Молекулярная биология, 2020, T. 54, № 5, стр. 750-775

МАТРИЧНЫЙ ПРИНЦИП. МАТРИЦЫ ПЕРВОГО И ВТОРОГО РОДА (ЛИНЕЙНЫЕ И ПРОСТРАНСТВЕННЫЕ)

Сегодня матричный принцип – это основная парадигма генетики (и биологии в целом). Матричный принцип находит свое воплощение в центральной догме (ЦД) молекулярной биологии Ф. Крика (рис. 1а) [1, 2]. Ф. Крик писал о переносе генетической информации в клетке (стрелки на рис. 1a, иллюстрирующем ЦД, обозначают разрешенные пути переноса этой информации). Преклоняясь перед гением Крика, стоит, тем не менее, призвать читать смысл, а не только слова. Поток информации осуществляется в действительности и в обратном направлении – от белков к РНК и ДНК. Это – регуляция. А вот копирование носителей информации, осуществляемое посредством матричных процессов (МП), действительно происходит только в соответствии с направлениями, которые указывают стрелки на схеме ЦД. Подробнее о значении и месте ЦД в современной биологии написано в [3–5].

Рис. 1.

Центральная догма молекулярной биологии [1, 2] (а) и соотношение матричных процессов (МП) I-го и II-го рода (б).

Детальное изучение всех трех МП (репликации, транскрипции, трансляции), осуществляющих копирование носителей генетической информации, вскрыло их общие (универсальные) характеристики. Все МП протекают в три этапа – инициация, элонгация (копирование) и терминация. Неотъемлемыми характеристиками МП служат их неоднозначность и репарация, или коррекция, что впервые отметили в 30–40-е годы ХХ в. Н.В. Тимофеев-Ресовский в его принципе “конвариантной редупликации”, предложенном в начале 30-х гг. ХХ в. для описания появления мутаций в ходе воспроизведения генетического материала, и М.Е. Лобашев, связавший понятия “мутация” и “репарация” в своей физиологической гипотезе мутационного процесса [6]. Представления о взаимодополняющих свойствах процесса удвоения генетического материала (неоднозначности и репарации) оформились в заочной дискуссии этих двух ученых [6, 7]. Подробнее об этом можно прочесть в нашей более ранней публикации [8]. Сегодня очевидно, что неоднозначность и коррекция, уровень которых находится под генетическим контролем (т.е. предопределен биологически, подчеркнем это!), свойственны любым МП, не только репликации, но также транскрипции (см., например, [9]) и трансляции [10]. Для транскрипции это показано сравнительно недавно, поскольку мРНК нестабильна, и работать с признаками, характеризующими мРНК, затруднительно. При изучении трансляции еще в 70-е гг. Л. Горини идентифицировал центр рибосомной неоднозначности Ram (Ribosomal ambiguity). Горини писал, что рибосома склонна “подвирать”, а различные внешние воздействия лишь повышают или понижают эту способность рибосомы [11]. Уровень неоднозначности трансляции зависит от активности фактора элогации трансляции EF-Tu (у бактерий) и его ортолога eEF1A (у эукариот), доставляющего аминоацил-тРНК к А-сайту рибосомы и обеспечивающего размещение в А-сайте преимущественно “подходящих” (cognate) аминоацил-тРНК. Чем скорее идет трансляция, тем выше уровень ее неоднозначности [12]. Кроме того, и некоторые аминоацил-тРНК-синтетазы имеют домен коррекции, отслеживающий соответствие тРНК и присоединяемой к ней аминокислоты [10].

Обсуждая неоднозначность МП или их точность, следует говорить не об ошибках МП (это антропоморфизм), а именно о присущем всем МП свойстве неоднозначности, уравновешенном для каждого из МП противоположным свойством – способностью к репарации, или коррекции. Таким образом, конечный уровень точности воспроизведения носителей генетической информации и их экспрессии оптимизирован в эволюции и является результатом взаимодействия неоднозначности и коррекции всех МП. Неслучайно можно получить мутанты как с повышенным, так и с пониженным уровнем неоднозначности любого из трех МП. Отметим, что коррекция происходит не только на стадии элонгации (воспроизведения), но на стадиях инициации и терминации.

Современное прочтение ЦД, описывающей МП I (репликация, транскрипция, трансляция), требует дополнения в виде МП II (рис. 1б) – оперирующих не с линейными, а с пространственными (белковыми) матрицами. В ходе МП II происходит копирование не первичной структуры белков, а их пространственной укладки. Введение понятия МП II связано с открытием белковой наследственности – описанием инфекционных амилоидов, или прионов [13]. Многие белки могут претерпевать конформационные переходы, обогащаясь β-слоями, и формировать амилоидные олигомеры, образование и рост которых происходит за счет взаимодействия между одними и теми же участками белковых молекул, что ведет в дальнейшем к формированию линейных полимеров – амилоидных протофибрилл [14]. Согласно Добсону, такому переходу потенциально могут подвергаться практически любые белки, поскольку почти все они содержат β-слои, которые фланкированы специфическими аминокислотами – так называемыми привратниками (gatekeepers), препятствующими их экспонированию [15]. В живых организмах агрегации большинства белков препятствуют физико-химические условия внутриклеточной и межклеточной среды, взаимодействие белков с функциональными партнерами и специальные системы, защищающие клетки от нежелательных белковых агрегатов (шапероны, системы протеасомной деградации, аутофагии и др.) [16, 17] (рис. 2). С возрастом эффективность работы этих систем снижается, что приводит к повышению вероятности агрегации различных белков [18]. Более подробно структурные особенности белков, способных к амилоидной агрегации, рассмотрены в работах A. Каявы и соавт. [19–22]. Образование патологических амилоидных белковых структур характерно для более чем 40 тяжелых заболеваний человека, в том числе неизлечимых нейродегенеративных болезней Альцгеймера (БА), Паркинсона (БП), Хантингтона (БХ) и др. [23, 24]. Существуют и адаптивные амилоиды, например, прион, ответственный за вегетативную несовместимость у гриба Podospora anserina [25], но это отдельный предмет обсуждения, и о нем см. далее.

Рис. 2.

Схема формирования амилоидных агрегатов из растворимого белка.

