkey

* E-mail: melek.pehlivan@ikc.edu.tr

Поступила в редакцию 30.12.2019
После доработки 30.12.2019
Принята к публикации 07.02.2020

Полный текст (PDF)

Аннотация

Хронический миелоидный лейкоз – клональное заболевание гемопоэтических стволовых клеток, при котором наблюдается экспансия миелоидных клеток. Хронический миелоидный лейкоз ассоциирован с характерной хромосомной транслокацией (филадельфийской хромосомой), которая приводит к образованию онкогена BCR-ABL. Этот онкоген кодирует тирозинкиназу, участвующую во многих сигнальных путях, включая путь Wnt, играющий уникальную роль в прогрессии хронического миелоидного лейкоза. Активация сигналов Wnt ведет к появлению дополнительной популяции лейкозных стволовых клеток, образующихся из гранулоцитарно-макрофагальных прогениторов. Важную роль в дифференцировке и поддержании гемопоэтических стволовых клеток играет sFRP1, ингибитор Wnt-сигналов. Цель нашей работы состояла в изучении микроРНК, которые действуют на Wnt-сигнализацию при коиндукции с экспрессией sFRP1 в клетках K562. Проведен детальный анализ микроРНК hsa-mir-221-3p, hsa-mir-222-3p, hsa-mir-106b-5p, hsa-let-7f-5p, hsa-mir-182-5p, hsa-mir-191-5p, hsa-mir-183-5p, их генов-мишеней и участия в сигнализации Wnt.

Keywords: chronic myeloid leukemia, secreted Frizzled related protein 1, miRNA

ВВЕДЕНИЕ

Хронический миелоидный лейкоз (ХМЛ) – гемопоэтическое клональное заболевание, при котором наблюдается экспансия миелоидных клеток. ХМЛ составляет примерно 15% всех лейкозов у взрослых и диагностируется при рутинном анализе крови [1]. ХМЛ стал первой формой рака со специфической генетической аномалией – филадельфийской хромосомой (Ph), которая образуется из хромосомы 22 при транслокации между хромосомами 9 и 22. Транслокация ведет к созданию слитого гена BCR-ABL, который состоит из протоонкогена ABL (Abelson) и гена домашнего хозяйства BCR (breakpoint cluster region), локализованных в хромосомах 9 и 22 соответственно. Белковый продукт гена BCR-ABL – конститутивно активная тирозинкиназа, которая активирует/влияет на сигнальные пути, включая MAPK/ERK, JAK/STAT, RAS, PI3K/AKT и WNT, вовлеченные в неконтролируемую пролиферацию клеток и резистентность опухолевых клеток [2]. Нарушение регуляции сигнализации Wnt играет исключительно важную роль в прогрессии ХМЛ. В частности, активация сигналов β-катенина/канонического Wnt в ходе прогрессии ХМЛ ведет к приобретению предшественниками гранулоцитов-макрофагов способности к самообновлению и образованию дополнительных популяций лейкозных стволовых клеток Ph+ [3, 4]

Белки Wnt – это секретируемые гликопротеины, которые служат лигандами рецепторов семейства Frizzled (FZD). Они играют важную роль в выборе судьбы клеток в ходе развития и в поддержании взрослых тканей, участвуя в контроле дифференцировки, пролиферации, миграции клеток и т.д. Разнообразие этих процессов делает сигнальный путь Wnt существенным для клеток [5]. Активация канонического пути Wnt предотвращает деградацию β-катенина, отвечает за его стабилизацию и транслокацию в ядро, что приводит к экспрессии генов-мишеней, таких как ген циклина D и c-myc, через действие Т-клеточного фактора/лимфоидного энхансер-связывающего фактора [6]. Активация неканонических путей Wnt не зависит от β-катенина. К настоящему времени идентифицированы 11 неканонических путей, из которых наиболее изучены Wnt/Ca2+ и путь полярности планарных клеток [7].

Аномальная активация Wnt-сигнализации выявлена при многих формах рака, включая лейкозы [8]. Первым описанным злокачественным заболеванием крови с нарушением Wnt-сигнализации был ХМЛ [3]. Мутации β-катенина и других членов сигнального каскада WNT, таких как Axin-2 и APC, часто наблюдаются в солидных опухолях, но редко встречаются при лейкозах и ХМЛ [9]. Эпигенетический сайленсинг ингибиторов Wnt считается механизмом, характерным для многих видов рака, который приводит к аберрантной Wnt-сигнализации [10]. В число внутриклеточных и секретируемых ингибиторов Wnt-сигнализации входят ингибирующий Wnt фактор 1 (WIF-1), секретируемые белки, родственные Frizzled (sFRP), белки Dickkopf (Dkks), Cerberus, Wise/SOST и белок 4, связывающий инсулиноподобный фактор роста (IGFBP-4). Семейство трансмембранных ингибиторов Wnt состоит из четырех членов – APCDD1 (adenomatosis polyposis coli down-regulated 1), активируемого Wnt ингибиторного фактора 1 (Waif1/5T4), Shisa и Tiki. Белки Dkk и sFRP изучены наиболее хорошо. Метилирование промоторов генов этих белков, приводящее к снижению их уровня, обнаружено во многих опухолях [11].

