Молекулярная биология, 2021, T. 55, № 3, стр. 431-440

Генетическая вариабельность 5'-нетранслируемой области генома вируса клещевого энцефалита из разных регионов Северной Евразии

Е. П. Пономарева a***, В. А. Терновой a, Т. П. Микрюкова a, Е. В. Протопопова a, Н. Л. Тупота a, В. Б. Локтев a

a Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии “Вектор”
630559 Новосибирская обл., Кольцово, Россия

* E-mail: ponomareva_ep@vector.nsc.ru
** E-mail: ponomareva-eugenia2014@yandex.ru

Поступила в редакцию 22.07.2020
После доработки 13.10.2020
Принята к публикации 15.11.2020

Полный текст (PDF)

Аннотация

Проведен анализ нуклеотидных последовательностей 5′-нетранслируемой области (5′-UTR) геномной РНК вируса клещевого энцефалита (ВКЭ), выделенной из 39 особей таежных клещей, собранных в различных регионах Северной Евразии. Идентичность последовательностей 5′-UTR сибирского и дальневосточного генотипов ВКЭ составила 89 и 95%, соответственно, в сравнении с прототипными штаммами (Заусаев и 205). Обнаруженные замены характерны для этих двух генотипов ВКЭ, что позволяет однозначно идентифицировать их. В 5′-UTR РНК выявлены вариабельные и консервативные мотивы. Наибольшей вариабельностью отличались элементы B2, C1 и С2 Y-образной структуры 5′-UTR и предполагаемый сайт связывания вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразы. Элементы А2, CS A, CS B и стартовый кодон были консервативными. При этом в вариабельном элементе С1 5′-UTR ВКЭ, выделенного из клещей из различных географических районов, пять замен были строго консервативными, тогда как у лабораторных вариантов ВКЭ в этом элементе выявлено 11 различных замен. Чуть менее трети нуклеотидных замен картированы вне основных элементов Y-образной структуры. Нуклеотидные замены, как правило, локализовались в петлевых структурах, не затрагивая шпилечные области 5′-UTR ВКЭ. Полученные результаты показывают существенную вариабельность 5′-UTR геномной РНК лабораторных штаммов и полевых изолятов ВКЭ из таежных клещей, собранных в различных географических районах. Высказано предположение, что генетическая вариабельность 5′-UTR ВКЭ характерна для организации 5′-UTR генома ВКЭ и может быть структурной основой эффективной репликации ВКЭ в различных клетках птиц, млекопитающих и иксодовых клещей.

Ключевые слова: вирус клещевого энцефалита, вирусный геном, нуклеотидная последовательность, 5′-нетранслируемая область, геномная РНК

ВВЕДЕНИЕ

Вирус клещевого энцефалита (ВКЭ) относится к семейству Flaviviridae, род Flavivirus [1]. Этот род включает относительно просто устроенные РНК-содержащие сферические оболочечные вирусы размером 40–60 нм. Геном ВКЭ представлен одноцепочечной РНК(+) длиной ~9200–11000 нуклеотидов [1]. Геномная РНК кодирует один полипротеин, который подвергается процессингу вирусными и клеточными протеазами с образованием структурных и неструктурных вирусных белков. Геномная флавивирусная РНК фланкирована 5′- и 3′-нетраслируемыми районами (UTR), принципиально важными для инициации вирусной репликации и формирования репликативного комплекса с участием вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразы [2, 3]. Принято считать, что для репликации флавивирусной РНК необходима циклизация генома с образованием дцРНК из последовательностей 5′- и 3′-UTR и формированием структуры типа “сковорода с ручкой” [46] (рис. 1). Последовательность внутри консервативной петли “А” (А1, А2) опознается вирусной РНК-полимеразой, что необходимо для начала синтеза минус-цепи вирусной РНК.

Нуклеотидные замены в элементах CS A и CS B могут блокировать репликацию, даже если элементы не теряют способность образовывать стабильные комплексы с 3′-UTR [8]. Показано, что вариабельная область 5′-UTR геномной РНК критична для проявления вирулентности у мышей, а различия в 5′-UTR РНК природных вариантов ВКЭ приводят к различиям в эффективности репликации вируса [9, 10]. Вариабельность 5′‑UTR связывают также с адаптацией вируса к новым видам хозяев. Возможно, на особенности организации 5′-UTR влияет также длительность локальной микроэволюции ВКЭ в природных экосистемах [6, 11].