Открытым остается вопрос, насколько характеристики МП I можно распространить и на МП II – по-видимому, можно и нужно, но с учетом специфики этих процессов. Известны варианты (или штаммы) прионов дрожжей, стабильно поддерживающиеся и различающиеся по своим биологическим и физико-химическим свойствам. Неоднозначность МП II проявляется, в частности, в том, что по данным Д.А. Бейтмана и Р.Б. Викнера [26] конкретный штамм приона существует в виде “облака вариантов” (неоднозначность), при этом только один из этих вариантов является преобладающим (коррекция). По-видимому, большая роль в этих процессах принадлежит шаперонам, отвечающим за формирование и воспроизведение конформеров белков, образующих амилоиды [27–29].

Сейчас уже очевидно, что МП I и МП II взаимодействуют между собой. Во-первых, отметим, что из 10 известных прионов грибов почти половина – это факторы транскрипции или трансляции (табл. 1). Кроме того, установлено, что при необратимой остановке рибосомы на транслируемой мРНК (например, при отсутствии кодона-терминатора или обрыве мРНК) одним из механизмов, с помощью которых эукариотическая клетка избавляется от синтезированных аберрантных белков и освобождает рибосому, является образование амилоида, направляющего аберрантный белок в протеасому для деградации [30, 31]. На существование взаимодействия МП I и II может указывать как изменение стабильности генома на фоне амилоидизации некоторых белков, так и обратное – изменение эффективности амилоидизации на фоне геномных мутаций. В данном обзоре, освещая современные представления о взаимодействии МП I и МП II, мы провели анализ экспериментальных данных о взаимном влиянии амилоидизации и процессов, контролирующих стабильность генетического материала.

АМИЛОИДЫ И ПРИОНЫ

Амилоиды – белковые фибриллярные агрегаты, обладающие кросс-β-структурой. Само понятие “амилоид” претерпело значительную трансформацию за почти два века с момента первого упоминания. Термин “амилоид” (крахмалоподобный) предложен в 1839 году М. Шлейденом для обозначения скоплений крахмала, в норме присутствующих в клетках растений. Позднее Рудольф Вирхов стал использовать этот термин для описания макроскопических аномалий ткани, которые синели при окрашивании йодом, поэтому он ошибочно полагал, что эти структуры включают в себя крахмалоподобное вещество. В 1859 г. Г.М. Фрейндлих и Ф.А. Кекуле показали, что окрашивающиеся йодом патологические отложения в органах не содержат веществ, сходных с крахмалом или целлюлозой, но имеют в своем составе азот и сходны с белками. Вскоре стало ясно, что амилоидные отложения в основном образованы специфическими белками, а окрашивание йодом объясняется тем, что в отложениях присутствуют протеогликаны и глюкозаминогликаны (по [41]). В конце 19–начале 20-го века методология исследования амилоидов активно развивалась: появились методы гистохимической детекции амилоидов. Структурные и биохимические исследования амилоидов берут свое начало во второй половине 20-го века с появлением методов электронной микроскопии, рентгеновской дифракции и обнаружением важнейшего биохимического свойства амилоидов – нерастворимости в ряде денатурирующих агентов. До недавнего времени амилоидные агрегаты выявляли, как правило, при исследовании различных патологий человека и животных или обнаруживали случайно; при этом не существовало методов целенаправленного систематического выявления белков с амилоидными свойствами. В 2000-х годах появились методы изучения амилоидов in situ – компьютерный анализ, позволяющий предсказывать амилоидные свойства белка, основываясь на его аминокислотной последовательности [21, 42, 43]. И только совсем недавно появились методы выявления амилоидов in vivo в масштабе протеома [44–46].

Согласно современным молекулярно-биологическим представлениям, амилоидные агрегаты – это высокоупорядоченные фибриллярные белковые структуры, состоящие из бета-складчатых слоев, формирующихся за счет образования межмолекулярных водородных связей и расположенных перпендикулярно продольной оси фибриллы. При присоединении к амилоидному олигомеру (матрице II-го рода) новых мономеров белка последние изменяют свою конформацию в соответствии с конформацией мономеров в составе олигомера (рис. 2). Этот процесс при его многократном повторении приводит к образованию протофибрилл, которые затем объединяются в фибриллы и крупные амилоидные агрегаты (рис. 2). Упорядоченность амилоидных агрегатов определяется тем, что межмолекулярные связи возникают между одними и теми же последовательностями взаимодействующих мономеров [20]. Как правило, при переходе в амилоидную конформацию доля β-слоев во вторичной структуре белка резко увеличивается. Например, доля β-слоев в прионной (амилоидной) форме белка PrP млекопитающих (PrP^Sc) составляет около 43%, что примерно в 14 раз больше, чем в мономерной форме PrP^C этого белка (3%). Еще большее содержание β-слоев (54%) характерно для прионной формы фрагмента PrP (27–30), образующего протеазоустойчивое ядро приона [47]. Для амилоидных агрегатов характерна повышенная устойчивость к обработке ионными детергентами (такими, как додецилсульфат натрия (SDS)), протеазами, действию повышенных температур и другим воздействиям (см. [24, 48]).

Следует отметить, что в медицинской литературе до сих пор преобладает несколько отличающаяся трактовка понятия “амилоид”: в соответствии с современной медицинской классификацией амилоидами принято считать лишь межклеточные агрегаты, которые окрашиваются амилоид-специфическими красителями [49, 50]. Амилоидные фибриллы обладают специфической способностью к связыванию некоторых красителей, в частности, анилинового красителя Конго красного (CR – Congo Red). Результатом этого связывания является двойное лучепреломление в поляризованном свете, дающее яблочно-зеленое свечение [51]. Другие специфичные к амилоидным фибриллам красители – флуоресцентные красители тиофлавин-Т и тиофлавин-S. При связывании тиофлавина-Т с амилоидными фибриллами происходит смещение спектра излучения в красную область, а в случае тиофлавина-S усиливается флуоресценция в зеленой области без сдвига спектра [52].