sFRP участвует преимущественно в дифференцировке гемопоэтических клеток-предшественников и в поддержании популяции гемопоэтических стволовых клеток. Эти ингибиторы могут регулировать и канонические, и неканонические сигнальные пути Wnt [12]. Нокаут sFRP1 у мышей проявляется нарушением самообновления гемопоэтических стволовых клеток и утратой ими состояния покоя в ходе патогенеза гемопоэтических новообразований [13]. При остром лимфобластном лейкозе уровень метилирования промотора sFRP1 достигает 51% [14], тогда как при хроническом лимфобластном лейкозе он равен 100% [15]. Метилирование промотора гена sFRP1 ассоциировано также с прогрессией ХМЛ [16]. Большинство исследований эпигенетического сайленсинга sFRP фокусировалось на метилировании промотора и модификации гистонов, тогда как изучению регуляции с участием микроРНК уделялось меньше внимания.

МикроРНК – некодирующие оцРНК длиной примерно 20–25 н. Эти РНК функционируют на уровне регуляции трансляции путем связывания с 3'-нетранслируемой областью мРНК гена-мишени, что сильно влияет на такие процессы, как развитие, дифференцировка, апоптоз, пролиферация и гемопоэз [17, 18]. Показано, что изменения профиля микроРНК ассоциированы с патогенезом рака [17], они выявлены при нескольких формах рака крови, включая острый лимфобластный лейкоз, острый миелоидный лейкоз и ХМЛ [1]. Возможность использования микроРНК для разработки новых терапевтических стратегий при разных видах рака, включая ХМЛ, представляет большой интерес [17].

В настоящей работе для идентификации микроРНК и генов-мишеней Wnt-сигналов, индуцируемых вместе с экспрессией sFRP1, использовали микрочипы, которые применяли и ранее для изучения регуляции опухолевых/лейкозных стволовых клеток человека.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Клеточные линии и условия культивирования. Линия клеток K562 – BCR/ABL-позитивная линия ХМЛ, получена из DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Германия). Клетки К562 выращивали на среде RPMI1640 с 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (FBS), 2 мМ L-глутамина, 1 мкг/мл пенициллина/стрептомицина и инкубировали при 37°C и 5% CO2. Клетки K562 не экспрессируют sFRP1 [16]. Стабильную линию K562s, экспрессирующую sFRP1, получали из клеток K562 и поддерживали на среде, содержащей 0.8 мг/мл неомицина, в течение 30 дней, затем культивировали на среде RPMI 1640, содержащей 10% FBS. Клонирование и стабильная трансфекция вектором, кодирующим sFRP1, для получения линии клеток K562s подробно описаны ранее [19].

Вылеление суммарной РНК и синтез кДНК для анализа профиля экспрессии микроРНК. Суммарную РНК для анализа микроРНК выделяли из клеток K562 и K562s, используя набор miRCURY™ (“Exiqon”, США). кДНК синтезировали, используя miRCURY™ Universal RT microRNA PCR Universal cDNA synthesis Kit II (“Exiqon”), в соответствии с инструкциями производителя. Качество выделения РНК, синтеза кДНК и ПЦР проверяли с помощью UniSp6 RNA Spike-in и пары праймеров из поставляемого набора.

С целью определения экспрессии мРНК генов-мишеней суммарную РНК выделяли из клеток K562 и K562s с помощью RNeasy® Mini kit (“Qiagen”, ФРГ) протокола, поставляемого производителем. Качество РНК оценивали, исходя из соотношения OD260/OD280. кДНК синтезировали с помощью Qiagen RT2 First Strand kit (“Qiagen”).

ОТ-ПЦР в реальном времени для анализа экспрессии микроРНК. Экспрессию микроРНК анализировали с использованием Exiqon Pick-&-Mix microRNA PCR Panel и подобранного набора из 84 микроРНК. Этот набор включает 84 микроРНК, используемых для анализа экспрессии (см. Приложение), 84 набора LNA-праймеров (Locked Nucleic Acid) для амплификации микроРНК, ассоциированных с раковыми/лейкозными стволовыми клетками, три набора праймеров для амплификации потенциальных референсных генов (U6snRNA, SNORD38B, SNORD49A), пять наборов контрольных праймеров RNA spike-in, три межпланшетных калибратора. Количественную ПЦР в реальном времени (ОТ-кПЦР) проводили в реакционной смеси miRCURY LNA™ RT microRNA PCR ExiLENT SYBR® Green master mix (“Exiqon”) в приборе CFX96-RT PCR (“Bio-Rad”, США). Условия ПЦР были следующими: 95°C, 10 мин, затем 40 циклов – 95°C, 10 с; 60°C, 1 мин – амплификация; затем 95°C, 10 c; 65°C, 2 c и 95°C, 5 c – диссоциация. Значения Ct трех повторов усредняли и нормировали на значения референсных генов. Результаты анализа экспрессии микроРНК обрабатывали, используя RT2 Profiler PCR Array Data Analysis (центр анализа данных “Qiagen”). микроРНК со значениями Ct выше 35 считали недетектируемыми. Предсказанные мишени микроРНК анализировали с помощью программы TarBase v.8 (http://www.microrna.gr/tarbase). miRDB (http://mirdb.org/miRDB/) и Тargetscan (http://www.targetscan.org).

