Молекулярная биология, 2020, T. 54, № 5, стр. 725-749

Нарушение ГГА-оси как механизм патогенеза депрессивных состояний

Стресс является ключевой причиной развития депрессии. Ответ организма на стресс регулируется посредством оси ГГА. Под влиянием факторов стресса клетки паравентрикулярного ядра гипоталамуса высвобождают аргинин-вазопрессин и кортикотропин-рилизинг-фактор, которые поступают в гипофиз [13]. Стимуляция рецепторов гипофиза индуцирует выработку адренокортикотропного гормона, доставляемого с током крови к надпочечникам. Под влиянием гормона в надпочечниках синтезируются глюкокортикоиды и минералокортикоиды: у человека, главным образом, кортизол, а у грызунов – кортикостерон. Рецепторы к этим гормонам экспрессируются в головном мозге и реагируют на изменение концентрации веществ по механизму отрицательной обратной связи [13].

Кортикостероиды играют важную роль в ответе на стресс, поддержании гомеостаза, регуляции эндокринного и иммунного ответа, энергетического обмена [14]. В норме глюкокортикоиды в небольшом количестве активируют преимущественно рецепторы минералокортикоидов, в условиях же стресса их уровень значительно повышается и обеспечивает активацию рецепторов глюкокортикоидов (Glucocorticoid receptor, GR) [15]. Продолжительный стресс приводит к их десенситизации и снижению активности, нарушению системы обратной связи и появлению поведенческих изменений [15, 16]. При повышении уровня глюкокортикоидов GR начинают функционировать в качестве транскрипционного фактора, поступая из цитозоля в ядро [17]. Этот процесс регулируется, главным образом, молекулярным комплексом белка 51, связывающего FK506 (FK506 binding protein 51, FKBP51). Данный комплекс кодируется геном FKBP5 и функционирует как кошаперон через связывание с головкой шаперона Hsp 90 во время формирования GR [17]. Как следствие, GR имеют сниженное сродство к глюкокортикоидам. Этот механизм подтверждается результатами исследования, показавшими снижение уровня GR при депрессии, а также увеличение экспрессии FKBP5 [18].

Ассоциацию нарушения работы оси с депрессивной симптоматикой подтверждают клинические и доклинические данные. В слюне и плазме крови пациентов с депрессией наблюдается повышение уровня кортизола, а в лимбических структурах мозга – увеличение кортикотропин-рилизинг-фактора [19]. Кроме того, в посмертных образцах мозга пациентов с историей депрессии регистрируется увеличение содержания в паравентрикулярном ядре нейронов, экспрессирующих аргинин-вазопрессин, более чем на 50% [20]. В экспериментах на лабораторных грызунах показано, что длительное введение глюкокортикоидов индуцирует депрессивно-подобное поведение, а также вызывает снижение экспрессии нейротрофического фактора мозга (Brain derived neurotrophic factor, BDNF) в гиппокампе [21]. Блокада рецепторов аргинина-вазопрессина типа 1a (V1a) оказывает противодепрессивное и противотревожное действие на животных, что делает антагонисты рецепторов потенциальными препаратами для терапии тревожных и депрессивных расстройств [22].

Моноаминергическая гипотеза патогенеза депрессивных состояний

Дефицит моноаминов (серотонина, норадреналина и дофамина) в структурах головного мозга лежит в основе гипотезы патогенеза депрессивных расстройств [23]. Моноаминергические системы вовлечены в регуляцию множества функций организма. Так, серотонин связан с контролем болевой чувствительности, нейрогормональной регуляцией, вовлечен в развитие тревожных и фобических расстройств [24]. Норадреналин ассоциирован с вегетативными реакциями и эмоциями, участвует в контроле уровня бодрствования, процессов селективного внимания [25]. Дофамин тесно связан с моторной системой и системой подкрепления и вовлечен в патогенез таких расстройств, как шизофрения и БП [26].

Десенситизация и снижение числа рецепторов серотонинергической системы лежат в основе моноаминергической теории депрессии [15]. В первую очередь, это относится к рецепторам 5-HT1A, часть которых функционирует в качестве соматодендрических ауторецепторов [27]. Методами позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ) показано, что активация ауторецепторов снижает частоту пульсации серотонинергических нейронов в области ядер шва [28], что может вызывать протревожные и продепрессивные эффекты. Показано, что полиморфизм рецепторов данного типа ассоциирован с развитием расстройств настроения, что подтверждает его участие в патогенезе заболевания. Однонуклеотидный полиморфизм (SNP) С(–1019)G в промоторе гена рецептора 5-HT1A приводит к угнетению транскрипционного репрессора NUDR/DEAF-1 (Deformed epidermal autoregulatory factor 1 homolog) и фактора транскрипции 5 из семейства Hes (HES5), что обуславливает усиление экспрессии рецептора и опосредованное снижение импульсации серотонинергических нейронов [29]. Гомозиготный полиморфизм связан с повышенной тревожностью, развитием клинической депрессии и сниженным ответом на терапию антидепрессантами [29]. Одновременное носительство гомозиготного полиморфизма С(–1019)G гена 5-HT1A и гена BDNF с заменой валина на метионин в кодоне 66 (Val66Met) хотя бы в одном из аллелей повышает риск развития депрессии в 3 раза [30].

С развитием депрессивных состояний ассоциированы и другие рецепторы, например, 5-HT1B и 5-HT2C [23]. Рецепторы 5-HT4 также связаны с развитием депрессивных состояний, что подтверждается данными об ассоциации локальных полиморфизмов гена 5-HTR4, в области, кодирующей С-концевую часть рецептора, с риском развития униполярной депрессии [31]. Показано, что агонист рецептора (RS67333) вызывает быстрый ответ на терапию антидепрессантами и увеличение экспрессии мРНК BDNF в области гиппокампа [32]. В целом, выявлена тесная ассоциация системы серотонина с нейротрофинами [33]. Вклад медиатора в развитие депрессивных состояний подтверждается ассоциацией транспортера серотонина (Serotonin transporter, SERT) с течением патологии. Показано, что короткий аллель (14 повторов) функционального промоторного полиморфизма гена SERT в гомозиготном состоянии снижает выработку транспортера, повышает чувствительность к стрессу и вероятность развития депрессии [34].