Прионы (от proteinaceous infectious (particles)) – особый класс амилоидов. Главное отличие инфекционных амилоидов (прионов) от неинфекционных заключается в том, что в случае инфекционных амилоидов происходит дробление амилоидных фибрилл с образованием амилоидных олигомеров (так называемых “затравок”, или “семян” приона) (рис. 2), что и обусловливает их способность к стабильному поддержанию приона в ходе клеточных делений и к инфицированию клеток (организмов), не несущих прион. Лучше всего процесс дробления прионных агрегатов исследован у дрожжей-сахаромицетов. Он происходит при участии шаперонов (система Hsp104–Hsp70–Hsp40), при этом главную роль играет дезагрегаза – шаперон Hsp104 [53]. При делеции гена HSP104 большая часть дрожжевых прионов теряет инфекционность и вскоре теряется в ходе митотических делений [53–55]. Некоторые варианты приона [PSI⁺], в отличие от остальных дрожжевых прионов, эффективно элиминируются также при сверхпродукции Hsp104 [54, 56]. В случае неинфекционных амилоидов наблюдаются только образование амилоидных агрегатов de novo и их рост, при этом новые “затравки”, способные осуществлять инфекцию, не образуются.

Впервые прионы были описаны у млекопитающих, в том числе у человека, у которых они вызывают ряд неизлечимых нейродегенеративных заболеваний, способных к передаче от человека к человеку. Инфекционным агентом является особая форма белка PrP – PrP^Sc, характеризующаяся повышенным содержанием бета-структур, устойчивостью к обработке протеиназой К и ионными детергентами [57]. Физиологическая функция белка PrP не установлена. Единственное известное фенотипическое проявление делеции гена этого белка у животных – невосприимчивость к инфицированию прионом. PrP синтезируется во многих клетках, таких как нейроны, клетки гладких мышц кровеносных сосудов, моноциты и лимфоциты, островковые клетки поджелудочной железы, и практически не синтезируется в печени и почках [58]. Прионная конверсия белка PrP является причиной нейродегенерации при болезни куру, связанной с ритуальным каннибализмом [59], болезни Крейтцфельда–Якоба, синдрома Герстмана–Штраусслера–Шейнкера, фатальной семейной бессонницы у людей и сходных заболеваний у млекопитающих – овец, коз, мышей, хомяков, норок и т.д. (по [60]). К этой же группе заболеваний относится “коровье бешенство”, или губчатая энцефалопатия крупного рогатого скота (BSE от Bovine Spongiform Encephalopathy) (по [61]).

Прионы низших эукариот (дрожжей и других грибов) – это нехромосомные наследственные детерминанты белковой природы. Согласно одному из распространенных определений, прионы – это инфекционные изоформы белков, способные к автокаталитическому поддержанию [55, 62]. Следует отметить, что, хотя под данное определение прионов подпадают некоторые неамилоидные наследственные факторы белковой природы [63–65], в основе формирования большинства известных в данный момент прионов высших и низших эукариот лежат процессы амилоидогенеза. В дальнейшем мы будем рассматривать только прионы, имеющие амилоидную природу. Обычно прионными свойствами обладает определенный конформационный вариант нормального клеточного белка в составе амилоидных агрегатов, которые служат конформационными матрицами для присоединения и укладки подобных белков. Один прионогенный белок может образовывать несколько наследуемых конформационных вариантов агрегатов с различными биологическими свойствами, которые называются “прионными штаммами”, или вариантами приона [66–69]. История изучения дрожжевых прионов началась в 1965 году, когда Брайан Кокс открыл нехромосомный наследственный детерминант, названный [PSI⁺], который повышал эффективность прочтения кодонов – терминаторов трансляции в мРНК как значащих (вызывал нонсенс-супрессию или повышал ее эффективность) [34, 70]. Немного позже обнаружили другой нехромосомный наследственный детерминант – [URE3], благодаря которому клетки дрожжей могут поглощать уреидосукцинат из среды, что позволяет мутантам ura2, у которых заблокирован синтез этого интермедиата, расти на среде с уреидосукцинатом [33]. Позже выяснилось, что [URE3] и [PSI⁺] – прионные формы белков Ure2 и Sup35 соответственно [32]. На сегодняшний день известно около 10 прионов дрожжей-сахаромицетов и других низших эукариот (табл. 1).

Прионизация белков может приводить к наследуемому изменению их функциональной активности, которое сопровождается различными фенотипическими проявлениями. Этот феномен получил название “белковая наследственность”, т.е. наследование признаков, определяемых конформацией специфических белков, без изменения нуклеотидной последовательности кодирующих их генов. Здесь важно отметить также, что при переходе белка в амилоидную форму клетка может приобретать фенотип, характерный для мутанта по соответствующему гену [71], однако почти всегда проявление делеции (инактивации) гена и прионизации его продукта не идентичны. В ряде случаев амилоидные агрегаты могут выполнять какие-либо новые функции в клетке, что приводит к появлению нового фенотипа [25, 35, 72–74].

Довольно долгое время работы по изучению амилоидов были связаны с их патологической ролью в организме человека и млекопитающих, однако в последние годы обнаруживается все больше и больше белков, способных к формированию амилоидных фибрилл и не связанных с патологиями, а выполняющих свою функцию в амилоидной форме. Функциональные амилоиды обнаружены почти во всех основных группах организмов. Благодаря своим уникальным характеристикам, таким как высокое сопротивление деформации, эластичность и стабильность при экстремальных условиях, они способны выполнять разнообразные функции. Среди многообразных функций амилоидов и амилоидоподобных белков можно отметить следующие: формирование биопленок у бактерий [75–77], регуляцию биогенеза и структуры клеточной стенки у дрожжей [78–82], участие в контроле оогенеза и сперматогенеза у позвоночных и беспозвоночных [83], регуляцию долговременной памяти [84–86], контроль полимеризации меланина у животных [87] и др. По-видимому, большинство известных функциональных амилоидов представлено структурными белками, амилоидная агрегация которых необходима для биогенеза различных клеточных или внеклеточных структур на определенных стадиях жизненного цикла или в определенных условиях. Вместе с тем, появляющиеся в последние годы данные говорят о том, что функциональные амилоидные агрегаты могут принимать непосредственное участие и в регуляции МП I. Примеры таких функциональных амилоидов представлены в табл. 2.