Уровни экспрессии предсказанных генов-мишеней оценивали с помощью RT2 SYBR Green qPCR (“Qiagen”) и системы LightCycler 96 (“Roche Diagnostic”, Германия). Все реакции проводили в 20 мкл реакционной смеси, используя кДНК, синтезированные с помощью обратной транскрипции на РНК клеток K562 и K562s. Ген β-актина использовали в качестве эндогенного контроля и референсного гена для нормирования результатов. Условия ПЦР были следующими: 10 мин при 95°C (преинкубация), затем 40 циклов – 95°C, 15 c, 60°C, 1 мин и 72°C, 10 c. Кривые плавления каждого образца анализировали с использованием LightCycler Software версия 4.0.0.23 (“Roche Diagnostics”). Значения Ct анализировали методом 2−ΔΔCt с помощью RT2 Profiler PCR Array Data Analysis, (“Qiagen”). Гены с значениями Ct более 35 исключали из анализа, который проводили в трех повторностях.

Выделение белка и вестерн-блот-анализ. sFRP1 – секретируемый белок. Кондиционированную среду от стабильно трансфицированных клеток K562s собирали и концентрировали. Вестерн-блотинг проводили, используя антитела против sFRP1 (1/1000; “R&D Systems”, США). Для анализа других белков получали лизаты целых клеток K562 и K562s в буфере PYLB [19]. Концентрацию суммарного белка определяли методом Брэдфорда (“Applichem”, ФРГ). Белки клеточных экстрактов разделяли в 10%-ном полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия и переносили на поливинилидендифторидные мембраны (PVDF); блоки-ровали буфером TBS с 0.1% Tween 20 и 5%-ным обезжиренным сухим молоком при комнатной температуре в течение 1 ч. Блотинг, отмывку и визуализацию проводили, как описано ранее [19]. Белковые полосы анализировали, используя программу ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/).

Экспрессия белков sFRP1 и β-катенина в клетках K562/K562s. Ранее мы показали, что sFRP1, экспрессируемый в стабильной линии клеток K562s, обладает функциональной активностью [19]. Для подтверждения экспрессии и функциональности sFRP1 в клетках K562s получали кондиционированную среду клеток K562 и K562s. Клетки инкубировали в течение 72 ч в бессывороточной среде и центрифугировали при 1500 об./мин. Супернатант собирали в пробирки Millipore Microcon YM-30, среду концентрировали согласно инструкциям производителя. Вестерн-блотинг концентрированной среды от обеих клеточных линий проводили с антителами против sFRP1 (“R&D Systems”). Уровни белка β-катенина (которые косвенно отражают активность Wnt-сигнализации) оценивали в обеих линиях клеток методом вестерн-блотинга β-катенина (“BD Biosciences”, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

sFRP1 экспрессируется и обладает функциональной активностью в стабильно трансфицированных клеточных линиях

Линию клеток K562, продуцирующую sFRP1, получили путем стабильной трансфекции клеток K562 вектором экспрессии sFRP1/pcDNA3.1 [19]. Экспрессию белка sFRP1 подтвердили вестерн-блотингом кондиционированной среды клеток K562s (рис. 1). Кроме того, методом вестерн-блотинга показано существенное снижение экспрессии β-катенина клетками K562s по сравнению с исходными клетками. Уровень β-катенина рассчитывали по данным денситометрического анализа полос, нормированным по уровню β-актина. Оба опыта подтвердили, что sFRP1 экспрессируется и функционально активен в клетках K562s (рис. 2).

Рис. 1.

Вестерн-блотинг белка sFRP1, экспрессируемого клетками K562 и стабильно трансфицированными клетками K562s. Использовали первичные антитела к sFRP1 (1/1000; R&D, AF1384).

Рис. 2.

Снижение уровня β-катенина в клетках K562s. Вестерн-блотинг и денситометрическое определение β-катенина в клетках K562 и K562s. Использовали первичные антитела к β-актину (1/1000; “Cell Signaling Technology”, США; 12620S), β-катенину (1/1000; “BD Biosciences”, США, 610153).

