Молекулярная биология, 2020, T. 54, № 6, стр. 1029-1036

Прямой молекулярный фишинг цинкзависимых белковых партнеров бета-амилоида 1–16 с “Тайваньской” (D7H) мутацией и с фосфорилированным остатком Ser8

П. В. Ершов a, Ю. В. Мезенцев a, Е. О. Яблоков a, Л. А. Калужский a, А. С. Иванов a, Н. В. Гнучев b, В. А. Митькевич b, А. А. Макаров b, С. А. Козин b*

a Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича
119121 Москва, Россия

b Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук
119991 Москва, Россия

* E-mail: kozinsa@gmail.com

Поступила в редакцию 11.06.2020
После доработки 10.07.2020
Принята к публикации 10.07.2020

Полный текст (PDF)

Аннотация

Ранее методом прямого молекулярного фишинга мы показали, что металлсвязывающий домен интактного бета-амилоида (Aβ(1–16)) в цинкзависимой манере участвует во взаимодействиях с рядом белков из цитозольной фракции клеток нейробластомы человека SK-N-SH. Известно, что наследственные мутации в Aβ(1–16), ускоряющие развитие болезни Альцгеймера, а также посттрансляционные модификации аминокислотных остатков могут существенно влиять на структуру домена в присутствии ионов цинка. В настоящей работе с использованием методологии прямого молекулярного фишинга (совмещенный метод аффинного выделения и масс-спектрометрической идентификации) выявлены белки цитозоля клеток SK-N-SH, способные образовывать цинкзависимые нековалентные комплексы с Aβ(1–16) с “Тайваньской” (D7H) мутацией и с Aβ(1–16) с фосфорилированным остатком Ser8. Показано, что белки-партнеры металлсвязывающих доменов этих изоформ Aβ отличались от белков-партнеров домена Aβ(1–16). В то же время домен Aβ(1–16) с “Английской” (H6R) мутацией и домен Aβ(1–16), содержащий одновременно изомеризованный остаток Asp7 и фосфорилированный Ser8, в аналогичных экспериментальных условиях не взаимодействовали с цитозольными белками. Полученные результаты полезны для разработки методов рационального модулирования белок-белковых взаимодействий с участием природных изоформ бета-амилоида, они также указывают на возможную роль бета-амилоида с фосфорилирированным Ser8 в качестве молекулы, вовлеченной в нормальные физиологические процессы.

Ключевые слова: болезнь Альцгеймера, бета-амилоид, изоформы, металлсвязывающий домен, цинк, белок-белковые взаимодействия, клетки SK-N-SH

ВВЕДЕНИЕ

В развитии болезни Альцгеймера (БА) ключевым молекулярным агентом наряду с белком тау является бета-амилоид (Aβ) – гетерогенный по C-концу полипептид (с длиной основной цепи до 43 аминокислотных остатков) и его различные генетические и химически модифицированные изоформы [1]. В образовании внеклеточных фибриллярных агрегатов Aβ (амилоидных бляшек), характерных для БА [2], критическую роль играют нековалентные комплексы Aβ с ионами цинка [3]. Эти комплексы выступают в качестве зародышей цинкзависимой олигомеризации и агрегации эндогенных молекул Aβ [4]. Модуляторами образования таких зародышей могут быть различные биомолекулы [5], при этом идентификация белков, которые образуют цинкзависимые комплексы с Aβ, представляет особый интерес для разработки антиамилоидной терапии БА [68].

N-концевой фрагмент 1–16 – металлсвязывающий домен интактного Aβ и его различных изоформ [914], представляет собой часть Aβ, необходимую и достаточную для экзогенного инициирования образования амилоидных бляшек в животной модели БА [15]. В этом домене (Aβ(1–16)) найдены три аминокислотные замены, отличающие Aβ невосприимчивых к БА мышей и крыс от подавляющего большинства остальных млекопитающих (включая человека), подверженных данной нейродегенеративной патологии [16, 17]. Также именно в металлсвязывающем домене Aβ встречаются модификации и мутации аминокислотных остатков, которые резко ускоряют развитие БА [18, 19].