Имеется несколько примеров РНК-связывающих амилоидных и амилоидоподобных белков, агрегаты и/или олигомеры которых регулируют трансляцию специфических РНК. Так, белок CPEB моллюска Aplysia californica активирует трансляцию мРНК в синапсах нейронов, что может быть одним из механизмов долговременной памяти [84]. Подобной активностью обладают и гомологи CPEB дрозофилы и мыши [85, 86]. Амилоидные агрегаты белка Rim4 S. cerevisiae, появляющиеся в клетке при ее переходе к мейозу, репрессируют трансляцию мРНК гена CLB3, кодирующего циклин, и некоторых других специфических мРНК, что определяет характер расхождения хромосом в первом делении мейоза. При переходе ко 2-му делению мейоза агрегаты Rim4 разбираются [88]. Открытый недавно функциональный амилоид млекопитающих Fxr1 [89] контролирует трансляцию специфических мРНК в мозге млекопитающих [93, 94]. Амилоидоподобные свойства выявлены у ряда транскрипционных факторов A. thaliana, участвующих в регуляции индукции цветения [92, 95]. Число РНК-связывающих белков, обладающих функциональной активностью в амилоидной конформации, может оказаться достаточно большим, так как многие РНК-связывающие белки различных организмов содержат домены, богатые аспарагином и глутамином, что указывает на их потенциальную склонность к амилоидогенезу [96, 97].

Функциональные амилоиды могут принимать участие и в контроле репликации ДНК, что имеет непосредственное отношение к поддержанию стабильности генома. Так, белок RepA бактерии P. aeruginosa, кодируемый геном в составе плазмидного репликона pPS10, непосредственно участвует в контроле инициации репликации этой плазмиды. Мономеры и амилоидные агрегаты этого белка выполняют противоположные функции в данном процессе. Мономеры, связывающиеся со специфическими повторами ДНК в ориджине репликации (итеронами), инициируют репликацию плазмиды. После инициации репликации взаимодействие RepA с итеронами индуцирует сборку амилоидных олигомеров RepA, которые прочно связывают между собой две синтезированные копии pPS10 в области ориджина репликации и репрессируют инициацию репликации в этой области до начала нового раунда репликации [90, 91].

Напомним, что почти половина известных белков низших эукариот, способных к прионному превращению, участвуют в регуляции МП I – это транскрипционные регуляторы и фактор терминации трансляции eRF3 (табл. 1). Этот факт лишний раз указывает на несомненное взаимодействие МП I и МП II. В связи с бурным развитием исследований по идентификации новых амилоидных белков у самых разных организмов есть основания полагать, что число таких примеров может возрасти в ближайшие годы.

ОБЪЕКТЫ И МОДЕЛЬНЫЕ СИСТЕМЫ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ВЗАИМНОГО ВЛИЯНИЯ МАТРИЧНЫХ ПРОЦЕССОВ ПЕРВОГО И ВТОРОГО РОДА

Успех изучения молекулярных механизмов, опосредующих взаимодействие между амилоидизацией белков и системами поддержания стабильности генома, определяется выбором объекта исследования и наличием соответствующих методов и подходов. Изучение клеток и тканей животных и человека с амилоидными заболеваниями позволило получить большой объем экспериментальных данных по проблеме взаимного влияния амилоидизации и факторов поддержания стабильности генома. В пораженных тканях таких пациентов выявлено повышение частоты клеток с анеуплоидным набором хромосом, а также уровня окислительных повреждений ядерной и мтДНК, зафиксирована активация клеточного цикла в нейронах, которые в норме являются неделящимися постмитотическими клетками [98] (табл. 3).

В мозге людей с БА клетки с одной (моносомия) или тремя (трисомия) хромосомами 21 встречаются в 6 раз чаще, чем у здоровых людей. Доля нервных клеток, анеуплоидных по 21-й хромосоме, в норме составляет примерно 1.7%, тогда как при БА доля таких клеток возрастает до 10.7% [99]. Кроме того, отклонения от нормального набора хромосом при БА включают как гипер-, так и гипоплоидию по 13, 18 и 17 хромосомам [100]. У женщин с БА в 2 раза увеличена частота клеток с лишней Х-хромосомой. Кроме того, обнаружено увеличение частоты клеток (фибробластов и лимфоцитов) с микроядрами при БА [101]. Микроядра формируются из фрагментов хромосом, которые не попали в основное ядро при расхождении хромосом в митозе. Микроядра могут образовываться при разрыве хромосомы с сопутствующим образованием фрагментов без центромеры, или же в результате неправильного прикрепления микротрубочек веретена деления к хромосомам. С использованием флуоресцентных проб к центромерным участкам ДНК показано, что микроядра, образующиеся в фибробластах как при спорадических, так и при наследственных формах БА, содержат центромерные участки и, скорее всего, их возникновение обусловлено потерей целых хромосом, а не их поломкой [100]. Зрелые дифференцированные нейроны в норме не делятся, а клетки с анеуплоидным набором хромосом могут появиться только в результате полной репликации ДНК и расхождения хромосом в митозе (т.е. только в делящихся клетках). Отклонение от нормального набора хромосом в нейронах предположительно может иметь два источника происхождения [98]. Во-первых, некоторые индивиды могут обладать генетической предрасположенностью к неправильному расхождению хромосом, и образование анеуплоидных клеток у них могло произойти еще на ранних этапах созревания и дифференцировки нейронов. В этом случае одна из стволовых клеток, которая образовалась в результате неправильного расхождения хромосом, делясь, становится источником зрелых анеуплоидных нейронов. Во-вторых, во взрослом мозге млекопитающих есть стволовые клетки, которые могут замещать погибшие нейроны новыми клетками. Поэтому у взрослых лиц анеуплоидные нейроны могут возникать в результате деления и дифференцировки стволовых клеток. В связи с этим важно отметить, что процессы нейрогенеза усиленно происходят в мозге людей с БА, вероятно, в результате значительной апоптотической гибели нейронов при нейродегенеративных процессах [102].

При БП в лейкоцитах также наблюдается повышение частоты образования микроядер. Кроме того, применение маркеров центромерной ДНК выявило значительную долю микроядер, не содержащих центромеры. Это свидетельствует о том, что при БП микроядра в лимфоцитах формируются преимущественно в результате хромосомных поломок [103]. С помощью метода комет обнаружено значительное накопление двухцепочечных разрывов в нескольких участках мозга (фронтальная, темпоральная и окципетальная кора, путамен, гиппокамп, таламус, средний мозг и мозжечок) при БП [104]. Таким образом, дестабилизация генома в клетках пациентов с амилоидными нейродегенеративными заболеваниями указывает на то, что на фоне амилоидизации по крайней мере некоторых белков происходит нарушение МП I, а на модели нейродегенеративных и, возможно, других амилоидных заболеваний можно исследовать тонкие молекулярные механизмы взаимодействия МП I и МП II в норме и при патологии.