В нашей работе представлены результаты изучения генетического разнообразия 5′-UTR РНК ВКЭ, выделенной непосредственно из иксодовых клещей, преимущественно Ixodеs persulcatus, собранных в различных регионах Северной Евразии.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Исследованные образцы. Клещей (всего 591) собирали в Новоcибирcкой облаcти, в районе c. Бурмиcтрово, в городских биотопах Томска, Екатеринбурга и Владивостока, в южных и центральных районах Pеспублики Коми и в Алтайском крае в весенний период 2014–2015 гг. Участки для сбора выбирали в типичных местах обитания клещей: лиственные и смешанные леса с хорошо развитым травянистым покровом, вырубки с естественным возобновлением лиственных пород, луга, обочины дорог. В городской черте клещей отлавливали в парковых зонах. Сбор клещей проводили методом отлова “на флаг“ во второй половине дня, когда наблюдается максимальная активность иксодовых клещей. Клещей транспортировали на влажной салфетке в сумках-холодильниках при температуре 4°С и хранили при температуре минус 18–24°С. Для определения вида клеща секвенировали фрагмент 16S рРНК, кодируемой митохондриальным геномом [12].

Пробоподготовка. Образцы растирали в ступке с 300 мкл стерильного физраствора. Нуклеиновые кислоты выделяли из 100 мкл гомогената с использованием пяти обьемов монофазного водного раствора фенола и гуанидинизотиоцианата (ExtractRNA, “Евроген”, Россия), согласно инструкции производителя. кДНК синтезировали с использованием набора “MMLVRT kit” (“Евроген”) согласно инструкции производителя. ПЦР проводили с использованием наборов “БиоМастер LRHS-ПЦР” (“BioLabMix”, Россия) в прилагаемом буфере с олигонуклеотидными праймерами, комплементарными исследуемым локусам РНК ВКЭ [6]. Температурные параметры ПЦР (амплификатор T100, “Bio-Rad”, США): 94°С, 10 с; 58°С, 20 с; 72°C, 30 с (40 циклов); 72°С – 7 мин.

Электрофоретический анализ и выделение фрагментов ДНК из геля. Продукты амплификации анализировали с помощью электрофореза в 2%-ном агарозном геле в буфере 1× ТАЕ (40 мМ Трис, 2 мМ Na2EDТА, уксусная кислота, pH 8.0). Для выделения продуктов амплификации из агарозного геля использовали набор diaGene (“Диа-М”, Россия).

Определение нуклеотидных последовательностей ДНК. Нуклеотидные последовательности продуктов амплификации определяли с использованием автоматического генетического анализатора ABI 3130xl (“Applied Biosystems”, США) и набора реактивов BigDye Terminatorv 3.1 Cycle Sequencing Kit (“Applied Biosystems”) согласно инструкции производителя. Нуклеотидные последовательности определяли не менее 2 раз в независимых экспериментах. Нуклеотидные последовательности выравнивали при помощи приложения Lasergene 7 (DNASTAR). Последовательности сравнения получены из базы данных GenBank. Множественное выравнивание проводили при помощи приложения AlignX программного пакета Vector NTI 11 (InforMax). Филогенетический анализ последовательностей штаммов и изолятов ВКЭ проводили при помощи программы MEGA [13]. Экспериментально определенные последовательности депонированы в GenBank под номерами: MT002379–MT002390, MT002802–MT002815, MT015646–M015648, KT205274–KT205282.

Вторичная структура 5′-UTR геномной РНК ВКЭ предсказана с помощью сервера MFOLD 3.4 [7].

PЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Обнаружение ВКЭ в клещах. В работе использовали 591 взрослого клеща I. persulcatus. Соотношение самцов и самок в выборке было примерно одинаковым. Вирусная РНК обнаружена в 39 образцах, что составило в среднем 6.6%.

Генотипирование природных изолятов ВКЭ. Определение нуклеотидной последовательности 5′-UTR вирусного генома позволило провести генотипирование 39 природных изолятов ВКЭ. Обнаружены сибирский и дальневосточный генотипы ВКЭ (рис. 2). Средний уровень идентичности 5′-UTR ВКЭ у отдельных дальневосточных клещей составил 95, 89% – у сибирского генотипа ВКЭ в сравнении с прототипными штаммами.