Ранее мы показали, что иммобилизованные синтетические пептидные аналоги металлсвязывающего домена природных изоформ Aβ можно рассматривать как адекватную in vitro модель полноразмерных молекул Aβ для исследования с помощью биосенсора на эффекте поверхностного плазмонного резонанса [20] цинкзависимых взаимодействий Aβ с молекулами различных классов, включая белки, пептиды, нуклеиновые кислоты и низкомолекулярные соединения [2127]. С использованием этого подхода уже установлены белки-партнеры (из цитозольной фракции клеток SK-N-SH) интактного Aβ(1–16) [28]. Получены существенные экспериментальные свидетельства критического влияния “Английской” (H6R) и “Тайваньской” (D7H) мутаций, а также фосфорилирования Ser8 и изомеризации Asp7 на структурно-функциональные свойства металлсвязывающего домена Aβ [4, 15, 19, 23, 2935]. В настоящей работе методом прямого молекулярного фишинга [36, 37] показано как эти мутации и модификации влияют на репертуар потенциальных цинкзависимых белков-партнеров Aβ(1–16) из цитозольной фракции клеток SK-N-SH.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Синтетические пептидные аналоги металлсвязывающего домена интактного Aβ и четырех его изоформ (табл. 1) получены от “Biopeptide Co., LLC” (США). На С-конце пептидов находится тетраглицилцистеин (-GGGGC).

Таблица 1.  

Синтетические пептидные аналоги металлсвязывающего домена изформ Аβ, использованные в работе

Обозначение Аминокислотная последовательность Описание
Aβ(1–16) DAEFRHDSGYEVHHQK-GGGGC Интактный Aβ(1–16)
pS8-Aβ(1–16) DAEFRHDpSGYEVHHQK-GGGGC Aβ(1–16) с фосфорилированным остатком Ser8
D7H-Aβ(1–16) DAEFRHHSGYEVHHQK-GGGGC Aβ(1–16) с заменой Asp7 на His (“Тайваньская” мутация)
isoD7-pS8-Aβ(1–16) DAEFRH[isoD]pSGYEVHHQK-GGGGC Aβ(1–16) с изомеризованным Asp 7 и фосфорилированным Ser8
H6R-Aβ(1–16) DAEFRRDSGYEVHHQK-GGGGC Aβ(1–16) с заменой His6 на Arg (“Английская” мутация)

Цитозольную фракцию клеток получали по следующей методике. Клетки нейробластомы человека SK-N-SH культивировали на среде RPMI-1640 (“Invitrogen”, США), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (“Invitrogen”), 2 мМ глутамина (“ПанЭко”, Россия), 100 Ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (“ПанЭко”), при температуре 37°С в атмосфере 5% СО2. Перед лизированием клетки осаждали центрифугированием в течение 10 мин при 100 g и промывали в PBS-буфере. Для лизирования 1 млн. клеток брали 30 мкл RIPA-буфера (25 мМ Tрис-HCl pH 7.6, 150 мМ NaCl, 1% NP-40, 1% дезоксихолата натрия, 0.1% додецилсульфата натрия, 0.2 мМ PMSF, ингибиторы протеаз – 1 таблетка на 10 мл буфера). Полученную суспензию клеток инкубировали в течение 1 ч при +4°С и постоянном перемешивании. Лизат клеток центрифугировали в течение 10 мин при 16 000 g. Отбирали супернатант (лизат цитозольной фракции клеток SK-N-SH) и определяли в нем концентрацию белка по методу Лоури.

Анализ методом поверхностного плазмонного резонанса выполняли на оптическом биосенсоре Biacore 3000 (“GE Healthcare”, США) при 25°С. Пептид Aβ(1–16) и его модифицированные варианты ковалентно иммобилизовали на поверхности рабочих каналов четырехканальных чипов СМ5 через сульфгидрильные группы С-концевого цистеина (-GGGGC) по ранее использованному протоколу [28]. Для каждого чипа первый канал, свободный от иммобилизовнных пептидных лигандов, использовали в качестве контрольного. Результирующий сигнал биосенсора представлял собой разницу сигналов рабочего и контрольного каналов (коррекция вклада неспецифического связывания с поверхностью чипа). В качестве рабочего буфера использовали 50 мМ HEPES (pH 6.8), содержащий 100 мкМ ZnCl2 (Буфер А). Лизат цитозольной фракции клеток SK-N-SH, разведенный буфером А в 40 раз, вводили в биосенсор течение 5 мин при скорости потока 10 мкл/мин (n = 5).