Система норадреналина тесно связана с ответом организма на стрессовое воздействие [35]. Так, у экспериментальных грызунов в депрессивно-подобном состоянии обнаружено повышение активности норадренергических нейронов в области голубого пятна (locus coeruleus). Эти эффекты могут быть связаны с подавлением ингибиторных α2-адренорецепторов [36], так как использование их агонистов снижает импульсацию нейронов и уменьшает проявление депрессивно-подобного поведения.

Также система норадреналина тесно связана с ответом на терапию антидепрессантами. В частности, положительный эффект препаратов может быть следствием деактивации α2-адренорецепторов в области locus coeruleus и β1-адренорецепторов в гиппокампе [37]. Кроме того, лечебное действие антидепрессантов опосредуют и β3-адренорецепторы [37]. Блокаторы обратного захвата норадреналина и его транспортера повышают количество норадреналина в синаптической щели, что приводит к активации β3-адренорецепторов. Действие этих рецепторов опосредуется G_s-белками, активирующими аденилатциклазу. Аденилатциклаза катализирует реакцию образования cAMP, который активирует протеинкиназу А (PKA). PKA, в свою очередь, фосфорилирует белок, связывающийся с cAMP-зависимым элементом (cAMP response element-binding protein, CREB), индуцируя транскрипцию BDNF [37]. Кроме того, белок G_s активирует сигнальный путь, опосредованный фосфоинозитид-3-киназой (PI3K), который приводит к фосфорилированию серин/треонин-специфичной протеинкиназы RAC-α (Akt). Активированная Akt фосфорилирует белок mTOR (мишень рапамицина млекопитающих), что стимулирует пролиферацию клеток [37, 38]. За счет взаимодействия с тропомиозиновым тирозинкиназным рецептором В (TrkB) BDNF способствует повышению экспрессии мРНК субъединиц GluR1 и GluR2 рецептора AMPA и их синаптической локализации, что играет ключевую роль в формировании долговременной потенциации (LTP) и в процессах синаптической пластичности. Таким образом, система норадреналина играет важную роль в противодепрессивном действии медикаментозных препаратов, что подтверждает его участие в патогенезе депрессивных состояний.

Дофамин – еще один моноамин ЦНС, который также вовлечен в процессы развития депрессии [39]. Изменения его выработки, ассоциированные с патогенезом депрессии, связаны с функционированием дофаминергических нейронов в вентральной области покрышки, области вентромедиальной префронтальной коры, нарушением работы механизмов “системы вознаграждения” и формированием ангедонии [39].

С помощью ПЭТ показано снижение связывания транспортера дофамина у больных с депрессией по сравнению со здоровыми испытуемыми [40]. Кроме того, изучение посмертных образцов мозга пациентов с клинической депрессией, выявило повышение уровня рецепторов D2 в области стриатума и D2/D3 в области центрального и базального ядер миндалины [39]. Эти рецепторы, выполняющие тормозную функцию, опосредуют снижение уровня дофамина [39]. Роль рецепторов этого типа в депрессивных расстройствах подтверждают и данные о регуляции сигнального пути Akt и киназы 3 гликоген-синтазы (GSK3, Akt-GSK3) за счет D2 [41]. В частности, D2 оказывают тормозный эффект на Akt и вызывают опосредованное этим увеличение уровня GSK3 [41]. Изменение GSK3β показано при психических заболеваниях, таких как шизофрения и биполярное аффективное расстройство (БАР) [42], а ингибирование GSK3β оказывает противодепрессивное действие [43].

На моделях депрессивных состояний у грызунов подтверждено нарушение функционирования мезолимбической системы дофамина при эмоциональных расстройствах. Например, снижение экспрессии дофамина в лимбических структурах мозга выявлено в модели выученной беспомощности [44]. Тесно ассоциирован с депрессивными состояниями и мезокортикальный дофаминергический путь, связанный с когнитивными нарушениями, наблюдаемыми при депрессии [45]. Предполагается, что снижение активности дофаминергической системы в вентромедиальной коре опосредуется нейровоспалительными процессами, сопровождающими длительное стрессорное воздействие. Повторяющийся стресс вызывает выброс простагландина E₂ (PGE2), который действует на свои рецепторы EP1 [45]. Активация рецепторов подавляет работу мезокортикальной системы дофамина и индуцирует поведенческие продепрессивные эффекты.

В пользу связи дофамина с депрессивными расстройствами свидетельствуют и данные о взаимодействии глутаматергической и дофаминергической систем, и участие нейромедиатора в формировании LTP [46], которая играет важную роль в процессах синаптической пластичности.

Таким образом, роль моноаминов в патогенезе депрессии хорошо изучена. Однако нарушение функционирования этих систем является лишь частью комплекса изменений, и их дисфункция сама по себе не способна полноценно индуцировать возникновение клинической депрессии.

Помимо моноаминергических систем мозга существенный вклад в патогенез депрессивных состояний вносят и другие нейромедиаторы. Баланс основных возбуждающих и тормозных систем в головном мозге значительно нарушается при депрессии, что указывает на вовлечение в патологические процессы систем глутамата и ГАМК [47]. Так, при помощи протонной МРТ выявлено снижение метаболитов глутамата в вентромедиальной префронтальной коре [47], а в постмортальных исследованиях установлено снижение числа синапсов и синаптических маркеров в дорсолатеральной префронтальной коре при депрессии [48]. Исследования ГАМКергической системы показали снижение ГАМК в спинномозговой жидкости больных депрессией [47], а также подавление активности системы в кортикальных областях мозга, нормализующееся при ремиссии. Доклинические эксперименты выявили снижение синаптических маркеров глутамата, таких как GluA1, постсинаптический плотный белок 95 (Postsynaptic density protein 95, PSD95) и синапсин 1 в вентромедиальной префронтальной коре [49]. Показано, что трехнедельный хронический непредсказуемый мягкий стресс (ХНМС) вызывает снижение пре- и постсинаптических маркеров ГАМК, таких как глутаматдекарбоксилаза 65/67 (GAD65/67) и гефрин в префронтальной коре [50]. Мыши, мутантные по гену рецептора ГАМК_А, имеют депрессивно-подобную симптоматику, в том числе признаки ангедонии и неофагии [51].