Рис. 1.

Предполагаемая вторичная структура генома вируса клещевого энцефалита (ВКЭ) с обозначением основных структурных элементов 5′-UTR. Вторичная структура 5′-UTR геномной РНК ВКЭ предсказана с помощью сервера MFOLD 3.4 [7].

Рис. 2.

Филогенетическое дерево нуклеотидных последовательностей 5′-UTR ВКЭ, выделенных из отдельных таежных клещей. Дополнено 9 последовательностями 5′-UTR ВКЭ из клещей, собранных ранее в Реcпублике Молдова [14]. ◆ – секвенированные последовательности 5′-UTR ВКЭ. Анализ проведен методом объединения ближайших соседей с использованием двухпараметрической модели Кимуры.

Анализ вариабельности 5'-UTR ВКЭ. Cравнение нуклеотидных последовательностей 5′-UTR ВКЭ выявило множественные замены с паттерном, характерным для сибирского и дальневосточного генотипов. Дальневосточные варианты отличались от прототипных лабораторных штаммов ВКЭ (205 и Заусаев) 17–22 заменами, а сибирские генотипы – 16–19. Паттерн нуклеотидных замен позволяет генотипировать изоляты ВКЭ на основе анализа относительно короткого фрагмента генома и показывает выраженную изменчивость нуклеотидной последовательности 5′-UTR у лабораторных и клещевых вариантов ВКЭ.

Замены располагались неравномерно, так анализ 5′-UTR дальневосточных и сибирских изолятов показал, что элементы B2, C1, С2 Y-образной структуры 5′-UTR (табл. 1) содержат множественные нуклеотидные замены. В то же время элементы A2, CS A и CS В и стартовый кодон не содержат или содержат единичные замены. Полученные данные подтверждают существование консервативных и вариабельных районов в 5′-UTR РНК ВКЭ. Причем районы вне основных структурных элементов 5′-UTR также содержали множественные замены. Следует отметить, что в штаммах ВКЭ, культивируемых в лабораторных условиях, количество замен в элементе С1 и вне основных доменов было в 2 раза больше, чем в природных изолятах ВКЭ. В штаммах ВКЭ, культивируемых в условиях лаборатории, накапливаются адаптивные нуклеотидные/аминокислотные замещения. Это позволяет предположить, что эти районы могут быть вовлечены в адаптацию ВКЭ к культивированию на клетках млекопитающих.

Таблица 1.  

Распределение количества нуклеотидных замен в основных элементах 5′-UTR ВКЭ

Элемент 5′-UTR ВКЭ Общее количество нуклеотидных замен в изолятах и лабораторных штаммах в сравнении с прототипными штаммами ВКЭ
  штамм Заусаев/последова-тельности клещевых изолятов ВКЭ* штамм 205/последователь-
ности клещевых изолятов ВКЭ*
штамм Заусаев/лабораторные штаммы ВКЭ** штамм 205/лабораторные штаммы ВКЭ**
Консервативные элементы 5′-UTR ВКЭ
A2 0 0 1 1
CS A 0 0 0 0
ATG 0 0 0 0
CS B 1 1 2 2
Вариабельные элементы 5′-UTR ВКЭ
B2 4 4 3 3
C1 5 5 11 11
C2 8 10 10 12
Замены вне основных элементов 8 8 19 19

Примечание. Указано общее количество нуклеотидных замен в изолятах и в лабораторных штаммах по отношению к прототипным ВКЭ (штаммы 205 и Заусаев).  * Использованы природные изоляты: Республика Молдова – 9 изолятов ВКЭ (KT205274–KT205282), Уральский регион – 13 (МТ002377–МТ002389), Республика Коми – 4 (МТ002390, МТ002802–МТ002804), Томск – 2 (МТ002805, МТ002806), Новосибирск – 12 (МТ002807–МТ002815, МТ015646–МТ015648), Алтай – 3 (МТ002370–МТ002372), Владивосток – 5 (МТ002369, МТ002373–МТ002376). ** Использованы лабораторные штаммы ВКЭ: Заусаев, Васильченко, С11-13, Коларово, Латвия-1-96, EK-328 (все сибирский генотип), 205, Глубинное-2004, Софьин, Томск-РТ12, Томск К6, Oshima 5-10 (дальневосточный генотип), Neudoerf (европейский генотип).