Подготовку аффинного сорбента выполняли по следующему протоколу. Каждый из пептидов, соответствующих металлсвязывающему домену исследуемых изоформ Aβ (табл. 1), иммобилизовали через сульфгидрильные группы С-концевого цистеина (-GGGGC) на инертный сорбент тиол-сефарозу 4В (“GE Healthcare”) согласно протоколу компании-производителя. Не прореагировавшие с пептидом 2-тиопиридильные группы сорбента инактивировали 5 мМ раствором 2-меркаптоэтанола в течение 5 мин. Уровень иммобилизации пептидов (около 3.5 мг на 1 г сухого сорбента) оценивали спектрофотометрически на мультимодульном планшетном ридере ClarioStar (“BMG LABTECH”, Россия) при длине волны 343 нм согласно протоколу компании-производителя сорбента. Контрольный сорбент (без иммобилизации пептидов) готовили аналогично, но без добавления пептидов. Далее суспензию аффинного (или контрольного) сорбента помещали в микроколонку с внутренним объемом 150 мкл и длиной 12 см, которую устанавливали в хроматограф AKTA Purifier 10 (“GE Healthcare”).

Лизат цитозольной фракции клеток SK-N-SH, разведенный буфером А до конечной концентрации общего белка 0.5 мг/мл, пропускали через микроколонку с сорбентом в течение 80 мин при скорости потока 50 мкл/мин. Элюирование белков лизата, аффинно связавшихся с иммобилизованными на сорбенте пептидами Aβ, выполняли буфером Б, содержащим 10 мМ HEPES (pH 7.4), 150 мМ NaCl, 50 мМ 2-меркаптоэтанола, 3 мМ EDTA, 0.05% Tween 20, в течение 100 мин при скорости потока 50 мкл/мин. В дополнительных экспериментах по аффинному выделению белков лизата, связавших пептиды Аβ, иммобилизованные на сорбенте, использовали буфер А без добавления ионов цинка (ZnCl2), т.е. 50 мМ HEPES (pH 6.8). Содержание общего белка в элюатах оценивали спектрофотометрически по методу Брэдфорда при длине волны 595 нм на мультимодульном планшетном ридере ClarioStar. Трипсинолиз белковых проб осуществляли по методу FASP (от англ. Filter-Aided Sample Preparation) [38]. LC-MS/MS-анализ образцов триптического гидролизата выполняли с помощью хроматографа Agilent 1200 и масс-детектора Agilent серии 6300 с ионной ловушкой Ion Trap LC/MS фирмы “Agilent Technologies” (США) по протоколу [28], а также на масс-спектрометре micrOTOF-Q II (“Bruker Daltonik GmbH”, Германия) по методике [39, 40]. Масс-спектры обрабатывали с помощью программы Mascot и базы данных SwissProt. В число достоверно обнаруженных включали белки, идентифицированные не менее 2 раз из 3 cо статистической значимостью p < 0.01 и Mascot Score >50.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Ранее мы установили, что 13 белков из цитозольной фракции клеток SK-N-SH образуют специфические нековалентные цинкзависимые комплексы с синтетическим аналогом пептида Aβ(1–16), иммобилизованным (через C-концевой линкер -Gly-Gly-Gly-Gly-Cys) на аффинной колонке [28] (табл. 2). В настоящей работе Aβ(1–16) использовали в качестве положительного контроля при полуколичественном анализе связывания белков цитозольной фракции клеток SK-N-SH со следующими металлсвязывающими доменами: H6R-Aβ(1–16), pS8-Aβ(1–16), D7H-Aβ(1–16) и isoD7-pS8-Aβ(1–16) (табл. 1). Все пять пептидов были иммобилизованы на оптических чипах биосенсора до уровней 1000 ± 50 RU (1 ± 0.05 нг/мм2).

Таблица 2.  

Белки, аффинно выделенные из лизата цитозольной фракции клеток человека SK-N-SH на сорбентах с ковалентно иммобилизованными пептидами: Аβ(1–16), pS8-Аβ(1–16) и D7H-Aβ(1–16)