Профили экспрессии микроРНК

Уровни экспрессии 84 микроРНК определили в клетках K562 и K562s с использованием Exiqon Pick-&-Mix microRNA PCR Panel with custom selection of LNA microRNA PCR и сравнили их с помощью ПЦР (см. Приложение). Уровни экспрессии 57 микроРНК в двух линиях клеток были одинаковыми. В клетках К562s экспрессия 20 микроРНК была ниже, а семи выше, чем в клетках K562 (табл. 1). Наиболее сильно изменялись уровни hsa-mir-221-3p и hsa-mir-222-3p. В клетках K562s они возросли в 25 и 7 раз по сравнению с клетками K562.

Таблица 1.  

Изменения экспрессии микроРНК в клетках K562s

микроРНК с повышенной экспрессией Кратность изменений
hsa-mir-221-3p 25.84
hsa-mir-222-3p 7.27
hsa-mir-106b-5p 4.58
hsa-let-7f-5p 3.22
hsa-mir-182-5p 2.49
hsa-mir-191-5p 2.37
hsa-mir-183-5p 2.08

Предсказание мишеней и изменение экспрессии генов-мишеней

Возможные мишени идентифицировали с помощью программ TarBase v.8 (http://www.microrna. gr/tarbase), miRDB (http://mirdb.org/miRDB/) и Targetscan (http://www.targetscan.org/). МикроРНК hsa-let-7f-5p, hsa-mir-222-3p, hsa-mir 221-3p, hsa-mir-191-5p, hsa-mir-182-5p, hsa-mir-106b-5p и hsa-mir-183-5p были предсказуемо ассоциированы со многими генами-мишенями, многие из которых являются либо онкогенами, либо генами-супрессорами опухолевого роста, участвующими в пролиферации клеток, апоптозе, трансдукции сигналов и регуляции транскрипции. Мы ограничили анализ мишенями, которые относятся к генам Wnt, Frizzled и LRP5/6 (белок 5/6, родственный рецептору липопротеинов низкой плотности) – основным игрокам в инициации канонических Wnt-сигналов (тaбл. 2).

Экспрессия и hsa-miR-221-3p, и hsa-miR-222-3p была значительно повышена в клетках K562s. Согласно предсказаниям программы TarВase, мишенями hsa-mir-221-3p являются CTNNB1 (β1-катенин), FZD3 и LRP6. Одновременный анализ результатов предсказания генов-мишеней и определения уровней экспрессии показывает, что снижение экспрессии генов CTNNB1, FZD3 и LRP6 в линии клеток K562s происходит при повышении уровня hsa-mir-221-3p. Согласно предсказаниям двух других баз данных, эти гены не являются, однако, генами-мишенями (табл. 3). Интересно, что CTNNB1 служит, по-видимому, также мишенью hsa-miR-222-3p, снижение экспрессии этого гена выявлено клетках K562s (рис. 2).

Таблица 2.  

Гены-мишени, экспрессия которых изменена в клетках K562s

Гены со сниженной экспрессией Изменение экспрессии, кратность
LRP6 0.4613
WNT1 0.9248
WNT2b 0.7306
WNT5A 1.0
WNT7B 0.327
WNT9A 0.9248
FZD2 0.0977
FZD3 0.0024
FZD4 1.01
FZD5 0.3679
FZD6 0.0006
FZD7 0.8263
FZD8 0.3037
Таблица 3.  

Гены-мишени микроРНК, предсказанные TarBase, miRDB и Targetscan

микроРНК TarBase miRDB TargetScan
hsa-mir-221-3p CTNNB1↓
FZD3↓
LRP6↓
   
hsa-mir-222-3p CTNNB1↓    
hsa-mir-183-5p LRP6↓ LRP6↓  
hsa-let-7f-5p FZD2↓
FZD3↓
FZD8↓
FZD3↓
FZD4–
FZD3↓
FZD4–
WNT1– WNT9A–
hsa-mir-106b-5p CTNNB1↓
FZD3↓
FZD5↓
FZD6↓
FZD3↓  
hsa-mir-182-5p CTNNB1↓
FZD3↓
FZD6↓
FZD7–
FZD3↓
WNT5A–
FZD3↓
WNT2b-
hsa-mir-191-5p FZD5↓
FZD7– WNT7B↓
FZD5↓ FZD5↓

Примечание. ↓ – Гены, экспрессия которых снижена в клетках K562s; – уровень экспрессии одинаков в двух клеточных линиях.

Согласно TarBase v.8 и miRDB, мишенью hsa-mir-183-5p служит LRP6. Уровень экспрессии этого гена в клетках K562s ниже, чем в K562.

Cписок мишеней hsa-let-7f-5p включает FZD2, FZD3 и FZD8 (TarBase), уровень экспрессии которых снижен в клетках K562s. По предсказаниям miRDB и Targetscan единственным общим геном-мишенью является FZD3. В дополнение к FZD3 база данных miRDB предсказывает FZD4; и Targetscan предсказали FZD4, WNT1 и WNT9A как потенциальные мишени (табл. 2). Уровни экспрессии FZD4, WNT1 и WNT9A в клеточных линиях K562 и K562s сравнимы, и значимые их изменения не выявлены.