Следует отметить, что во всех 39 изолятах ВКЭ, выделенных из клещей, вариабельный элемент С1 содержит пять строго консервативных замен, абсолютно идентичных во всех сибирских вариантах. Другой вариант замен в этом же элементе характерен для всех дальневосточных ВКЭ из клещей, собранных в разных географических районах. Консервативность замен в элементе С1 клещевых изолятов и более выраженная вариабельность этого района у лабораторных штаммов ВКЭ говорят о возможной значимости этих замен для репликации вирусного генома в различных типах клеток.

Практически для всех изолятов ВКЭ из Республики Молдова характерна сдвоенная замена в позициях Т(30) и Т(35) на С между элементами В1 и В2 (рис. 3).

Рис. 3.

Фрагмент (30–89 п.н.) выровненных нуклеотидных последовательностей 5'-UTR изолятов ВКЭ в сравнении с прототипной последовательностью штамма Заусаев сибирского генотипа. Рамками выделены основные структурные элементы 5'-UTR ВКЭ. (Полные данные по выравниванию нуклеотидных последовательностей 5′-UTR представлены в Приложении, см. Приложение на сайте http://www.molecbio.ru/downloads/2020/3/supp_Ponomareva_rus.pdf), * общее количество замен.

Рис. 3.

Окончание.

Эта сдвоенная замена ассоциирована с участком связывания вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразы [14]. Одним из возможных объяснений наблюдаемой ситуации может быть участие данных замен в адаптации ВКЭ к различным природным условиям и/или к новым типам хозяев.

На рис. 4 представлена предполагаемая модель циклизации 5′-UTR ВКЭ. Стрелками показано расположение нуклеотидных замен, обнаруженных в различных изолятах ВКЭ. В рамках модели Y-структуры 5′-UTR ВКЭ выявленные нуклеотидные замены картируются преимущественно в петлевых структурах, не затрагивая шпилечные. Это дополнительно подтверждает предположение, согласно которому нуклеотидные замены в петлевых районах Y-структуры могут быть вовлечены в обеспечение эффективной репликации ВКЭ в клетках таежного клеща в различных районах Северной Евразии.

Рис. 4.

Локализация нуклеотидных замещений в 5′-UTR ВКЭ таежных клещей. Стрелками показаны замещения и их позиции в 5′-UTR различных изолятов ВКЭ. Структура РНК построена на основе последовательности генома штамма 205. Вторичная структура 5′-UTR геномной РНК ВКЭ предсказана с помощью сервера MFOLD 3.4 [7].

Ареал ВКЭ в основном совпадает с ареалом обитания клещей I. persulcatus и I. ricinus на значительной части Северной Евразии. ВКЭ вызывает клещевой энцефалит (КЭ), поражающий преимущественно центральную нервную систему человека. Максимальная заболеваемость КЭ совпадает с пиками сезонной активности иксодовых клещей, обычно весной и в начале лета. В природных очагах КЭ клещи питаются на мелких млекопитающих и птицах, многие из которых также поддерживают циркуляцию ВКЭ [15, 16]. Заболеваемость КЭ постоянно регистрируется в новых странах Западной Европы, что указывает на формирование природных очагов КЭ в районах, которые ранее считались неэндемичными по КЭ [17]. В настоящее время в странах Балтии и Словении КЭ встречается почти с такой же частотой, как и в европейской части Российской Федерации. Это предполагает, что ВКЭ должен обеспечивать репликацию собственного генома и получение вирусного потомства в различных видах хозяев. Птицы, мелкие млекопитающие и клещи обеспечивают формирование природных очагов КЭ и служат принципиальными хозяевами ВКЭ. Биологические различия клеток клещей, птиц и млекопитающих очень существенны, как и температурные факторы, необходимые для эффективной репликации ВКЭ в этих типах клеток.