Белок  Uniprot ID  Субклеточная локализация  Пептид
Аβ
(1–16)*
pS8-Аβ (1–16) D7H-Aβ (1–16)
Фактор элонгации 1-альфа 1 P68104 Ядро, ядрышко, цитозоль, цитоскелет, плазматическая мембрана, кортикальный актиновый цитоскелет   + +
Белок теплового шока 1A/1B 70 кДа P0DMV8 Ядро, цитозоль, центросома, цитоскелет   + +
Белок 1, подобный белку теплового шока 70 кДа P34931 Цитозоль   + +
Белок 6 теплового шока 70 кДа P17066 Цитозоль, цитоскелет   + +
Белок, родственный белку теплового шока 71 кДа P11142 Ядро, цитозоль, экзосома   + +
Белок теплового шока HSP 90-бета P08238 Ядро, цитозоль, внеклеточный матрикс   + +
Белок 2, родственный белку теплового шока 70 кДа P54652 Цитозоль   + +
Вероятный белок 7 теплового шока 70 кДа P48741 Нет данных   + +
Вероятный белок 4 теплового шока HSP 90-бета Q58FF6 Нет данных   + +
Белки 14-3-3 изоформа эпсилон P62258 Ядро, цитозоль +    
Альфа-енолаза P06733 Цитозоль, плазматическая мембрана +    
Аннексин А2 P07355 Экзосома, эндосома, лизосома, клеточная поверхность, цитозоль +    
Субъединица альфа митохондриальной АТР -синтазы P25705 Плазматическая мембрана, митохондрии +    
Белок 2, подобный бету-актину Q562R1 Нет данных +    
Фактор элонгации 1-гамма P26641 Цитозоль +    
Белок теплового шока HSP 90-альфа P07900 Цитозоль +    
Вероятный белок, подобный аннексину А2 A6NMY6 Нет данных +    
Вероятный белок 3, подобный бета актину Q9BYX7 Нет данных +    
Вероятный белок 2 теплового шока HSP 90- бета Q58FF8 Нет данных +    
Вероятный белок А2 теплового шока HSP 90-альфа Q14568 Нет данных +    
Вероятный белок А4 теплового шока HSP 90-альфа Q58FG1 Нет данных +    
Субъединица гамма белка 1 Т-комплекса P49368 Микротрубочки, плазматическая мембрана, шаперониновый Т-комплекс +    
Регулируемый глюкозой белок 78 кДа P11021 Цитозоль, митохондрии, эндоплазматический ретикулум   +  
Альфа-актин скелетной мышцы P68133 Актиновые филаменты, цитоскелет, саркомеры, стрессовые волокна   +  
Фактор элонгации 1 альфа-2 Q05639 Цитозоль   +  
Галектин-1 P09382 Цитозоль   +  
Вероятный белок 3 теплового шока HSP 90-бета Q58FF7 Нет данных     +
Тубулин бета P07437 Микротрубочки, цитозоль, цитоскелет     +
Тубулин бета-1 Q9H4B7 Цитозоль     +
Тубулин бета-3 Q13509 Микротрубочки     +
Тубулин бета-4А P04350 Микротрубочки, цитоскелет, аксонема     +
Тубулин бета-4Б P68371 Микротрубочки, цитоскелет     +
Тубулин бета-6 Q9BUF5 Микротрубочки     +
Тубулин бета-8 Q3ZCM7 Веретено деления     +

* По материалам [28].    Примечание. Связывание белка с соответствующим пептидом обозначено символом “+”.

Образцы лизата цитозольной фракции клеток SK-N-SH вводили в измерительную ячейку биосенсора в качестве аналита. В отсутствие ионов цинка в рабочем буфере специфическое связывание белков лизата со всеми иммобилизованными пептидами не наблюдалось. Этот результат совпадает с данными, полученными ранее для Aβ(1–16)) [28]. В присутствии 100 мкМ ионов цинка общее количество специфически связавшихся цитозольных белков возрастало в ряду: H6R-Aβ(1–16) (практически полное отсутствие связывания) → isoD7-pS8-Aβ(1–16) → pS8-Aβ(1–16) → D7H-→ Aβ(1–16) → Aβ(1–16) (рис. 1). Эти данные позволили предположить, что H6R-Aβ(1–16), pS8-Aβ(1–16), D7H-Aβ(1–16) и isoD7-pS8-Aβ(1–16) могут использоваться в качестве аффинных “наживок” для препаративного выделения белков лизата, специфически связывающихся в присутствии ионов цинка, с их последующей масс-спектрометрической идентификацией.

Рис. 1.

Сигналы связывания белкового материала лизата цитозольной фракции клеток нейробластомы SK-N-SH с иммобилизованными в каналах биосенсора пептидами Aβ(1–16) (1), H6R-Aβ(1–16) (2), pS8-Aβ(1–16) (3), D7H-Aβ(1–16) (4), isoD7-pS8-Aβ(1–16) (5) в присутствии ионов цинка. Планки погрешностей обозначают значения стандартного отклонения (SD) от средней величины (m); m ± SD, (n = 5).