Одна из наиболее удобных моделей для исследования МП и первого, и второго рода и их взаимодействия – дрожжи S. cerevisiae. Различные штаммы S. cerevisiae используют для изучения фундаментальных аспектов биологии эукариот, в том числе механизмов репликации, транскрипции, трансляции, репарации и мутагенеза, возникновения анеуплоидии и ее проявлений, начиная с 50-х годов 20 века. С использованием S. cerevisiae изучают сигнальные и метаболические пути, регуляцию клеточного цикла, моделируют процессы старения, онкологические и другие заболевания человека. Дрожжи позволяют совместить преимущества работы с микроорганизмами с возможностями исследования эукариотических клеток. Хорошо разработаны разнообразные методы частной и молекулярной генетики дрожжей, основанные на классических микробиологических и современных молекулярных методах и подходах [105]. С помощью инструментов функциональной геномики созданы коллекции делеционных мутантов дрожжей [106, 107] и различные библиотеки векторов для сверхэкспрессии генов дрожжей, покрывающие 97% генома [108]. К настоящему времени с использованием геномных коллекций накоплен огромный массив данных об изменениях транскриптома [109] и протеома [110] на фоне различных мутаций в различных условиях культивирования.

Дрожжи S. cerevisiae широко используют для изучения процесса амилоидогенеза, белков, ассоциированных с нейродегенеративными заболеваниями, а также для разработки и тестирования потенциальных терапевтических средств, эффективных при этих болезнях [111]. С использованием в качестве модели дрожжевых прионов [PSI⁺], [PIN⁺], [URE3] и других изучены основные механизмы белок–белковых взаимодействий при амилоидогенезе. Обнаружено взаимодействие прионов и амилоидов между собой, и сформулировано понятие “прионных сетей”. Показано, какие белковые домены участвуют в образовании амилоидов [24, 112]. Разработаны дрожжевые модели, позволяющие изучать основные молекулярные механизмы развития БА, БХ, БП, сахарного диабета типа 2, БАС, а также наследственных болезней, связанных с нарушением метаболизма аминокислот и приводящих к возникновению амилоидоподобных структур [113].

Дрожжевая модель хорошо зарекомендовала себя при изучении нестабильности генома. На этой модели изучены многие фундаментальные аспекты механизмов возникновения генных, хромосомных и геномных мутаций, а также вклад систем репарации в процесс мутагенеза. Это стало возможным благодаря хорошо разработанным методам выявления точковых мутаций, мутаций сдвига рамки считывания, двухцепочечных разрывов, делеций, хромосомных перестроек и других нарушений генетического материала. Наиболее эффективные и популярные методы изучения различных аспектов мутагенеза у дрожжей детально описаны в обзоре [114]. С использованием дрожжей на кафедре генетики и биотехнологии Санкт-Петербургского государственного университета разработан метод, получивший название альфа-тест [115, 116], который, в отличие от многих других тест-систем, позволяет учитывать генетические нарушения всех типов: первичные повреждения, генные мутации, гомологичную рекомбинацию и конверсию, а также потерю целой хромосомы или ее плеча [116–120]. С использованием альфа-теста нам удалось показать, что присутствие приона [PSI⁺] может снижать частоту генных мутаций и потери целой хромосомы III, но повышать частоту конверсии кассеты HMRa в локус MATα [121].

Таким образом, благодаря глубокой проработке методических подходов, применяемых для изучения как мутагенеза, так и амилоидов, дрожжи используют в качестве удобной модели для исследования влияния амилоидизации белков на стабильность генетического материала.

АМИЛОИДЫ И СТАБИЛЬНОСТЬ ГЕНОМА: ВОЗМОЖНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ВЗАИМНОГО ВЛИЯНИЯ

Существование связи между эффективностью амилоидогенеза в клетке и уровнем стабильности генома не вызывает сомнений, однако открытым остается вопрос о том, какой из этих факторов первичный. Не ясно, является ли амилоидизация некоторых белков первопричиной дестабилизации генома или, наоборот, нарушения генетического материала приводят к повышению эффективности амилоидогенеза. Современные данные указывают на то, что оба механизма могут быть реализованы в живых организмах, однако соотношение процессов может различаться в разных клетках и в разных условиях. Далее мы обсудим экспериментальные данные, подтверждающие каждую из возможных моделей взаимодействия амилоидов и системы контроля стабильности генома.

Прежде всего, необходимо пояснить, что к признакам дестабилизации генома относится появление мутаций различных типов. Традиционно мутации делят на три основные группы: 1) генные, или точковые (транзиции, трансверсии, вставки и выпадения нескольких нуклеотидов, изменение копийности коротких повторов); 2) хромосомные (крупные делеции, дупликации, транслокации, инверсии); 3) геномные (анеуплоидия и полиплоидия) [122–124]. Мутации каждого типа возникают посредством разных механизмов, которые, однако, могут взаимодействовать между собой. Так, точковые мутации возникают в результате ошибок синтеза ДНК в ходе репликации, репарации или рекомбинации, точность которого зависит от повреждений в матричной цепи, точности ДНК-полимераз, осуществляющих синтез, активности всех белков, регулирующих активность ДНК-полимераз, эффективности систем репарации, а также наличия сбалансированного пула нуклеотидов в клетке [123, 125, 126].

Хромосомные мутации возникают в результате нарушения процесса репарации ДНК с двухцепочечными разрывами и другими серьезными повреждениями, индуцированными мутагенами или возникшими в ходе естественных процессов, например, при кроссинговере, переключении типа спаривания у дрожжей или созревании генов иммуноглобулинов у млекопитающих [123, 127]. Геномные мутации возникают при нарушении расхождения хромосом в мейозе или митозе, чаще всего связанном с аномалиями белков веретена деления клетки [128, 129].

Для выявления причин дестабилизации генома на фоне амилоидизации каких-либо белков необходимо в первую очередь учитывать тип нарушений генетического материала, а в качестве наиболее вероятной мишени рассматривать белки, вносящие наибольший вклад в предотвращение возникновения мутаций данного типа. Опубликованные данные указывают на то, что амилоиды могут взаимодействовать с факторами, контролирующими возникновение мутаций всех трех типов: генных, хромосомных и геномных. Этот вопрос будет освещен в следующем разделе. Поэтому можно предположить, что амилоиды могут влиять на процессы возникновения повреждений генетического материала и репарации поврежденной ДНК, модифицировать точность матричного синтеза ДНК или РНК, а также влиять на процесс рекомбинации и сегрегации хромосом. Некоторые из этих предположений уже получили экспериментальное подтверждение.