Согласно TarBase, CTNNB1, FZD3, FZD5 и FZD6 служат мишенями hsa-mir-106b-5p. Уровни экспрессии этих генов в клетках K562s ниже, чем в K562. miRDB идентифицирует FZD3 как ген-мишень, тогда как ни один из этих генов не предсказывается в качестве мишени hsa-mir-106b-5p базой данных Targetscan. Экспрессия hsa-miR-182-5p в клетках K562s возрастает по сравнению с K562. FZD3, CTNNB1, FZD7 и FZD6 предсказываются в качестве мишеней hsa-miR-182-5p базой данных TarBase v.5. Экспрессия FZD3, CTNNB1 и FZD6 в клетках K562s снижена, а экспрессия FZD7 не изменилась. Базы данных miRDB и Targetscan в качестве общей мишени идентифицируют лишь FZD3 (тaбл. 2). Экспрессия двух других генов-мишеней, выявляемых этими базами данных, WNT5A и Wnt 2b, одинакова в обеих линиях клеток.

Уровень экспрессии hsa-mir-191-5p в клетках K562s выше, чем в клетках K562. FZD5 была предсказана тремя базами данных, как общая мишень этой микроРНК. В качестве мишеней hsa-mir-191-5p TarBase идентифицирует также FZD7 и WNT7B. В линии клеток K562s уровни экспрессии FZD5, FZD7 и WNT7B ниже, чем в родительской линии клеток (табл. 2).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Взаимодействия Wnt/FZD связаны с несколькими сигнальными путями. Лиганды Wnt, рецепторы FZD и белок 5/6 (LRP5/6), родственный рецептору липопротеинов низкой плотности, совместно ингибируют опосредованную киназой 3β-гликогенсинтазы (GSK-3β) деградацию β-катенина по каноническому пути с участием “растрепанных” белков. В результате происходит транслокация β-катенина в ядро и транскрипция генов-мишеней. Связываясь с лигандами Wnt и блокируя сигналы Wnt/β-катенина, sFRP1 модулирует трансдукцию Wnt-сигнала. Экспрессия sFRP1 может снижаться или возрастать на разных стадиях развития определенных тканей. Экспрессия sFRP1 изменяется при многих заболеваниях, из которых наиболее изучен рак [20]. Транскрипционная инактивация sFRP1 при различных видах рака согласуется с представлением о sFRP1, как об опухолевом гене-супрессоре.

Низкий уровень экспрессии sFRP1 может быть обусловлен метилированием промотора гена этого белка. sFRP1 действует как антагонист канонического сигнального пути Wnt, он ингибирует пролиферацию лейкозных клеток [21]. Инактивация sFRP1 ведет к сверхэкспрессии генов Wnt и активации Wnt-сигналов при остром лимфобластном лейкозе [22]. Клиническая прогрессия ХМЛ коррелирует с эпигенетическим сайленсингом sFRP1 и активацией Wnt-сигнализации в предшественниках гранулоцитов и макрофагов [3, 16]. Aберрантная сигнализация Wnt в бластной фазе ХМЛ ассоциирована с приобретением стволовыми клетками свойств лейкозных гранулоцитарно-макрофагальных предшественников, что подчеркивает патогенетическую важность экспрессии sFRP1 [23].

В настоящей работе проанализированы дифференциальные паттерны экспрессии микроРНК в линии клеток ХМЛ K562 и в трансфицированных sFRP1 клетках K562s. В клетках K562s, сверхэкспрессирующих sFRP1, обнаружены семь микроРНК с повышенной в 2 раза или более экспрессией (табл. 1). Возможные гены-мишени этих микроРНК анализировали с помощью трех баз данных, TarBase, miRDB и TargetScan, предсказанные гены-мишени валидировали, определяя уровни их экспрессии.

Показано, что уровни hsa-mir-221-3p и hsa-mir-222-3p сильно повышены в клетках K562, экспрессирующих sFRP1 – примерно в 25 и 7 раз соответственно. Эти две микроРНК участвуют в миелоидной дифференцировке и лейкемогенезе [24]. Кроме того, дифференциальная экспрессия этих микроРНК на разных стадиях ХМЛ описана ранее, что свидетельствует об их роли в прогрессии заболевания [18]. Показано, что в клетках К562 экспрессия и mir-221, и mir-222 понижена, тогда как экспрессия одного из генов-мишеней этих РНК – FOXO3 – повышается в ходе эритроидной дифференцировки. Повышена также экспрессия регулятора эритроидной дифференцировки KIT – еще одной мишени этих двух микроРНК [24]. Мы обнаружили, что экспрессия этих микроРНК возрастает после трансфекции sFRP1 в клетки K562s. Это показывает, что экспрессия гена sFRP1 может модулировать эритроидную дифференцировку за счет повышения экспрессии hsa-mir-221 и hsa-mir-222. Кроме того, miR-221 ассоциирована с сигнальными путями β‑катенина и Wnt, что подтверждает наши результаты [25].