Успешность адаптации ВКЭ к изменяющимся условиям может быть обеспечена определенными генетическими механизмами. Предполагается, что вариабельность нуклеотидной последовательности 5′-UTR может предопределять эффективность репликации ВКЭ в иксодовых клещах и в клетках других резервуарных хозяев в природных очагах [11]. Это предположение основано на данных о локализации в 5′-UTR геномной РНК флавивирусов сайтов связывания вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразы и взаимодействии с рибосомами клетки хозяина для обеспечения синтеза вирусного полипротеина.

Проведенный ранее анализ нуклеотидной последовательности 5′-UTR геномной РНК ВКЭ, выделенной из таежных клещей, показал, что этот район вирусного генома весьма вариабелен и содержит как консервативные, так и вариабельные структурные элементы [6, 18]. В нашей работе география сбора клещей была расширена. Вирусная РНК обнаружена в 6.6% тестированных таежных клещей. Большинство изолятов ВКЭ принадлежали к дальневосточному генотипу, и только образцы из Республики Коми и Томска группировались с известными геновариантами сибирского генотипа ВКЭ. Выраженное доминирование дальневосточного генотипа ВКЭ у иксодовых клещей свидетельствует в пользу того, что в исследованных природных и городских очагах КЭ доминирует именно дальневосточный генотип ВКЭ. Эпидемиологическая значимость широкого распространения дальневосточного генотипа ВКЭ связана с его более высокой патогенностью для человека. Так, летальность от КЭ, вызываемого вариантами ВКЭ, циркулирующими в Приморском крае, может достигать 30% и более. Европейские и сибирские геноварианты ВКЭ вызывают более легкую форму заболевания с низким уровнем летальности (1–2%) [19].

Сравнение нуклеотидных последовательностей 5′-UTR сибирских и дальневосточных клещевых вариантов ВКЭ выявило множественные нуклеотидные замены даже в относительно короткой последовательности из 181 нуклеотида. Варианты дальневосточного генотипа ВКЭ отличаются 17–22 нуклеотидными заменами от последовательности штамма Заусаев сибирского генотипа. В исследованных вариантах сибирского генотипа картированы 16–19 замен, отличающие их от штамма 205 ВКЭ. Столь выраженные генетические различия в 5′-UTR ВКЭ позволяют на основе анализа последовательности короткого фрагмента генома однозначно генотипировать различные изоляты ВКЭ в пределах сибирского и дальневосточного генотипов ВКЭ. С другой стороны, это дополнительно подтверждает существование выраженных генетических различий в 5′-UTR генома ВКЭ, изолированных из таежных клещей и собранных в различных географических регионах.

Наблюдаемые генетические отличия крайне неравномерно распределены по основным элементам 5′-UTR ВКЭ. Элементы CS A и старт-кодон ATG абсолютно консервативны, и нам не удалось выявить замен во всех секвенированных вариантах этих элементов. Консервативность элемента CS A, по всей вероятности, связана с его участием в эффективной инициации РНК-полимеразы и синтезом РНК различных флавивирусов [20]. Конформация этого района определяет как циклизацию генома, так и репликацию вирусной РНК, что предопределяет консервативность нуклеотидной последовательности данных элементов 5′-UTR генома ВКЭ.

В элементах В2, С1, С2 клещевых вариантов 5′‑UTR ВКЭ выявлено от 4 до 10 замен, а в культивируемых в лаборатории штаммах ВКЭ – от 3 до 11 замен. Вне основных элементов 5′-UTR в клещевых вариантах ВКЭ обнаружено восемь замен, а в культивируемых штаммах найдено 19 замен, что позволило отнести эти районы к вариабельным последовательностям 5′-UTR. Биологический смысл подобной генетической изменчивости может быть связан с необходимостью обеспечить репликацию вируса в различных типах клеток и в различных хозяевах. Клетки клещей существенно отличаются от клеток птиц и млекопитающих. Температура клеща фактически не отличается от температуры окружающей среды, поэтому для синтеза вирусной РНК и вирусных белков ферментные системы должны сохранять активность при пониженных температурах.

Показано, что во всех 39 изолятах ВКЭ, выделенных из клещей, вариабельный элемент С1 несет пять замен, абсолютно идентичных во всех сибирских вариантах, для дальневосточных вариантов ВКЭ характерны другие замены.