Вовлеченность медиаторных систем в патогенез депрессии однозначно подтверждается противодепрессивными эффектами, вызванными антагонистом NMDA-рецепторов – кетамином [52]. Клиническое действие кетамина обусловлено блокадой NMDA-рецепторов на тормозных ГАМКергических интернейронах, что обеспечивает эффект растормаживания и увеличение выброса глутамата [52]. Активация глутаматергической системы вызывает нейропластические изменения посредством вовлечения рецепторов AMPA, активации BDNF и опосредованным им запуском сигнального пути mTORC1, ассоциированного с пластическими процессами [52]. Наряду с активацией глутаматергической системы кетамин восстанавливает и нарушения системы ГАМК, связанные с депрессией. В частности, показано, что однократное применение кетамина увеличивает содержание пре- и постсинаптических маркеров GAD65/67, везикулярного транспортера ГАМК, гефрина, дефицит которых сопровождает депрессивные состояния [51].

Таким образом, рассмотренные медиаторные системы тесно вовлечены в патогенез депрессии, а также ассоциированы с действием антидепрессантов. Кетамин в виде С-стереомера уже протестирован в фазе III клинических исследований и одобрен Управлением по надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (Food and drug administration, FDA) в качестве препарата для лечения клинической депрессии [47].

Генетические механизмы патогенеза депрессивных состояний

Большую роль в развитии депрессии играют генетические факторы. Значительное развитие инструментов современной биологии позволяет детально изучать генетические аспекты этого расстройства. Так, показано, что 31–42% случаев депрессии ассоциированы с наследственными факторами [38].

Современные исследования в области медицинской генетики сосредоточены на поиске полиморфизмов, связанных с различными патологиями, в том числе c психическими расстройствами. Так, в промоторе гена транспортера серотонина (SLC6A4) найден полиморфизм 5HTTLRP (44bp Ins/Del) [53], ассоциированный с увеличенным риском развития депрессии и более тяжелой симптоматикой [54, 55]. Кроме SLC6A4, обнаружены полиморфизмы в генах рецептора серотонина (5HT1A), моноаминоксидазы А (МАОА), триптофангидроксилазы 2 (TPH2), нейронального регулятора роста 1 (Neuronal growth regulator 1, NEGR1) и др. [56]. Выявлена ассоциация с депрессией и гена аполипопротеина Е (APOE) [55]. У носителей аллеля ԑ4 выявлена атрофия гиппокампа, церебральный гипометаболизм, накопление бета-амилоида [57]. Этот полиморфизм вовлечен в патогенез БА, а так как заболевание часто сопровождается депрессивной симптоматикой, то эти изменения могут быть вовлечены в формирование аффективных расстройств [55].

Один из наиболее изученных и тесно ассоциированных с депрессивными состояниями полиморфизмов – Val66Met гена BDNF [58]. Показано, что у носителей аллеля Met снижен объем гиппокампа и усилен ответ миндалины на негативные стимулы, изменения секреции BDNF [56]. В патогенез депрессии вовлечен и SNP в гене CREB1, связанном с выработкой нейротрофина [56], а также гены многих других систем: FKBP5, μ-рецептора 1 опиоидов (μ-type opioid receptor 1, OPRM1), рецепторов дофамина (DRD2, DRD4) и др. [56, 59].

Таким образом, в основе предрасположенности к депрессивным состояниям лежит большое число генов, вовлеченных в работу ЦНС. Тем не менее, SNP определяют лишь более высокую вероятность развития депрессии. Под влиянием факторов окружающей среды могут возникать эпигенетические перестройки генома, которые также играют большую роль в развитии депрессивных расстройств [60, 61].

Нарушение выработки нейротрофинов как механизм патогенеза депрессивных состояний

Реализация функций ЦНС базируется на генерации, трансформации и хранении информации в нейронных сетях, что тесно связано с процессами нейрогенеза, ангиогенеза и синаптической пластичности. Стресс и депрессивные расстройства нарушают динамический баланс работы ЦНС, что лежит в основе нейропластической или нейротрофической теории развития депрессии [74]. Показано, что трофические факторы, такие как BDNF, фактор роста нервов (NGF), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), фактор роста глии (GDNF) и др. обеспечивают процессы нейрогенеза, ангиогенеза, выполняют нейропротекторную функцию и принимают участие в процессах синаптической пластичности [74–76]. Наиболее изучена связь с синаптическими процессами и ассоциация с депрессией фактора BDNF, относящегося к семейству нейротрофинов [77]. BDNF связывается с рецептором TrkB и опосредует через него свои эффекты [77]. Связывание BDNF с рецептором приводит к лиганд-рецепторной димеризации и аутофосфорилированию остатков тирозина во внутриклеточном киназном домене рецептора и может индуцировать три основных внутриклеточных каскада (рис. 2): 1) путь Ras-MAPK; 2) сигнальный путь PLCγ; 3) сигнальный путь PI3K [78, 79].

Рис. 2.