Мы ограничились анализом генов Wnt, Frizzled и LRP5/6, главных участников инициации канонической Wnt-сигнализации. Обнаружено, что Frizzled 3 служит мишенью hsa-mir-221-3p, hsa-let-7f-5p, hsa-mir-106b-5p и hsa-mir-182-5p. Экспрессия этих микроРНК активируется в клетках K562s. В соответствии с этим наблюдением уровень экспрессии FZD3 в клетках K562s был ниже, чем в клетках K562. Сверхэкспрессия FZD3 ассоциирована с активацией Wnt-сигнализации и лейкемогенезом. FZD3, как сообщалось, активирован в В-лимфоцитах больных хроническим лимфолейкозом. Кроме того, сверхэкспрессия мРНК FZD3 коррелирует с транскрипционной инактивацией sFRP1 при остром миелолейкозе, остром лимфолейкозе и при миелодиспластическом синдроме. Результаты нашей работы показывают, что ассоциированная с болезнью активация Wnt-сигнализации может быть следствием снижения экспрессии sFRP1 и активации FZD3 [22].

Согласно предсказаниям всех трех баз данных, FZD5 является мишенью hsa-mir-191-5p. FZD5 активно экспрессируется в клетках K562 [26]. Нами показано, что экспрессия FZD5 снижается в клетках K562s, что коррелирует с увеличением экспрессии hsa-mir-191-5p. Показано, что взаимодействие FZD5/Wnt3a зависит от sFRP1. Эктопическая экспрессия FZD5 в L-клетках изменяет ответ на sFRP1 и sFRP2, а также усиливает сигнализацию Wnt3a/β-катенин [27]. Примечательно, что sFRP1 может блокировать сигналы WNT5A, ассоциированные в макрофагах с FZD5 и CaMKII. Воспалительные стимулы активируют сигнализацию WNT5A, а sFRP1 блокирует эту активацию, предотвращая связывание WNT5A с FZD5 [28]. Эти данные подтверждают наши результаты, свидетельствующие о том, что экспрессия sFRP1 изменяет профиль микроРНК, связанных с про-Wnt-сигнализацией в лейкозных клетках.

База данных TarBase предсказывает FZD6 как мишень hsa-mir-106b-5p и hsa-mir-182-5p. Мы обнаружили снижение экспрессии FZD6 в клетках K562s. Сообщалось, что FZD6 ассоциирован как с канонической, так и с неканонической Wnt-сигнализацией [29]. В мышиной модели хронического лимфолейкоза экспрессия FZD6 коррелирует с повышением внутриклеточного уровня β-катенина. FZD6 регулирует также экспансию и выживание гемопоэтических и прогениторных клеток [30]. С другой стороны, база данных TarBase указывает на FZD8, как на мишень hsa-let-7f-5p, и снижение его экспрессии верифицировано. Таргетинг FZD с использованием короткой шпилечной РНК показал, что ингибирование этого гена сенсибилизирует клетки ХМЛ к иматинибу и ведет к снижению активации NFAT [31].

WNT7B активно экспрессируется во многих опухолях, а его экспрессия ассоциирована с рецепторами GPR124, что указывает на участие в инвазии, ангиогенезе и метастазировании опухолевых клеток. WNT7B функционирует и в каноническом, и в неканоническом пути Wnt-сигнализации [32]. Ген WNT7B идентифицирован как один из генов, экспрессия которого сенсибилизирует клетки ХМЛ к иматинибу, а его нокдаун придает клеткам, позитивным по BCR-ABL, устойчивость к иматинибу [33, 34].

Рецептор LRP6, согласно предсказаниям баз данных TarBase и miRDB, служит мишенью hsa-mir-183-5p. Экспрессия LRP6 снижается в клетках K562s, экспрессирующих sFRP1. Рецептор LRP6 может как активировать, так и ингибировать канонический путь Wnt. Трансдукция сигналов канонического Wnt начинается со связывания секретируемых молекул Wnt с рецептором FZD и корецептором LRP6. Связывание рецепторов Wnt с белками Wnt активирует сигнализацию β-катенина и повышает выживаемость стволовых/прогениторных клеток ХМЛ, обработанных ингибитором тирозинкиназ. Блокада LRP6 приводит к снижению Wnt-сигнализации и индукции апоптоза в обработанных иматинибом стволовых/ прогениторных клетках ХМЛ, кокультивируемых с мезенхимальными стромальными клетками. Нами показано, что уровень экспрессии LRP6 снижается в клетках K562s, т.е. sFRP1 ингибирует активацию трансдукции сигналов Wnt в клетках ХМЛ [35].