Показано фактическое отсутствие белков (концентрация общего белка $ \ll $1 мкг/мл) в элюатах с аффинных сорбентов в отсутствие ионов цинка в рабочем буфере при хроматографии лизата. Напротив, в присутствии ионов цинка концентрация общего белка в элюатах была ≥25 мкг/мл для pS8-Aβ(1–16) и D7H-Aβ(1–16), в то же время для H6R-Aβ(1–16) и isoD7-pS8-Aβ(1–16) элюат не содержал достаточных для анализа количеств белкового материала. Таким образом, ионы цинка являются необходимыми медиаторами взаимодействий цитозольных белков с pS8-Aβ(1–16) и D7H-Aβ(1–16).

В табл. 2 приведены данные LC-MS/MS-анализа белков цитозольной фракции клеток SK-N-SH, которые специфически связываются в присутствии ионов цинка с pS8-Aβ(1–16) и D7H-Aβ(1–16). Сравнение полученных результатов с данными для Aβ(1–16) из работы [28] показывает, что в идентичных экспериментальных условиях pS8-Aβ(1–16) и D7H-Aβ(1–16) не связываются ни с одним из белков-партнеров Aβ(1–16). При этом pS8-Aβ(1–16) и D7H-Aβ(1–16) имеют девять общих партнеров, и все они представляют собой различные варианты белков теплового шока. Кроме того, D7H-Aβ(1–16) специфически связывается с еще одним из белков теплового шока и с семью различными вариантами тубулинов, а pS8-Aβ(1–16) – с четырьмя индивидуальными белками. Среди 13 партнеров Aβ(1–16) были также четыре белка теплового шока и два варианта бета-актина. Все 13 белков без исключения фигурируют во многих публикациях как потенциальные участники патологических процессов при БА [28]. Полученные данные свидетельствуют о потенциальной способности металлсвязывающих доменов интактного Aβ и двух его изоформ – с “Тайваньской” (D7H) мутацией и с фосфорилированным Ser8 – взаимодействовать в цинкзависимой манере с белками, перечисленными в табл. 2. Однако такие взаимодействия требуют дальнейшей валидации независимыми методами.

Интересно, что в присутствии ионов цинка H6R-Aβ(1–16) и isoD7-pS8-Aβ(1–16) не связывались с цитозольными белками в отличие от pS8-Aβ(1–16) и D7H-Aβ(1–16). Причины этого могут быть связаны со структурирующей ролью ионов цинка в укладке основной пептидной цепи металлсвязывающего домена Aβ. Известно, что при связывании иона цинка домен 1–16 приобретает компактную пространственную конформацию, в центре которой находится ион цинка, хелатируемый боковыми группами His6, Glu11, His13 и His14 [10, 41]. Мутация D7H может делать эту структуру еще более стабильной и компактной [32], а мутация H6R, напротив, переводит домен в “развернутую” конформацию [4]. Фосфорилирование Ser8 не влияет на структуру цинк-связанного домена [23]. Особый интерес представляет роль двойной химической модификации домена – изомеризации Asp7 и фосфорилирования Ser8: в таком домене, isoD7-pS8-Aβ(1–16), может существенно измениться координационная сфера иона цинка и, соответственно, конформация домена [34]. С учетом недавно опубликованных данных [33, 34] можно предположить, что Aβ с фосфорилированным Ser8 (pS8-Aβ) участвует в нормальных физиологических процессах, а связанная со спонтанным белковым старением изомеризация Asp7 [19] аннулирует физиологические функции pS8-Aβ, но не превращает эту молекулу в зародыш аномальной агрегации эндогенного Aβ.

В заключение следует отметить, что с помощью поверхностного плазмонного резонанса удалось выявить количественную вариацию в цинкзависимом связывании белков лизата цитозольной фракции клеток SK-N-SH с интактным Aβ(1–16) и его четырьмя модифицированными вариантами: H6R-Aβ(1–16), pS8-Aβ(1–16), D7H-Aβ(1–16) и isoD7-pS8-Aβ(1–16). Совмещенным методом аффинного выделения и масс-спектрометрической идентификации определен репертуар потенциальных белков, которые в цинкзависимой манере образуют нековалентные комплексы с металлсвязывающими доменами двух изоформ бета-амилоида: Aβ с фосфорилированным Ser8 и Aβ с “Тайваньской” (D7H) мутацией. Полученные нами результаты впервые показали критическое влияние аминокислотных мутаций и химических модификаций на способность металлсвязывающего домена Aβ участвовать в цинкзависимых белок-белковых взаимодействиях.