Сигнальные пути BDNF–TrkB. Активация рецепторов TrkB приводит к индукции трех сигнальных путей. 1 – Путь PI3К [80]. PI3K может активироваться за счет Ras-зависимого механизма или независимо за счет трансмембранных рецепторов. В процессе внутриклеточной передачи сигналов PI3K индуцирует активацию PDK1, которая, в свою очередь, фосфорилирует протеинкиназу Akt [79]. Помимо участия в регуляции транскрипции Akt фосфорилирует несколько белков, регулирующих выживаемость клеток, в частности, может ингибировать апоптоз. Фосфорилированная Akt также влияет на сигнальный путь mTOR [78], приводящий к пролиферации клеток. 2 – Путь PLCγ [81]. Фосфорилирование остатков тирозина вызывает активацию PLCγ. Активированная форма расщепляет PIP2 до IP3 и DAG [78]. IP3 индуцирует выброс внутриклеточного Ca²⁺ и активацию CAMK. DAG стимулирует образование DAG-регулируемой PKC. Внутриклеточный каскад влияет на транскрипционную активность генов и вносит вклад в нейропластические процессы [79]. 3 – Путь Ras-MAPK [80]. Фосфорилирование остатков тирозина в околомембранном пространстве рецептора индуцирует активацию сигнального комплекса околомембранных белков, который, в свою очередь, вызывает активацию GTPазы Ras [79]. Ras связывает и активирует Raf. Raf фосфорилирует MEK, которая фосфорилирует и активирует ERK. Субстраты ERK влияют на транскрипцию ряда генов, ассоциированных с дифференцировкой и выживаемостью нейронов, нейропластическими процессами [82]. В частности, внутриклеточный каскад приводит к фосфорилированию и активации CREB. PI3K – фосфоинозитид-3-киназа, PDK1 – фосфоинозитид-зависимая киназа 1, Akt – серин/треонин-специфичная протеинкиназа RAC, PLCγ – фосфолипаза Сγ, PIP2 – фосфатидилинозитолдифосфат, IP3 – инозитолтрифосфат, DAG – диацилглицерин, CAMK – Сa²⁺/кальмодулинзависимая протеинкиназа, PKC – протеинкиназа С. MAPK – митоген-активируемая протеинкиназа, ERK – внеклеточная сигнал-регулируемая киназа, Raf – протоонкоген, серин/треонин-специфичная протеинкиназа, MEK – киназа MAPK/ERK.

Показано, что BDNF играет важную роль в процессах синаптической пластичности, в основе которой лежит эффект LTP [78]. Ранняя фаза пластических изменений индуцируется повышением уровня Ca²⁺ в результате возбуждения NMDA-рецепторов и активации CaMKII и PKC [78]. Генерация активных форм CaMKII и PKC приводит к фосфорилированию рецепторов AMPA, их миграции и встраиванию в постсинаптическую мембрану. Долговременная LTP опосредуется влиянием сигнальных молекул (PKA, ERK и др.) на активацию факторов транскрипции, включая CREB и трехкомпонентный комплексный фактор (Ternary complex factor, TCF) Elk-1 [83]. Эти факторы обеспечивают синтез белков, вызывающих функциональные изменения в синапсах и структурные изменения в шипиках дендритов. Показано, что на ранней фазе LTP BDNF пресинаптически увеличивает экзоцитоз глутамат-содержащих везикул и постсинаптически индуцирует фосфорилирование и встраивание рецепторов AMPA [78]. На длительном этапе LTP BDNF влияет на синтез белков, регулирует миграцию мРНК в дендритах и распаковку компонентов РНК-содержащих гранул [78].

При депрессивных состояниях нейропластические преобразования в мозгу угнетаются, что приводит к морфологическим и физиологическим нарушениям. Показано, что хронический стресс вызывает атрофию апикальных дендритов в пирамидных нейронах гиппокампа, угнетение нейрогенеза в зубчатой извилине [84], значительное снижение длины и числа апикальных веточек дендритов пирамидных нейронов в префронтальной коре [75]. Показано, что тяжелый стресс приводит к нарушению LTP и усилению долговременной депрессии (Long-term depression, LTD) в нейронах [75].

Изменения BDNF при депрессивных состояниях достаточно хорошо изучены [85, 86]. Так, при клинической депрессии снижается содержание BDNF в сыворотке крови [76]. Снижение уровня BDNF выявлено также в гиппокампе и префронтальной коре мозга жертв суицида [75]. Кроме того, снижение экспрессии гена BDNF, вызванное ХНМС, может опосредовать развитие депрессивно-подобного поведения у животных за счет подавления сигнального пути, опосредуемого MAPK и ERK [82]. Влияние антидепрессантов на экспрессию гена BDNF также подтверждают значительную роль этого фактора в патогенезе депрессии. Недавно показали, что длительный прием антидепрессантов приводит к увеличению уровня мРНК BDNF и TrkB в области гиппокампа [87]. Кроме того, установлено, что использование медикаментов приводит к повышению уровня BDNF в плазме крови [77].

В формирование психических расстройств вовлечен не только BDNF, но и ряд других факторов роста. В частности, в развитии депрессивных состояний принимает участие VEGF, экспрессия гена которого изменяется под воздействием стресса. Показано снижение уровня мРНК VEGF в гиппокампе грызунов, подвергавшихся ХНМС [75]. В развитие депрессии вовлечены и другие факторы, такие как фактор роста фибробластов 2 (Fibroblast growth factor-2 – FGF-2) и NGF. Ассоциацию FGF-2 с патогенезом психопатологии подтверждают данные о снижении экспрессии генов FGF-2 и его рецепторов в лимбических структурах мозга при депрессии [88]. Более того, выявлено противодепрессивное действие FGF-2 при его внутрижелудочковом введении в мозг грызунов [89]. Влияние NGF на патогенез депрессии связывают с его ролью в пролиферации и дифференцировке нейронов [75], процессах синаптической пластичности. У крыс линии Флиндерса, используемых в качестве экспериментальной модели депрессивного состояния, наблюдали снижение уровня NGF, корректируемого с помощью электросудорожной терапии [90].

Таким образом, нейропластические процессы и факторы, их опосредующие, активно вовлечены в патогенез депрессии. Существование связи между коррекцией нейропластических нарушений и ремиссией депрессии указывает на необходимость более широкого изучения роли этих процессов в патогенезе депрессии.

Нейровоспаление и окислительный стресс как механизмы патогенеза депрессивных состояний

К настоящему времени убедительно показано, что депрессивные состояния тесно связаны с иммунологическими процессами и могут провоцироваться иммунными реакциями организма [91]. Нервная и иммунная системы контролируют работу друг друга с помощью двунаправленных механизмов. Например, клетки микроглии в головном мозге участвуют в осуществлении процесса нейрональной пластичности и поддержании гомеостаза [92]. В то же время, нейроны влияют на функционирование микроглии. В частности, в нормальных условиях нейроны выделяют хемокин фракталкин (C-X3-C motif chemokine ligand 1, CX3CL1), колониестимулирующий фактор 1 (CSF1) и трансформирующий фактор роста β (TGF-β), действующие на иммунные клетки [92]. Например, CX3CL1 связывается с рецепторами к фракталкину (CX3CR1) на поверхности клеток микроглии и таким образом регулирует ее нормальное морфологическое и гомеостатическое развитие [92]. Интересно, что у трансгенных мышей с нокаутом гена CX3CR1 нарушено развитие нервной системы, угнетены связи гиппокампа и нейрогенез, появляются признаки депрессивно-подобного поведения [93].