ВЛИЯНИЕ ИЗМЕНЕНИЙ В ГЕНОМЕ НА АМИЛОИДОГЕНЕЗ

В последние годы накапливается все больше фактов, говорящих о том, что не только амилоиды могут служить первопричиной дестабилизации генома, но и генетические нарушения могут запускать агрегацию белков, хотя известно, что генетическая составляющая амилоидозов – всего около 10% [99]. Поддержание гомеостаза протеома требует координированной работы систем синтеза, контроля качества и деградации белков. Синтезированные пептиды должны быть правильно свернуты, неправильно сложенные белки должны быть повторно свернуты, а необратимо поврежденные белки должны подвергнуться деградации. Кроме того, должны быть правильно собраны мультибелковые комплексы. Молекулярные шапероны играют главную роль в сворачивании и рефолдинге белков и сборке мультибелковых комплексов, а протеасомные и вакуолярные протеазы – в деградации неправильно сложенных белков [16, 17]. Шапероны и убиквитин-протеасомные системы функционируют согласованно, обеспечивая гомеостаз протеома. Когда клетки испытывают протеотоксический стресс, т.е. когда системы контроля качества белка, включающие шапероны и системы протеасомной деградации, работают неэффективно или перегружены, неправильно свернутые белки не устраняются, что провоцирует образование агрегатов [17]. Крупные изменения генома, такие как потери или повышение числа отдельных хромосом, крупные делеции или дупликации могут приводить к дестабилизации протеома из-за изменения дозы генов и повышать вероятность образования белковых агрегатов, в том числе амилоидных.

Действительно, в ряде исследований показано, что анеуплоидные клетки испытывают протеотоксический стресс, вызванный нарушением протеомного баланса, в частности, стехиометрических соотношений компонентов белковых комплексов. Синтез большого количества невостребованных белковых молекул приводит к повышенной нагрузке на системы, осуществляющие деградацию и контроль качества белков [187, 188]. Так, анеуплоидные штаммы дрожжей – дисомные по различным хромосомам, обладают повышенной чувствительностью к высоким температурам, ингибиторам белкового синтеза и сворачивания белка, а также к химическим агентам и мутациям, инактивирующим протеасомную деградацию. При этом повышение эффективности протеасомной деградации при делеции гена, кодирующего деубиквитинирующий фермент Ubp6, повышает жизнеспособность ряда дисомных штаммов дрожжей [189, 190]. Вследствие недостаточности систем контроля качества белка у анеуплоидных штаммов дрожжей повышена эффективность агрегации белков, в том числе образования амилоидных агрегатов. Так, в ряде дисомных штаммов дрожжей, продуцирующих белок хантингтин (Htt) с различной длиной полиглутаминовых повторов, агрегация данного белка происходит с большей эффективностью. При этом токсическим эффектом обладали варианты белка, у которых длина поли-Gln-участка была меньше, чем в соответствующих эугаплоидных штаммах [191]. В этой же работе показано повышение эффективности образования агрегатов модифицированного варианта белка Sup35p дрожжей, склонного к амилоидной агрегации, в ряде анеуплоидных штаммов по сравнению с контрольными гаплоидными штаммами.

Принципиально сходные данные получены и с использованием культур клеток человека и мыши. В культивируемых клетках млекопитающих анеуплоидия также нарушает гомеостаз протеома, приводя к аномальному сворачиванию белковых молекул, накоплению белковых агрегатов, изменению характера аутофагии и накоплению компонентов аутофагосом в лизосомах, что приводит к перегрузке лизосом и, как следствие, к неэффективной деградации аномальных белков в лизосомах [192–195].

Эти и другие данные позволяют предполагать, что анеуплоидия может быть одним из факторов, провоцирующих возникновение нейродегенеративных заболеваний амилоидной природы, таких как БА, БП, БХ и другие. Значительная часть клеток мозга человека представлена анеуплоидными клетками (анеуплоидными являются около 10% нейронов взрослого человека [99, 196–198]). Тот факт, что анеуплоидия вызывает протеотоксический стресс, включая формирование агрегатов поли-Gln-содержащих белков в дрожжевой модели [191], позволяет предполагать, что анеуплоидные нейроны могут иметь повышенную способность к формированию амилоидных агрегатов и / или сниженную способность к их элиминации. Таким образом, анеуплоидные нейроны могут быть предрасположены к развитию амилоидных заболеваний. Так, ранее отмечали, что у мышей, химерных по трисомии по хромосоме 16 (одна из моделей СД), повышена восприимчивость к инфекции. У таких мышей при инъекции прионной формы белка PrP (PrP^Sc) болезнь развивается быстрее, а симптомы выражены сильнее, чем у нормальных мышей [199].

Наряду с общей дестабилизацией протеома в анеуплоидных клетках, одной из причин повышения эффективности амилоидизации отдельных белков может быть увеличение дозы генов, кодирующих белки, склонные к амилоидной агрегации. На такую возможность указывает обнаружение связи между БА и cиндромом Дауна (СД) [200, 201]. СД – врожденное заболевание, обусловленное наличием лишней копии хромосомы 21. Лица с СД предрасположены к развитию ожирения, лейкозов в детском возрасте, сахарного диабета, БА и ряда других. Симптомы БА появляются при СД уже к 20 годам, а в 35–40 лет практически у всех больных диагностируют БА [202]. Поскольку ген APP, кодирующий белок-предшественник Aβ, расположен в хромосоме 21 человека [203], предполагают, что именно дополнительная копия гена APP при СД вызывает увеличение продукции белка АPP и, соответственно, Aβ_1-42 [204, 205]. В пользу этого предположения свидетельствуют данные о развитии БА у лиц с разными вариантами СД, а также у носителей редкой дупликации локуса, содержащего ген APP. Причиной СД может быть не только целая лишняя хромосома 21, но и ее фрагмент. При СД с дополнительным фрагментом хромосомы 21, который не содержит локус APP, отсутствуют симптомы БА [206], а редкая дупликация локуса с геном APP вызывает преждевременное развитие аутосомно-доминантной формы БА [207, 208]. Существование положительной корреляции между СД и БА позволило предположить, что люди, у которых развивается БА, являются мозаиками по хромосоме 21 (частичный, или мозаичный СД), а лишняя копия гена APP даже в небольшом количестве нервных клеток приводит к увеличению продукции Aβ_1-42 [209]. Действительно, при БА в мозге повышена частота клеток с анеуплоидным набором хромосом, чаще всего клеток, содержащих дополнительную хромосому 21 [99].