Работы с клетками нейробластомы и аффинное выделение белковых партнеров из клеточных лизатов выполнены при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 19-74-30007). Масс-спектрометрическая идентификация белковых партнеров выполнена с использованием ресурсов ЦКП “Протеом человека” Института биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича (финансовая поддержка в рамках соглашения № 075-15-2019-1502 от 5 сентября 2019 года, Минобрнаука).

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов исследований.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Список литературы

  1. Masters C.L., Selkoe D.J. (2012) Biochemistry of amyloid β-protein and amyloid deposits in Alzheimer disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2(6), a006262–a006262.

  2. Golde T.E., DeKosky S.T., Galasko D. (2018) Alzheimer’s disease: The right drug, the right time. Science. 362(6420), 1250–1251.

  3. Friedlich A.L., Lee J.Y., van Groen T., Cherny R.A., Volitakis I., Cole T.B., Palmiter R.D., Koh J.Y., Bush A.I. (2004) Neuronal zinc exchange with the blood vessel wall promotes cerebral amyloid angiopathy in an animal model of Alzheimer’s disease. J. Neurosci. 24(13), 3453–3459.

  4. Istrate A.N., Kozin S.A., Zhokhov S.S., Mantsyzov A.B., Kechko O.I., Pastore A., Makarov A.A., Polshakov V.I. (2016) Interplay of histidine residues of the Alzheimer’s disease Aβ peptide governs its Zn-induced oligomerization. Sci. Repts. 6, 21734.

  5. Stewart K.L, Radford S.E. (2017) Amyloid plaques beyond Aβ: a survey of the diverse modulators of amyloid aggregation. Biophys. Rev. 9(4), 405–419.

  6. Козин С.А., Барыкин Е.П., Митькевич В.А., Макаров А.А. (2018) Антиамилоидная терапия болезни Альцгеймера: современное состояние и перспектив. Биохимия. 83, 1331–1342.

  7. Козин С.А., Макаров А.А. (2019) Конвергенция концепций патогенеза болезни Альцгеймера. Молекуляр. биология. 53(6), 1020–1028.

  8. Armiento V., Spanopoulou A., Kapurniotu A. (2020) Peptide-based molecular strategies to interfere with protein misfolding, aggregation, and cell degeneration. Angew. Chem. (Int. Ed. Engl.). 59(9), 3372–3384.

  9. Kozin S.A., Zirah S., Rebuffat S., Hoa G.H., Debey P. (2001) Zinc binding to Alzheimer’s Aβ(1–16) peptide results in stable soluble complex. Biochem. Biophys. Res. Commun. 285(4), 959–964.

  10. Zirah S., Kozin S.A., Mazur A.K., Blond A., Cheminant M., Ségalas-Milazzo I., Debey P., Rebuffat S. (2006) Structural changes of region 1–16 of the Alzheimer disease amyloid β-peptide upon zinc binding and in vitro aging. J. Biol. Chem. 281(4), 2151–2161.

  11. Faller P., Hureau C. (2009) Bioinorganic chemistry of copper and zinc ions coordinated to amyloid-beta peptide. Dalton Trans. 7, 1080–1094.

  12. Istrate A.N., Tsvetkov P.O., Mantsyzov A.B., Kulikova A.A., Kozin S.A., Makarov A.A., Polshakov V.I. (2012) NMR solution structure of rat Aβ(1–16): toward understanding the mechanism of rats’ resistance to Alzheimer’s disease. Biophys. J. 102(1), 136–143.

  13. Попов И. А., Индейкина М. И., Кононихин А. С., Стародубцев, Н. Л., Козин С. А., Макаров А. А. & Николаев Е. Н. (2013) Определение минимального цинк-связывающего центра природных изоформ домена 1–16 бета-амилоида методом ESI-MS, Молекуляр. биология. 47(6), 498–504.

  14. Indeykina M., Kononikhin A., Popov I., Kostyukevich Y., Kulikova A., Mitkevich V., Kozin S., Makarov A., Nikolaev E. (2016) Localization of zinc binding sites of Ab1–16 with English mutation during formation of monomers and dimers with zinc. Internat. J. Mass Spectrometry. 409, 67–72.

  15. Kulikova A.A., Cheglakov I.B., Kukharsky M.S., Ovchinnikov R.K., Kozin S.A., Makarov A.A. (2016) Intracerebral injection of metal-binding domain of abeta comprising the isomerized asp7 increases the amyloid burden in transgenic mice. Neurotox. Res. 29(4), 551–557.

  16. Bourdenx M., Dovero S., Thiolat M.L., Bezard E., Dehay B. (2017) Lack of spontaneous age-related brain pathology in Octodon degus: a reappraisal of the model. Sci. Repts. 7, 45831.