В пользу вовлеченности иммунной системы в процесс развития психопатологии свидетельствуют и данные о том, что более чем у 50% больных, принимающих интерферон-α (IFN-α), в течение нескольких месяцев проявляются клинические признаки депрессии [94]. В плазме крови и спинномозговой жидкости пациентов увеличено содержание провоспалительных цитокинов – фактора некроза опухоли α (TNFα), интерлейкинов (IL) 6 и IL-1 [92]. В доклинических исследованиях наряду с этим обнаружено, что введение низких доз липополисахарида и IL-1β индуцирует нарушение поведения у грызунов (снижение социальной, ориентировочно-исследовательской и половой активности), сопровождающееся выбросом провоспалительных цитокинов, таких как IFN-α, TNFα и IL-6 [95].

Внешнее стрессорное воздействие существенно влияет на гомеостаз иммунной системы и провоцирует нейровоспалительные процессы. Симпатическая система, ассоциированная с работой оси ГГА [92], индуцирует выброс норадреналина, действие которого стимулирует прогениторные иммунные клетки в гемопоэтических органах и опосредует рост числа моноцитов и гранулоцитов, поступающих в кровяное русло [96]. В результате воздействия стрессорных агентов в организме активируются индуцированные патогеном молекулярные паттерны (Pathogen-associated molecular pattern, PAMP) и молекулярные фрагменты, ассоциированные с опасностью (Damage-associated molecular pattern, DAMP). Показано, что эти сигнальные пути осуществляют свою работу через активацию Toll-подобных рецепторов (TLR) и рецепторов усиленного гликилирования конечных продуктов (Receptor for advanced glycation end products, RAGE), что провоцирует выброс провоспалительных цитокинов [97].

Влияние стресса нарушает нормальное взаимодействие микроглии и нейронов. На молекулярном уровне подобное воздействие приводит к индукции сигнального пути ядерного фактора NF‑κB [95]; цитокины TNFα и IL-1 связываются со своими рецепторами на клетке и активируют латентный каскад реакций, что приводит к фосфорилированию ингибитора NF-kB (IκBα) за счет IκB-киназы (IKK) и к деградации IκBα, который в норме подавляет NF‑κB. Таким образом, NF‑κB активируется и проникает в ядро, где функционирует в качестве фактора транскрипции и индуцирует транскрипцию генов сотен провоспалительных белков, включая цитокины, хемокины и циклооксигеназу 2 (СOX2) [98].

В иммунном ответе на стресс участвует также молекулярный каскад, затрагивающий инфламмасому NLRP3 [99]. Активация инфламмасомы приводит к высвобождению провоспалительного IL-1β, в чем участвуют несколько процессов. Так, лиганды рецептора стимулируют транскрипцию и трансляцию про-IL-1β. Кроме того, АТР индуцирует сборку комплекса инфламмасомы и активирует каспазу-1, которая опосредует превращение предшественника IL-1β в зрелую форму [99]. Ассоциация системы инфламмасомы с депрессивной симптоматикой подтверждается данными о повышении экспрессии NLRP3 у пациентов с депрессией, не получающих лечение, что коррелирует с уровнем IL-1β в сыворотке крови и тяжестью заболевания [38].

На участие нейровоспаления в патогенезе депрессии указывают данные о влиянии антидепрессантов на иммунную систему. Например, показано, что их применение снижает содержание IL-6, TNFα, IL-10 и хемокина CCL-2 в крови [15]. Кроме того, сами нейровоспалительные процессы могут усиливать резистентность к медикаментозной терапии. Показана корреляция между увеличением экспрессии генов провоспалительных медиаторов и снижением ответа на терапию антидепрессантами [100].

Потенциально перспективными для лечения депрессии могут стать препараты, действие которых направлено на иммунную систему. Например, блокада рецепторов к PAMP и DAMP снижает выраженность депрессивной симптоматики [92], а у мышей с нокаутом гена инфламмасомы отсутствуют проявления депрессивно-подобного поведения после ХНМС [99]. Таким образом, препараты, обладающие противовоспалительным действием, могут быть перспективными при депрессивных расстройствах, в первую очередь, при терапевтически резистентной депрессии.

Свой вклад в патогенез депрессивных состояний вносит и окислительный стресс [101, 102]. Активные формы кислорода и азота играют важную роль в функционировании клеток. Однако их чрезмерное образование может быть причиной структурных и функциональных изменений, повреждающих клетку. Результаты клинических и доклинических исследований показали, что униполярная и биполярная депрессия ассоциированы с окислительным стрессом [103]. Так, при депрессивных состояниях увеличивается продукция малонового диальдегида (MDA), маркера перекисного окисления липидов, и 8-изо-простагландина F2, маркера окисления арахидоновой кислоты [103, 104]. У лиц с депрессивными расстройствами зафиксировано нарушение работы антиоксидантной системы. В частности, наблюдается снижение концентрации витаминов Е и С в плазме крови, уровней цинка, глутатиона, коэнзима Q10, понижение активности супероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы [105]. Роль окислительного стресса в депрессии подтверждается генетическими исследованиями, показавшими ассоциацию SNP генов, вовлеченных в контроль окислительной системы, с проявлениями депрессии [103].