Нами идентифицированы семь микроРНК, экспрессия которых повышается вместе с экспрессией секретируемого антагониста сигнального пути Wnt/β-катенин sFRP1. Детальное изучение генов-мишеней этих микроРНК позволит более полно понять роль Wnt-сигнализации и определить возможные терапевтические мишени при ХМЛ.

Работа получила поддержку Izmir Katip Celebi University, Scientific Research Projects Coordinatorship [2016-ÖNP-SHMY-0026].

В данной работе не были использованы биологические материалы, полученные от людей.

Aвторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Список литературы

  1. Di Stefano C., Mirone G., Perna S., Marfe G. (2016) The roles of microRNAs in the pathogenesis and drug resistance of chronic myelogenous leukemia. Oncol. Rep. 35, 614–624.

  2. Wang X., Chen K., Guo G., Chen J.L. (2015) Noncoding RNAs and their functional involvement in regulation of chronic myeloid leukemia. Brief. Func. Genomics. 15, 239–248.

  3. Jamieson C.H., Ailles L.E., Dylla S.J., Muijtjens M., Jones C., Zehnder J.L., Gotlib J., Li K., Manz M.G., Keating A., Sawyers C.L., Weissman I.L. (2004) Granulocyte–macrophage progenitors as candidate leukemic stem cells in blast-crisis CML. New Engl. J. Med. 351, 657–667.

  4. Minami Y., Stuart S.A., Ikawa T., Jiang Y., Banno A., Hunton I.C., Young D.J., Naoe T., Murre C., Jamieson C.H.M., Wang J.Y.J. (2008) BCR-ABL-transformed GMP as myeloid leukemic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 17967–17972.

  5. Logan C.Y., Nusse R. (2004) The Wnt signaling pathway in development and disease. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 20, 781–810.

  6. Gao C., Xiao G., Hu J. (2014) Regulation of Wnt/β-catenin signaling by posttranslational modifications. Cell. Biosci. 4, 1–20.

  7. Liu L.J. Xie S.X. Chen Y.T. Xue J.L. Zhang C.J. Zhu F. (2016) Aberrant regulation of Wnt signaling in hepatocellular carcinoma. W. J. Gastroenterol. 22, 7486–7499.

  8. Staal F., Famili F., Garcia Perez L., Pike-Overzet K. (2016) Aberrant Wnt signaling in leukemia. Cancers. 8, 1–15.

  9. Sercan Z., Pehlivan M., Gokturk D., Sercan H.O. (2009) Beta-catenin mutations are not observed in chronic myeloid leukemia. Tumor J. 95, 836–839.

  10. Surana R., Sikka S., Cai W., Shin E.M., Warrier S.R., Tan H.J.G., Arfuso F., Fox S.A., Dharmaraja A.M., Kumar A.P. (2014) Secreted frizzled related proteins: Implications in cancers. Biochim. Biophys. Acta (BBA)-Rev. Cancer. 1845, 53–65.

  11. Cruciat C.M., Niehrs C. (2013) Secreted and transmembrane Wnt inhibitors and activators. Cold Spring Harbor Pers. Biol. 5, a015081.

  12. Cain C.J., Manilay J.O. (2013) Hematopoietic stem cell fate decisions are regulated by Wnt antagonists: comparisons and current controversies. Exp. Hematol. 41, 3–16.

  13. Kühl S.J., Kühl M. (2013) On the role of Wnt/β-catenin signaling in stem cells. Biochim. Biophys. Acta. 1830, 2297–2306.

  14. Dufourcq P., Couffinhal T., Ezan J., Barandon L., Moreau C., Daret D., Duplaa C. (2002) FrzA, a secreted Frizzled related protein, induced angiogenic response. Circulation. 106, 3097–3103.

  15. Zhong X., Desilva T., Lin L., Bodine P., Bhat R.A., Presman E., Pocas J., Stahl M., Kriz R. (2007) Regulation of secreted Frizzled-related protein-1 by heparin. J. Biol. Chem. 282, 20523–20533.

  16. Pehlivan M., Sercan Z., Sercan H.O. (2009) sFRP1 promoter methylation is associated with persistent Philadelphia chromosome in chronic myeloid leukemia. Leukemia Res. 33, 1062–1067.

  17. Poláková K.M., Lopotová T., Klamová H., Burda P., Trněný M., Stopka T., Moravcova J. (2011) Expression patterns of microRNAs associated with CML phases and their disease related targets. Mol. Cancer. 10, 1–13.

  18. Yang Q., Cao W., Wang Z., Zhang B., Liu J. (2018) Regulation of cancer immune escape: The roles of miRNAs in immune checkpoint proteins. Cancer Lett. 431, 73–84.