Об общих генетических механизмах БА и СД свидетельствуют также следующие данные. В семьях с наследственной предрасположенностью к развитию БА повышена частота рождения детей с СД, а в семьях, в которых у молодых женщин (до 35 лет) часто рождаются дети с СД, повышена и частота БА [210, 211]. Так как СД связывают, в первую очередь, с неправильным расхождением хромосом при созревании яйцеклеток предположили, что у таких женщин повышен общий уровень нерасхождения хромосом, и они особенно предрасположены к БА [212]. Как оказалось, у молодых матерей детей с СД частота БА в 5 раз выше, чем в среднем по популяции [213]. В число генетических факторов, способствующих развитию БА при СД, входят мутации в генах APP, PS1, PS2, ACT и APOE [214]. Ген ACT кодирует α1-антихимотрипсин, компонент амилоидных бляшек, взаимодействующий с Aβ. Предполагается, что аллель ACT-17A обуславливает предрасположенность к БА [215, 216]. Ген APP кодирует белок-предшественник Аβ, который подвергается посттрансляционной модификации с образованием зрелого β-амилоида при участии α- и γ-секретазных комплексов. В состав этих комплексов входят пресенилины, кодируемые генами PSEN1 (PS1) и PSEN2 (PS2) [217]. Ген APOE кодирует три изоформы аполипопротеина Е (ε2, ε3, ε4). Носительство аллеля APOE4, кодирующего изоформу ε4, определяет предрасположенность к БА [218]. У молодых матерей детей с СД чаще встречается генотип APOE4/APOE4 [219]. Изоформа ε4 сильнее других способствует образованию олигомеров Aβ [220]. Кроме того, ε4 способен связываться с такими белками микротрубочек, как MAP (microtubule-assosiated proteins), что может влиять на работу микротрубочек цитоскелета и приводить к неправильному расхождению хромосом [221].

ЗНАЧЕНИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ МЕХАНИЗМОВ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ МП I И МП II ДЛЯ МЕДИЦИНЫ: P53, АМИЛОИДЫ И КАНЦЕРОГЕНЕЗ

Онкологические и амилоидные нейродегенеративные заболевания – две самые распространенные группы заболеваний с высокой смертностью. Возникновение и прогрессия онкологических заболеваний тесно связаны с накоплением мутаций, а нейродегенеративные заболевания рассматривают, прежде всего, в связи с амилоидизацией белков. Необычную, преимущественно обратную, корреляцию между этими двумя группами патологий обнаружили еще в 1954 г., когда заметили, что у пациентов с БП реже диагностируют рак [222]. В дальнейшем это наблюдение подтвердили более чем в 30 исследованиях [223–229]. Неоднократно показано снижение риска развития таких видов рака, как рак легкого, кожи, молочной и предстательной желез у пациентов с БП [230, 231]. Единственное исключение представляет злокачественная меланома, частота которой увеличивается при БП. Интересно, что меланоциты кожи и нейроны черной субстанции это пигментированные клетки, имеющие общее происхождение. У пациентов с диагнозом БА риск развития опухолей снижен на 50%, а у индивидов, у которых был диагностирован рак, БА встречается на 35% реже, чем в контрольной группе лиц соответствующего возраста (средняя популяционная частота) [232]. Эти данные подтверждаются и результатами других исследований [233, 234]. Сходные корреляции обнаружены также между онкологическими и такими нейродегенеративными заболеваниями, как БХ и БАС [227, 235].

Механизм такой необычной зависимости не установлен, однако выдвинуто несколько предположений. И БА, и разные виды рака относятся к довольно агрессивным заболеваниям с высокой смертностью, поэтому можно предположить, что обратная зависимость между частотами этих патологий вызвана тем, что пациенты одной группы не доживают до манифестации другого заболевания. Чтобы уменьшить влияние смертности на частоту заболеваний, нужно использовать данные, полученные в результате длительного наблюдения. Довольно хорошо исследованную группу лиц, находящихся под длительным медицинским наблюдением, представляют жители Японии, пережившие атомную бомбардировку, у которых повышен риск развития рака. В одном из исследований сообщается, что у входящих в эту группу лиц с диагнозом БА рак развивается на 70% реже, чем у лиц того же возраста без признаков деменции [236]. Согласно результатам эпидемиологического исследования [234], обнаруженная обратная зависимость между частотой БА и рака сохраняется, даже если исключить из анализа людей, не доживших до 80 лет. Стоит отметить, что подобной корреляции между частотой онкологических заболеваний и сосудистых деменций (группа нейродегенеративных заболеваний неамилоидной природы) не обнаружено.

Еще одно объяснение обратной корреляции между риском онкологических и амилоидных заболеваний может заключаться в том, что терапия, применяемая при одном из указанных заболеваний, может снизить риск развития другого. Так, например, при раке применяют лучевую или химиотерапию, а для снижения симптомов БП используют леводопу. Известно, что предварительное облучение малыми дозами ионизирующего облучения способствует лучшей переносимости высоких доз радиации [237–239]. Механизм этого действия связан с тем, что небольшие дозы мутагена вызывают активацию клеточных систем репарации, например, синтез ферментов систем репарации ДНК, и клеточные повреждения, вызванные последующим облучением большими дозами, быстрее устраняются. Возможно, снижение частоты БА у онкологических больных связано с применением препаратов, блокирующих деление клеток. Предполагается, что воздействие противоопухолевой терапии способствует активации как системы репарации ДНК, так и системы восстановления белков (шапероны и убиквитин-протеазы), что, с одной стороны, ускоряет устранение окислительных повреждений, вызванных токсичными формами амилоидных белков, а с другой, способствует удалению белковых молекул с измененной пространственной структурой. Снижение частоты опухолевых заболеваний у пациентов с амилоидозами может быть связано с активацией систем репарации ДНК в результате окислительного стресса, вызванного присутствием токсичных молекул белков, и ускоренным устранением повреждений ДНК, что препятствует образованию раковых клеток. Это теоретическое предположение требует экспериментальной проверки с использованием модельных организмов и мутагенов. Некоторые работы в этом направлении уже проводятся. Так, недавно показали, что у трансгенных мух D. melanogaster, синтезирующих Aβ_1-42 человека (модель БА), небольшие дозы ионизирующего облучения подавляют развитие дефектов глаз и крыльев, вызванных накоплением амилоидных агрегатов [240].