В последовательности между элементами В1 и В2 выявлены две замены в позициях Т(30) и Т(35) на С, характерные только для клещевых вариантов ВКЭ из Республики Молдова [14] и ассоциированные с участком связывания 5′-UTR с вирусной РНК-полимеразой. Ранее эту сдвоенную замену выявили в высокопатогенном для человека дальневосточном штамме Глубинное ВКЭ [21], который отличается высокой эффективностью синтеза вирусных белков и формирования инфекционных частиц. По этим показателям штамм Глубинное в 5–10 раз превышает прототипный штамм 205 дальневосточного генотипа ВКЭ.

Полученные данные подтверждают идею о том, что вариабельность 5′-UTR ВКЭ отражает особенности строения генома флавивирусов, обеспечивающие максимальную эффективность репликации в клетках птиц, млекопитающих и клещей. Обнаруженные множественные нуклеотидные замены, по всей вероятности, могут приводить к изменению вторичной структуры РНК 5′-UTR генома ВКЭ и имеют принципиальное значение для адаптации вируса в природных очагах к новым видам переносчиков и хозяев. Знание и понимание пределов вариабельности вирусного генома принципиально важно как для лучшей диагностики флавивирусных инфекций, так и для совершенствования профилактики и лечения КЭ.

Статья поддержана Отраслевой научно-исследовательской программой Роспотребнадзора № 141-00080-20-02.

Настоящая статья не содержит описания каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Список литературы

  1. Simmonds P., Becher B., Bukh J., Gould E.A., Meyers G., Monath T., Muerhoff S., Pletnev A., Rico-Hesse R., Smith D.B., Stapleton J.T., ICTV Report Consortium. (2017) ICTV virus taxonomy profile: flaviviridae. J. Gen. Virol. 98, 2–3. https://doi.org/10.1099/jgv.0.000672

  2. Markoff L. (2003) 5′- and 3′-noncoding regions in flavivirus RNA. Adv. Virus Res. 59, 177–228. https://doi.org/10.1016/S0065-3527(03)59006-6

  3. Khromykh A.A., Sedlak P.L., Westaway E.G. (2000) Cis- and trans-acting elements in flavivirus RNA replication. J. Virol. 74, 3253–3263, https://doi.org/10.1128/JVI.74.7.3253-3263.2000

  4. Alvarez D.E., Lodeiro M.F., Luduena, J, Pietrasanta L.I., Gamarnik A.V. (2005) Long-range RNA-RNA interactions circularize the dengue virus genome. J. Virol. 79, 6631–6643. https://doi.org/10.1128/JVI.79.11

  5. Filomatori C.V., Lodeiro M.F., Alvarez D.E., Samsa M.M., Pietrasanta L., Gamarnik A.V. (2006) A 5′ RNA element promotes dengue virus RNA synthesis on a circular genome. Genes Dev. 20, 2238–2249. https://doi.org/10.1101/gad.1444206

  6. Chausov E.M., Ternovoi V.A., Protopopova E.V., Kononova J.V., Konovalova S.N., Pershikova N.L., Loktev V.B., Romanenko V.N., Ivanova N.V., Bolshakova N.P., Moskvitina N.S. (2010) Variability of the tick-borne encephalitis virus genome in the 5′ noncoding region derived from ticks Ixodes persulcatus and Ixodes pavlovskyi in Western Siberia. Vector-Borne Zoonotic Diseases. 10, 365–375. https://doi.org/10.1089/vbz.2009.0064

  7. Markham N.R., Zuker M. (2008) UNAFold. Bioinformatics. Humana Press. 3–31.

  8. Alvarez D.E., Filomatori C.V., Gamarnik A.V. (2008) Functional analysis of dengue virus cyclization sequences located at the 5′ and 3′ UTRs. Virology. 375, 223–235. https://doi.org/10.1016/j.virol.2008.01.014

  9. Sakai M., Yoshii K., Sunden Y., Yokozawa K., Hirano M., Kariwa H. (2014) Variable region of the 3′ UTR is a critical virulence factor in the Far-Eastern subtype of tick-borne encephalitis virus in a mouse model. J. Gen. Virol. 95, 823–835. https://doi.org/10.1099/vir.0.060046-0

  10. Sakai M., Muto M., Hirano M., Kariwa H., Yoshii K. (2015) Virulence of tick-borne encephalitis virus is associated with intact conformational viral RNA structures in the variable region of the 3′-UTR. Virus Res. 203, 36–40. https://doi.org/10.1016/j.virusres.2015.03.006