  17. Steffen J., Krohn M., Paarmann K., Schwitlick C., Brüning T., Marreiros R., Müller-Schiffmann A., Korth C., Braun K., Pahnke J. (2016) Revisiting rodent models: Octodon degus as Alzheimer’s disease model? Acta Neuropathologica Commun. 4(1), 91.

  18. Barykin E.P., Mitkevich V.A., Kozin S.A., Makarov A.A. (2017) Amyloid beta modification: a key to the sporadic Alzheimer’s disease? Front. Gene. 8, 58.

  19. Kozin S.A., Mitkevich V.A., Makarov A.A. (2016) Amyloid-β containing isoaspartate 7 as potential biomarker and drug target in Alzheimer’s disease. Mendeleev Commun. 26(4), 269–275.

  20. Иванов А.С. (2012) Исследование межмолекулярных взаимодействий с помощью оптических биосенсоров, работающих на эффекте поверхностного плазмонного резонанса. Соврем. технол. мед. 4, 142–153.

  21. Kozin S.A., Mezentsev Y.V., Kulikova A.A., Indeykina M.I., Golovin A.V., Ivanov A.S., Tsvetkov P.O., Makarov A.A. (2011) Zinc-induced dimerization of the amyloid-β metal-binding domain 1–16 is mediated by residues 11–14. Mol. BioSystems. 7(4), 1053–1055.

  22. Khmeleva S.A., Mezentsev Y.V., Kozin S.A., Tsvetkov P.O., Ivanov A.S., Bodoev N.V., Makarov A.A., Radko S.P. (2013) Zinc-induced interaction of the metal-binding domain of amyloid-beta peptide with DNA. J. Alzheimer’s. Dis. 36(4), 633–636.

  23. Kulikova A.A., Tsvetkov. PO., Indeykina M.I., Popov I.A., Zhokhov S.S., Golovin A.V., Polshakov V.I., Kozin S.A., Nudler E., Makarov A.A. (2014) Phosphorylation of Ser8 promotes zinc-induced dimerization of the amyloid-beta metal-binding domain. Mol. Biosyst. 10(10), 2590–2596.

  24. Хмелёва С.А., Мезенцев Ю.В., Козин С.А., Митькевич В.А., Медведев А.Е., Иванов А.С., Бодоев Н.В., Макаров А.А., Радько С.П. (2015) Влияние мутаций и модификаций аминокислотных остатков на цинкиндуцированное взаимодействие металлсвязывающего домена β-амилоида с ДНК, Молекуляр. биология. 49(3), 507–514.

  25. Khmeleva S.A., Radko S.P., Kozin S.A., Kiseleva Y.Y., Mezentsev Y.V., Mitkevich V.A., Kurbatov L.K., Iva-nov A.S., Makarov A.A. (2016) Zinc-mediated binding of nucleic acids to amyloid-beta aggregates: role of histidine residues. J. Alzheimers Dis. 54(2), 809–819.

  26. Mezentsev Y.V., Medvedev A.E., Kechko O.I., Makarov A.A., Ivanov A.S., Mantsyzov A.B., Kozin S.A. (2016) Zinc-induced heterodimer formation between metal-binding domains of intact and naturally modified amyloid-beta species: implication to amyloid seeding in Alzheimer’s disease? J. Biomol. Struct. Dyn. 34(11), 2317–2326.

  27. Козин С.А., Польшаков В.И., Мезенцев Ю.В., Иванов А.С., Жохов С.С., Юринская М.М., Винокуров М.Г., Макаров А.А., Митькевич В.А. (2018) Эналаприлат ингибирует цинк-зависимую олигомеризацию металл-связывающего домена изоформ бета-амилоида и защищает клетки нейробластомы человека от их токсического действия. Молекуляр. биология. 52(4), 683–691.

  28. Иванов А.С., Ершов П.В., Мольнар А.А., Мезенцев Ю.В., Калужский Л.А., Яблоков Е.О., Флоринская А.В., Гнеденко О.В., Медведев А.Е., Козин С.А., Митькевич В.А., Макаров А.А., Гилеп А.А., Лущик А.Я., Гайдукевич И.В., Усанов С.А. (2016) Прямой молекулярный фишинг в исследовании молекулярных партнеров белок-белковых и белок-пептидных взаимодействий. Биоорган. химия. 42(1), 18–27.