Получены свидетельства того, что переход белков в амилоидное состояние может способствовать возникновению и росту раковых опухолей. Известны некоторые мутации в гене-супрессоре опухолей p53, приводящие к синтезу мутантного белка с амилоидными свойствами [241]. Мутантные молекулы р53 склонны к агрегации и формируют амилоидоподобные полимеры, в которые включаются также нормальные молекулы p53, что приводит к снижению концентрации функционального белка в цитоплазме. Такие мутации доминантны, они приводят к развитию рака у их носителя, несмотря на присутствие копии гена дикого типа [242].

Таким образом, имеющиеся данные позволяют сделать вывод о сложном взаимном влиянии механизмов, лежащих в основе развития онкологических и амилоидных заболеваний, и о возможности как прямой, так и обратной корреляции между развитием амилоидозов и канцерогенезом. Аналогичные выводы были сделаны и по результатам изучения данных почти 4 млн. пациентов. Оказалось, что риск смерти от БА у больных с различными формами рака в разной степени зависит от таких факторов, как раса, тип опухоли, возраст, в котором был диагностирован рак, время, прошедшее с постановки диагноза, а также от применения химио- и радиотерапии [243]. В данный момент мы можем только предполагать, что взаимодействие МП I и МП II может иметь как различные формы, так и различные последствия для пациентов. В настоящее время эта область науки находится на этапе накопления сведений и формирования гипотез.

В связи с обсуждаемой темой представляет интерес блок экспериментальных данных о том, что при некоторых опухолевых заболеваниях изменяется экспрессия генов, кодирующих белки-предшественники прионов и амилоидов. Увеличение продукции белка PrP отмечено в клетках остеосаркомы, глиобластомы, меланомы, рака желудка, поджелудочной железы, легких и других опухолей [58]. Экспрессия гена APP, кодирующего Аβ, а также его гомолога APLP2 (APP-like protein 2), повышена в клетках рака молочной железы, легкого, щитовидной и предстательной железы, а также меланомы и саркомы Юинга [244–249]. Повышение продукции белков APP и PrP во многих клеточных линиях опухолевых клеток коррелирует с усиленной пролиферацией [244, 250] и повышенной миграцией клеток [251, 252], что придает опухолевым клеткам способность к метастазированию. При этом экспериментальное снижение концентрации этих белков приводит к удлинению клеточного цикла, клетки реже делятся и даже синтезируют маркеры апоптоза [245, 253]. Кроме того, снижение продукции белка APP в клеточных линиях меланомы человека повышает их чувствительность к химиотерапевтическим препаратам [248, 249], которые блокируют вилку репликации и действуют в основном на активно делящиеся клетки. Этот факт указывает на то, что в клетках с низкой продукцией APP ДНК не синтезируется.

Необходимо отметить, что в работах [58, 242–251] оценивали только уровень экспрессии генов, кодирующих амилоидогенные белки, но не определяли присутствие самих амилоидов. Поэтому невозможно сделать однозначный вывод о прямом или обратном влиянии именно амилоидов на канцерогенез. Возможно, одно из объяснений существования обратной корреляции между онкологическими и нейродегенеративными заболеваниями заключается в том, что повышение концентрации амилоидогенного белка (APP или PrP) в цитоплазме является фактором, способствующим повышению вероятности амилоидизации. А появление в клетке амилоидных агрегатов снижает концентрацию растворимого активного белка, что равнозначно снижению продукции этого белка, и может приводить к замедлению клеточного цикла и даже апоптозу [245, 253]. Конечно, это предположение нуждается в подтверждении, но уже сейчас изучают возможность терапии рака молочной железы с помощью ингибирования APP [254 ] . В любом случае, эти данные имеют важное значение для поиска молекулярных механизмов, обеспечивающих взаимодействие факторов контроля стабильности протеома и генома.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Настоящий обзор представляет собой, насколько нам известно, первую попытку рассмотрения геномно-протеомных взаимодействий с единой позиции матричного принципа, согласно которому МП подразделяются на две категории – МП I, оперирующие с линейными матрицами, характерными для процессов воспроизведения носителей генетической информации (репликации) и реализации генетической информации (транскрипции и трансляции), с одной стороны, и МП II, оперирующие с пространственными, или конформационными (белковыми) матрицами, с другой (рис. 1). С этой точки зрения наследственность представляет собой комбинацию признаков, зашифрованных как в виде линейной последовательности нуклеиновых кислот (геном), так и в виде пространственной организации белковых молекул (протеом). Стоит отметить, что первые данные, свидетельствующие о возможном взаимном влиянии МП I и МП II, появились давно, около 20–30 лет назад, и стали стремительно накапливаться, особенно в последние 5 лет. Нами рассмотрены имеющиеся на сегодняшний момент данные о взаимодействии МП I и МП II, а также вероятные механизмы этих взаимодействий (рис. 3). Постоянно получаемые новые факты взаимного влияния МП I и МП II имеют значение как для понимания фундаментальных механизмов наследственности и изменчивости, так и для медицинских приложений в связи с обнаружением прямой и обратной корреляции между онкологическими и амилоидными заболеваниями. На основе приведенных в обзоре сведений мы можем предположить, что при изучении генетических механизмов и последствий взаимодействия МП I и МП II необходимо помнить об общности свойств этих процессов, таких как неоднозначность и способность к коррекции ошибок. Несомненно, эта область сулит нам много открытий, и мы находимся в начале многообещающего пути выяснения механизмов рассмотренных взаимодействий.

Рис. 3.

Механизмы взаимодействия амилоидогенеза и механизмов поддержания стабильности генома.

Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 19-14-50230 и при государственной финансовой поддержке ведущих университетов Российской Федерации в рамках программы ITMO Fellowship and Professorship Program.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов исследований.

Авторы сообщают об отсутствии конфликта интересов.