Предполагается, что вклад окислительного стресса в патогенез депрессии тесно связан с нейровоспалением [103]. В различных типах клеток такие цитокины, как IL-1, TNFα и IFN-α индуцируют образование активных форм кислорода, задействуя комплекс NADPH-оксидазы (NOX) [105]. С другой стороны, сам окислительный стресс также может индуцировать процессы нейровоспаления через активацию путей NF-κB и MAPK [103]. Окислительный стресс может также приводить к развитию депрессивной симптоматики через активацию пути катаболизма триптофана (TRYCAT), что индуцирует повышение образования NO и повреждение клеток [106]. Окислительный стресс также может вызывать изменения в системе глутамата, снижая уровень внутриклеточного глутатиона и индуцируя окислительную глутаматную токсичность [107]. Кроме того, стресс провоцирует нарушения в работе митохондрий, что стимулирует образование активных форм кислорода [103]. Таким образом, окислительный стресс также играет роль в возникновении депрессивных состояний, тесно пересекаясь с процессами нейровоспаления.

В целом, патогенез депрессии регулируется множеством процессов, которые затрагивают различные уровни организации и разнообразные молекулярные каскады. Тем не менее, невозможно выделить единственную причину развития патологических процессов, определяющую течение и развитие заболевания. Гетерогенная природа развития депрессивных патологий существенно осложняет поиск подходов к терапии депрессии как таковой, так и к лечению депрессивных состояний, ассоциированных с другими заболеваниями. Детальное исследование комплекса процессов, вызывающих депрессию, а также их взаимодействие между собой может способствовать поиску новых и усовершенствованию известных методов лечения депрессивных состояний.

Методы создания нокаутных и трансгенных животных

Благодаря достижениям генетики и молекулярной биологии становится возможным изучение роли отдельных генов, молекул и нейронов в развитии пcихоневрологических нарушений. Современные экспериментальные инструменты позволяют выборочно “включать” или “выключать” искомые гены в живых организмах и исследовать их роль в различных процессах. Методы получения трансгенных животных и животных с “выключенным” геном (нокаутом) базируются на феномене гомологичной рекомбинации – способности обмениваться участками ДНК. С помощью этого процесса можно встраивать в геном поврежденный участок ДНК (чтобы выключить ген) или нужный новый участок (чтобы получить трансгенных животных) [169]. В основе нокаута гена лежат несколько процессов, таких как получение и клонирование необходимого гена, применение генетических конструкций для селекции, использование линии эмбриональных стволовых клеток ES [170], внедрение измененных клеток в гаметы и выведение генно-модифицированного потомства [171]. В качестве конструкций, внедряемых в ДНК, чаще всего применяют ген резистентности к неомицину (ген neo) и ген тимидинкиназы вируса простого герпеса (HSV-tk), помещаемый вне гомологичной области и чувствительный к воздействию противовирусного препарата ганцикловира [171]. Полученную генетическую конструкцию вводят в клетки ES, которые помещают на питательную среду, содержащую аналог неомицина G418 и ганцикловир, что позволяет отбирать клетки с необходимыми свойствами. Клетки, в которые конструкция не встроилась, погибают от G418; клетки, в геном которых конструкция встроилась случайным образом и несет оба гена (neo и HSV-tk), погибают от ганцикловира. Только клетки, содержащие подходящий гомологичный ген, в котором и произошла гомологичная рекомбинация, выживают на питательной среде. Подобные модифицированные клетки вводят в эмбрионы мыши на стадии бластулы или морулы и имплантируют в матку самке, стимулированной гормональными препаратами. От такой самки рождаются мышата, часть половых клеток которых содержит полноценный испорченный ген. После инбридинга получают мышей, гомозиготных по данному гену, от которых можно получить нокаутную линию [169].

Для создания трансгенных животных используют векторы, содержащие последовательность ДНК искомого гена, а также промоторные и энхансерные участки [172]. Вектор в большом количестве копий вводят в оплодотворенную яйцеклетку самки мыши. Он быстро встраивается в гомологичные участки генома или в случайные места, если гомология отсутствует. Подобную измененную яйцеклетку вводят в половые пути другой самки. Часть полученных мышат несет искомый трансген, но в гетерозиготном состоянии [172]. Затем мышат скрещивают между собой для получения гомозиготных трансгенов. Использование индуцибельных и тканеспецифичных промоторов позволяет изменять гены только в определенных типах клеток или только под влиянием определенных факторов-индукторов, что позволяет исследовать тканеспецифическую роль генов в различных процессах [169].

Среди различных специфичных промоторов можно выделить два основных, наиболее часто используемых в современной нейробиологии. Это промоторы генов CaMKIIα и EMX1 [169]. Промотор CaMKIIα позволяет мутации проявляться только в возбуждающих нейронах неокортекса и гиппокампа на ранних этапах развития организма [173]. EXM1 экспрессируется также на ранних стадиях развития и затрагивает такие зоны мозга, как кора, обонятельные луковицы и гиппокамп. Использование данного промотора может быть полезным для изучения механизма гиппокампзависимого формирования памяти [169]. Существование подобных механизмов позволяет значительно усовершенствовать подходы к изучению функций различных молекул в ЦНС.

Разработка систем сайт-специфической прижизненной рекомбинации ДНК открыла возможности более детального изучения работы отдельных генов в мозгу на протяжении жизни. Первой подобной системой стала система Cre/lox-рекомбинации [174], наиболее распространенная и по сей день. В данной системе по краям интересующего гена встраивают сайты loxP, которые узнаются Cre-рекомбиназой и заменяют ген, что делает возможным получение “условных нокаутов” [175]. Технология позволяет заменять ген при помощи Cre только в тех тканях, где Cre экспрессируется, что обеспечивает пространственную специфичность. Помимо создания условных нокаутов эту систему можно использовать и для активации или подавления экспрессии генов в определенных структурах. Так, например, за счет рекомбинации участка, содержащего терминаторную последовательность, можно добиться селективного повышения экспрессии гена в областях, экспрессирующих Cre [175].