  11. Casati S., Gern L., Pifaretti J.-C. (2006) Diversity of the population of tick-borne encephalitis virus infecting Ixodes ricinus ticks in an endemic area of central Switzerland (Canton Bern). J. Gen. Virol. 87, 2235–2241. https://doi.org/10.1099/vir.0.81783-0

  12. Kartashov M.Y., Glushkova L.I., Mikryukova T.P., Korabelnikov I.V., Egorova Y.I., Tupota N.L., Protopopova E.V., Konovalova, S.N., Ternovoi V.A., Loktev V.B. (2017) Detection of Rickettsia helvetica and candidatus R. tarasevichiae DNA in Ixodes persulcatus ticks collected in Northeastern European Russia (Komi Republic). Ticks Tick-Borne Diseases. 8, 588–592. https://doi.org/10.1016/j.ttbdis.2017.04.001

  13. Tamura K., Peterson D., Peterson N., Stecher G., Nei M., Kumar S. (2011) MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Mol. Biol. Evol. 28, 2731–2739. https://doi.org/10.1093/molbev/msr121

  14. Ponomareva E.P., Mikryukova T.P., Kartashov M.Y., Protopopova E.V., Chausov E.V., Konovalova S.N., Tupota N.L., Gheorghita S.D., Burlacu V.I., Ternovoi V.A., Loktev V.B. (2015) Detection of Far-Eastern subtype of tick-borne encephalitis viral RNA in ticks collected in the Republic of Moldova. J. Vector Borne Diseases. 52, 334–336.

  15. Achazi K., Ruzek D., Donoso-Mantke D., Schlegel M., Ali H.S., Wenk M., Schmidt-Chanasit J., Ohlmeyer L., Ruhe F., Vor T., Kiffner T., Kallies R., Ulrich R.G., Niedrig M. (2011) Rodents as sentinels for the prevalence of tick-borne encephalitis virus. Vector-Borne Zoonotic Diseases. 11, 641–647. https://doi.org/10.1089/vbz.2010.0236

  16. Knap N., Korva M., Dolinsek V., Sekirnik M., Trilar T., Avsic-Zupanc T. (2012) Patterns of tick-borne encephalitis virus infection in rodents in Slovenia. Vector-Borne Zoonotic Dis. Larchmt. 12, 236–242. https://doi.org/10.1089/vbz.2011.0728

  17. Caracciolo I., Bassetti M., Paladini G., Luzzati R., Santon D., Merelli M., Sabbata G.D., Carletti T., Marcell A., D’Agaro P. (2015) Persistent viremia and urine shedding of tick-borne encephalitis virus in an infected immunosuppressed patient from a new epidemic cluster in north-eastern Italy. J. Clin. Virol. 69, 48–51. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2015.05.019

  18. Микрюкова Т.П., Чаусов Е.В., Коновалова С.Н., Кононова Ю.В., Протопопова Е.В., Карташов М.Ю., Терновой В.А., Глушкова Л.И., Корабельников И.В., Егорова Ю.И., Локтев В.Б. (2014) Генетическое разнообразие вируса клещевого энцефалита в клещах Ixodes persulcatus в Северо-Восточном регионе европейской части России. Паразитология. 48, 131–149.

  19. Gritsun T.S., Nuttall P.A., Gould E.A. (2003) Tick-borne flaviviruses. Adv. Virus Res. 61, 317–371. https://doi.org/10.1016/S0065-3527(03)61008-0

  20. Liu Z.-Y., Li X.-F., Jiang T., Deng Y.-Q., Ye Q., Zhao H., Yu J.-Y., Qin C.-F. (2016) Viral RNA switch mediates the dynamic control of flavivirus replicase recruitment by genome cyclization. eLife. 5, e17636. https://doi.org/10.7554/eLife.17636

  21. Ternovoi V.A., Protopopova E.V., Chausov E.V., Novikov D.V., Leonova G.N., Netesov S.V., Loktev V.B. (2007) Novel variant of tickborne encephalitis virus, Russia. Emerg. Infect. Dis. 13, 1574–1578. https://doi.org/10.3201/eid1310.070158

Дополнительные материалы

скачать ESM.xls
Приложение 1