  19. Pehlivan M., Caliskan C., Yuce Z., Sercan H.O. (2017) Forced expression of Wnt antagonists sFRP1 and WIF1 sensitizes chronic myeloid leukemia cells to tyrosine kinase inhibitors. Tumor Biol. 39, 1–7.

  20. Qu Y., Ray P.S., Li J., Cai Q., Bagaria S.P., Moran C., Sim M.S., Zhang J., Turner R.R., Zhu Z., Cui X., Liu B. (2013) High levels of secreted frizzled-related protein 1 correlate with poor prognosis and promote tumourigenesis in gastric cancer. Eur. J. Cancer. 49, 3718–3728.

  21. Cheng C.K., Li L., Cheng S.H., Ng K., Chan N.P., Ip R.K., Wong R.S., Shing M.M., Li C.K., Ng M.H. (2011) Secreted-frizzled related protein 1 is a transcriptional repression target of the t (8; 21) fusion protein in acute myeloid leukemia. Blood. 118, 6638–6648.

  22. Reins J., Mossner M., Neumann M., Platzbecker U., Schumann C., Thiel E., Hofmann W.K. (2010) Transcriptional down-regulation of the Wnt antagonist SFRP1 in haematopoietic cells of patients with different risk types of MDS. Leukemia Res. 34, 1610–1616.

  23. Ashihara E., Takada T., Maekawa T. (2015) Targeting the canonical Wnt/β-catenin pathway in hematological malignancies. Cancer Sci. 106, 665–671.

  24. Xiong Q., Yang Y., Wang H., Li J., Wang S., Li Y., Yang Y., Cai K., Ruan X., Yan J., Hu S., Fang X. (2014) Characterization of miRNomes in acute and chronic myeloid leukemia cell lines. Genomics Proteomics Bioinformatics. 12, 79–91.

  25. Lupini L., Bassi C., Ferracin M., Bartonicek N., D’Abundo L., Zagatti B., Callegari E., Musa G., Moshiri F., Gramantieri L., Corrales F.J., Enright A., Sabbioni S., Negrini M. (2013) miR-221 affects multiple cancer pathways by modulating the level of hundreds messenger RNAs. Front. Genet. 4, 1–9.

  26. Saitoh T., Hirai M., Katoh M. (2001) Molecular cloning and characterization of human Frizzled-5 gene on chromosome 2q33. 3-q34 region. Internat. J. Oncol. 19, 105–110.

  27. Xavier C.P., Melikova M., Chuman Y., Üren A., Baljinnyam B., Rubin J.S. (2014) Secreted Frizzled-related protein potentiation versus inhibition of Wnt3a/β-catenin signaling. Cell. Signaling. 26, 94–101.

  28. Pereira C., Schaer D.J., Bachli E.B., Kurrer M.O., Schoedon G. (2008) WNT5A/CaMKII signaling contributes to the inflammatory response of macrophages and is a target for the antiinflammatory action of activated protein C and interleukin-10. Arteriosclerosis Thrombosis Vasc. Biol. 28, 504–510.

  29. Corda G., Sala A. (2017) Non-canonical WNT/PCP signalling in cancer: FZD6 takes center stage. Oncogenesis. 6, e364.

  30. Abidin B.M., Kwarteng E.O., Heinonen K.M. (2015) Frizzled-6 regulates hematopoietic stem/progenitor cell survival and self-renewal. J. Immunol. 195, 2168–2176.

  31. Radich J. (2010) A new remedy for blast-crisis CML? Diffusion. 7, 1–13.

  32. Song T., Yang P., Zhou J., Chen Z., Yuan X. (2019) A review of the mechanisms of WNT7B in the process of malignant tumor invasion and metastasis. Intern. J. Pharmacol. 15, 523–532.

  33. Ma L., Shan Y., Bai R., Xue L., Eide C.A., Ou J., Zhu L.J., Hutchinson L., Cerny J., Khoury H.J., Sheng Z., Druker B.J., Li S., Green M. (2014) PKC pathways mediate BCR-ABL-independent imatinib resistance in chronic myeloid leukemia. Blood. 124, 1790.

  34. Ma L., Shan Y., Bai R., Xue L., Eide C.A., Ou J., Zhu L.J., Hutchinson L., Cerny J., Khoury H.J., Sheng Z., Druker B.J., Li S., Green M.R. (2014) A therapeutically targetable mechanism of BCR-ABL-independent imatinib resistance in chronic myeloid leukemia. Sci. Translation Med. 6, 252ra121.

  35. Zhang B., Li M., McDonald T., Holyoake T.L., Moon R.T., Campana D., Shultz L., Bhatia R. (2013) Microenvironmental protection of CML stem and progenitor cells from tyrosine kinase inhibitors through N-cadherin and Wnt–β-catenin signaling. Blood. 121, 1824–1838.

Дополнительные материалы

скачать ESM.docx
Supplement 1: Exiqon Pick-&-Mix microRNA PCR Panel with a custom selection of 84 miRNAs.