Таким образом, к настоящему моменту разработано большое количество инструментов, способных регулировать работу генов в различных структурах мозга или в организме в целом. Так, создаются линии грызунов с нокаутом генов, ассоциированных с развитием депрессии: 5-HT_1A, 5-HT_1B, SERT, МАО, ГАМК, нейропептида Y (NPY) и др. [176]. Одной из часто используемых генетических моделей депрессии являются мыши, трансгенные по GR. Так, мутантные гетерозиготы (GR^+/–) характеризуются более высоким уровнем беспомощности и меньшим процентом избеганий тока в челночной камере [177], что свидетельствует о более низкой устойчивости к стрессу. Кроме того, мышы с селективным нокаутом гена GR в области переднего мозга проявляют признаки депрессивно-подобного поведения и нарушения работы обратной связи в системе ГГА [177]. Таким образом, подобные исследования позволяют связать функционирование отдельных генов с поведенческими реакциями и изучать патогенез патологических состояний, в том числе, оценивать взаимосвязь между развитием депрессии и нарушением определенных структур мозга.

Метод CRISPR/Cas редактирования генома

Одна из самых перспективных технологий редактирования генома – система CRISPR/Cas. Похожие методы существовали и до разработки CRISPR/Cas (нуклеазы, содержащие цинковые пальцы (ZFN) и эндонуклеазы TAL (Transcription activator-like effector nucleases, TALEN)), однако они оказались менее эффективными и более дорогими [178]. Среди разнообразных типов CRISPR/Cas наиболее удобной считается система CRISPR/Cas второго типа, включаяющая эндонуклеазу Cas9 (CRISPR-ассоциированный белок 9) [179]. В наиболее частом варианте CRISPR/Cas9 состоит из двух основных компонентов: Cas9, которая разрезает ДНК, и единой направляющей РНК (sgРНК) – химерного комплекса из crРНК и trackРНК [180]. Этот комплекс помогает получать нокаутных животных следующим образом: sgРНК обеспечивает поиск гена-мишени, а ассоциированная с ней Cas9 производит двухцепочечный разрыв ДНК [180]. Для корректной работы эндонуклеазы выбранная мишень должна соседствовать с последовательностью протоспейсерного смежного мотива PAM (5‵NGG, где N – любой нуклеотид) [169]. В дальнейшем репаративная система клетки удаляет разрыв ДНК с помощью системы негомологичного соединения концов (Non-homologous end joining, NHEJ) или путем гомологичной рекомбинации [173]. В результате NHEJ возникают вставки или делеции, которые нарушают рамку считывания и приводят к нарушению работы гена-мишени [180]. Вариант NHEJ может быть удобен для получения нокаута, в то время как гомологичную рекомбинацию, заменяющую участок ДНК, можно использовать для замены поврежденного гена на здоровый или другой искомый ген.

Показано, что наряду с удалением участка ДНК, воздействие системы CRISPR/Cas9 может приводить к одноцепочечному разрыву молекулы. Это достигается с помощью никазы Cas9 (nCas9), которая вносит одноцепочечный разрыв [178]. Кроме того, использование поврежденной Cas9 (dCas9 – dead Cas9) способствует регуляции транскрипционной активности определенных белков. Подобная эндонуклеаза не способна разрезать ДНК, но может служить своего рода матрицей для транскрипционных активаторов, репрессоров и модификаций хроматина для изменения экспрессии гена-мишени [181]. Интересно, что dCas служит также для создания конструкций с флуоресцентыми белками, что позволяет метить нужные мишени [181].

Таким образом, технология CRISPR/Cas открывает большие перспективы в дальнейших научных и медицинских разработках, в том числе, способствует выявлению механизмов патогенеза депрессии. Несмотря на ряд преимуществ, связанных с удобством и быстротой метода, а также его относительно невысокой стоимостью, технология имеет некоторые недостатки, такие как неполная избирательность эндонуклеазы Cas9 при формировании разрывов ДНК. Так, система может не учитывать некоторые расхождения в искомой последовательности и приводить к повреждению генома. Еще один ограничивающий фактор – необходимость расположения последовательности PAM рядом с геном-мишенью, что в некоторой степени сужает выбор потенциального гена-кандидата для нокаута. Несмотря на приведенные рамки, этот метод предоставляет большие возможности для изучения заболеваний человека и разработки эффективных методов терапии.

Оптогенетические и хемогенетические подходы

Один из наиболее перcпективных современных методов исследования как патогенеза психических расстройств, так и работы ЦНС – оптогенетика. Этот метод основан на внедрении методами генетической инженерии в нейроны специальных ионных каналов – опсинов, активирующихся в ответ на возбуждение светом определенной длины волны [182, 183]. Активация канала может привести к деполяризации или гиперполяризации клетки в зависимости от типа используемого опсина. Таким образом, воздействуя на определенные нейроны, можно индуцировать появление специфического типа поведения и исследовать вклад определенных групп нейронов в различные реакции, включая депрессивно-подобное поведение [184]. Разработка метода оптогенетики стала возможной благодаря обнаружению в клетках водоросли Chlamidomonas reinhardtii светоуправляемых анионных каналов – каналродопсинов, способных деполяризовать культуры клеток млекопитающих в ответ на свет и контролировать таким образом уровень их активности [185]. К настоящему моменту в оптогенетике наиболее часто используют два опсина – каналродопсин 2 (СhR2) и галородопсин из архебактерии Natromonas pharaonic [184]. Воздействие голубого света (примерно 470 нм) на ChR2 приводит к открытию Na⁺-каналов и деполяризации нейронов, что увеличивает уровень их активности. Галородопсин активируют желтым светом (примерно 580 нм), который вызывает открытие Cl-канала и соответствующую гиперполяризацию клеток [184]. Ген опсина можно встраивать в нейроны определенного типа, используя клеточноспецифичный промотор и лентивирусный или аденовирусный вектор [186]. Для изучения определенной структуры мозга конструкция вводится стереотаксически [186]. Повысить специфичность встраивания каналов в нейроны определенного типа можно с помощью технологии Cre-рекомбинации. При использовании трансгенных линий грызунов, экспрессирующих Cre-рекомбиназу только в определенных популяциях клеток, можно добиться встраивания опсинов только в данные клетки [185]. После встраивания каналов в структуры мозга крыс прижизненно облучают светом определенной длины волны при помощи оптоволокна или лазера. Для проникновения облучения на нужную глубину оптоволокно имплантируют внутрь тканей мозга. При проведении поведенческих тестов, направленных на оценку депрессивно-подобного поведения, подобные манипуляции могут показать вклад определенных структур мозга в поведенческие реакции.