  29. Kozin S.A., Cheglakov I.B., Ovsepyan A.A., Telegin G.B., Tsvetkov P.O., Lisitsa A.V., Makarov A.A. (2013) Peripherally applied synthetic peptide isoAsp7-Aβ(1–42) triggers cerebral β-amyloidosis. Neurotoxicity Res. 24(3), 370–376.

  30. Mitkevich V.A., Petrushanko I.Y., Yegorov Y.E., Simonenko O.V., Vishnyakova K.S., Kulikova A.A., Tsvetkov P.O., Makarov A.A., Kozin S.A. (2013) Isomerization of Asp7 leads to increased toxic effect of amyloid-β42 on human neuronal cells. Cell Death Dis. 4, e939.

  31. Kozin S.A., Kulikova A.A., Istrate A.N., Tsvetkov P.O., Zhokhov S.S., Mezentsev Y.V., Kechko O.I., Ivanov A.S., Polshakov V.I., Makarov A.A. (2015) The English (H6R) familial Alzheimer’s disease mutation facilitates zinc-induced dimerization of the amyloid-β metal-binding domain. Metallomics. 7(3), 422–425.

  32. Polshakov V.I., Mantsyzov A.B., Kozin S.A., Adzhubei A.A., Zhokhov S.S., van Beek W., Kulikova A.A., Indeykina M.I., Mitkevich V.A., Makarov A.A. (2017) A binuclear zinc interaction fold discovered in the homodimer of Alzheimer’s amyloid-beta fragment with taiwanese mutation D7H. Angew. Chem. (Int. Ed. Engl.). 56(39), 11734–11739.

  33. Barykin E.P., Petrushanko I.Y., Kozin S.A., Telegin G.B., Chernov A.S., Lopina O.D., Radko S.P., Mitkevich V.A., Makarov A.A. (2018) Phosphorylation of the amyloid-beta peptide inhibits zinc-dependent aggregation, prevents Na,K-ATPase inhibition, and reduces cerebral plaque deposition. Front. Mol. Neurosci. 11, 302.

  34. Kozin S.A., Barykin E.P., Telegin G.B., Chernov A.S., Adzhubei A.A., Radko S.P., Mitkevich V.A., Makarov A.A. (2018) Intravenously injected amyloid-β peptide with isomerized Asp7 and phosphorylated er8 residues inhibits cerebral β-amyloidosis in AβPP/PS1 transgenic mice model of Alzheimer’s disease. Front. Neurosci. 12, 518.

  35. Zatsepina O.G., Kechko O.I., Mitkevich V.A., Kozin S.A., Yurinskaya M.M., Vinokurov M.G., Serebryakova M.V., Rezvykh A.P., Evgen’ev M.B., Makarov A.A. (2018) Amyloid-β with isomerized Asp7 cytotoxicity is coupled to protein phosphorylation. Sci. Repts. 8(1), 3518.

  36. Ershov P.V., Mezentsev Y.V., Kopylov A.T., Yablo-kov E.O., Svirid A.V., Lushchyk A.Y., Kaluzhskiy L.A., Gilep A.A., Usanov S.A., Medvedev A.E., Ivanov A.S. (2019) Affinity isolation and mass spectrometry identification of prostacyclin synthase (PTGIS) subinteractome. Biology. 8(2), 49.

  37. Florinskaya A., Ershov P., Mezentsev Y., Kaluzhskiy L., Yablokov E., Medvedev A., Ivanov A. (2018) SPR biosensors in direct molecular fishing: implications for protein interactomics. Sensors (Basel). 18(5), 1616.

  38. Wiśniewski J.R., Zougman A., Nagaraj N., Mann M. (2009) Universal sample preparation method for proteome analysis. Nat. Methods. 6(5), 359–362.

  39. Hao P., Ren Y., Xie Y. (2009) Label-free relative quantification method for low-abundance glycoproteins in human serum by micrOTOF-Q. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 877(16–17), 1657–1666.

  40. Purushothaman A.K., Pemiah B. (2014) Ultra high performance liquid chromatography-ultraviolet-electrospray ionization-micrOTOF-Q II analysis of flavonoid fractions from Jatropha tanjorensis. Pharmacogn. Mag. 10(Suppl. 3), S472–S479.

  41. Tsvetkov P.O., Kulikova A.A., Golovin A.V., Tkachev Y.V., Archakov A.I., Kozin S.A., Makarov A.A. (2010) Minimal Zn2+ binding site of amyloid-β. Biophys. J. 99(10), L84–L86.

Дополнительные материалы отсутствуют.