Наряду с оптогенетическими технологиями в последние годы активно развивается метод прижизненного контроля нейронов, основанный на воздействии химических веществ – хемогенетика. В этом случае специальные белки генетически встраиваются в определенные клетки и селективно активируются небольшими триггерными молекулами [184]. Наиболее часто используются оригинальные рецепторы, эксклюзивно активируемые оригинальными препаратами (Desighner Receptors Exclusevely Activated by Desighner Drugs, DREADD) [187]. Они представляют собой модифицированные мускариновые рецепторы, связанные с G-белком, которые также встраивают в нужные нейроны при помощи вирусных векторов [186]. Первые DREADD представляли собой три Gq-связанных мускариновых рецептора: hM1Dq, hM3Dq, hM5Dq. Gq DREADD – это деполяризующие рецепторы [186], которые активируются клозапин-N-оксидом (CNO) и используют внутриклеточный кальций в качестве вторичного посредника [184]. Gi-связанные рецепторы (hM2Di, hM4Di, KORD – k-opioid-derived DREADD), наоборот, подавляют активность нейронов. Рецепторы hM2Di и hM4Di также активируются CNO, а рецепторы KORD – сальвинорином B [184]. В целом, реакция нейронов зависит от типа G-белка, ассоциированного с рецептором, и каскада реакций, вызываемого им. Технология встраивания рецепторов в специфичные клетки мозга аналогична технологии, используемой в оптогенетике, в ней также применяют вирусные векторы, Cre-рекомбинацию и стереотаксическое введение конструкций. В отличие от оптогенетических подходов она не требует имплантирования оптоволоконной канюли в ткани мозга, ее действие опосредуется введением веществ-лигандов.

Технологии оптогенетики и хемогенетики пролили свет на многие функции ЦНС и поведенческие реакции, ассоциированные с различными расстройствами, в том числе с депрессией. Например, выявлен вклад активации вентромедиальной префронтальной коры и путей, ассоциированных с ней, в депрессивное поведение [184]. Оптогенетическая стимуляция глутаматергических нейронов вентромедиальной префронтальной коры индуцировала противодепрессивные эффекты в тесте подвешивания за хвост [188], а хемогенетическая стимуляция коры предотвратила развитие депрессивно-подобного состояния, вызванного ранним отлучением мышей от матери [188]. В оптогенетических и хемогенетических исследованиях показана роль и других структур в формировании депрессивно-подобного поведения, таких как прилежащее ядро, вентральная область покрышки, гиппокамп, миндалина, ядро шва и др. [188, 189].

В целом, эти подходы открывают большие перспективы в исследовании нейрональных процессов и имеют ряд преимуществ по сравнению со многими другими методами [182, 187, 190]. Так, появляется возможность прижизненного контроля работы нейронов и изучения вклада тех или иных популяций клеток в поведенческие процессы. Кроме того, эти методы высокоспецифичны. Тем не менее, и они имеют свои недостатки. Например, в оптогенетике значительным ограничением является низкая степень проникновения света в ткани мозга, что затрудняет эксперименты с более крупными живыми организмами, такими как нечеловекообразные приматы [186]. Также открытым остается вопрос о длительности и частоте стимуляции, так как подчас разный тип воздействия на одни и те же структуры может приводить к различным поведенческим реакциям [184]. Хемогенетические методы отличаются более низкой скоростью реакций из-за способа активации рецепторов, кроме того, возможно влияние самого лиганда на поведение животных, что ограничивает применение данного подхода. Тем не менее, подобные методы однозначно вносят существенный вклад в понимание работы ЦНС и нейробиологических процессов, ассоциированных с тревогой, депрессией и другими эмоциональными проявлениями.

Клинический анализ данных с использованием GWAS

Механизмы депрессивных состояний изучают также с использованием методов анализа клинических данных. Они основаны, в первую очередь, на поиске генетических основ депрессии. Существует несколько подходов к поиску таких мишеней. В частности, анализ групп сцепления, изучение генов-кандидатов и расшифровка последовательности генома [191]. Тем не менее, в связи с тем, что депрессия представляет собой полиморфное и полигенное заболевание [192], эти подходы оказываются малоэффективными для понимания ее патогенеза. Наиболее перспективным считается GWAS [193], в основе которого лежит сравнение геномов контрольной популяции и больных, в частности, выявление SNP, играющих большую роль в возникновении разнообразия генома человека [136]. Исследования охватывают огромные массивы данных в связи с большим (сотни тысяч) разнообразием возможных SNP.

Для исследований используют образцы ДНК, полученные из слюны, крови и других биологических материалов. Сам анализ проводят методом логистической регрессии с зависимым статусом переменной случай–контроль (0=контроль, 1=случай) и SNP в качестве независимой переменной, что позволяет выявлять ассоциации различных полиморфизмов с патологией. Так как GWAS выполняют для каждого SNP с целью исключения ошибки первого рода (ложноположительные результаты), то требуется соответствие кумулятивного значения вероятности (p) значению не более 5 × 10^–8, точная репликация участков в разных выборках и тесная ассоциация показателей [136].

Предполагается, что генетические полиморфизмы могут приводить к развитию психических расстройств в результате совместного действия сотен и тысяч различных распространенных SNP, каждый из которых по отдельности оказывает незначительный эффект, или воздействия множества редких SNP, которые нарушают структуру гена и поэтому обладают сильным эффектом [136]. В связи со значительной полигенностью депрессии ее возникновение вызвано, скорее всего, воздействием множества распространенных полиморфизмов [192]. В целом, к настоящему моменту при помощи GWAS выявлены 102 генетические вариации, ассоциированные с клинической депрессией [194]. Предположительно, расширение анализируемых выборок будет способствовать выявлению новых генетических ассоциаций.

Таким образом, данные GWAS могут способствовать пониманию механизмов патогенеза депрессии. Кроме того, изучение локальных причин формирования депрессивных состояний может способствовать определению причин различных форм депрессии и подбору направленной терапии с высокой степенью эффективности.