Молекулярная биология, 2021, T. 55, № 6, стр. 944-955

Разработка мультиплексной ОТ-ПЦР с иммобилизованными праймерами для идентификации возбудителей инфекционной пневмонии человека

С. А. Лапа a*, Р. А. Мифтахов a, Е. С. Клочихина a, Ю. И. Аммур b, С. А. Благодатских c, В. Е. Шершов a, А. С. Заседателев a, А. В. Чудинов a

a Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук
119991 Москва, Россия

b Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова
105064 Москва, Россия

c Научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии
142279 Оболенск, Россия

* E-mail: lapa@biochip.ru

Поступила в редакцию 12.03.2021
После доработки 12.04.2021
Принята к публикации 13.04.2021

Аннотация

Разработан прототип системы, основанной на мультиплексной ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) в иммобилизованной фазе, для выявления возбудителей инфекционной пневмонии человека. Сконструированы праймеры для идентификации ДНК шести видов бактерий и РНК двух вирусов: гриппа А и SARS-CoV-2. Накопление сигнала удлиняющихся иммобилизованных праймеров обусловлено включением в растущую цепь флуоресцентно меченных нуклеотидов. Детекция сигнала происходит после удаления всех компонентов смеси, что существенно снижает фон и увеличивает чувствительность анализа. Применение специализированного детектора позволяет считывать сигналы удлиненных праймеров непосредственно через прозрачную покровную пленку реакционной камеры. Такое решение призвано предотвратить перекрестную контаминацию и подходит для одновременного тестирования большого количества образцов. Предлагаемая платформа способна выявлять несколько различных возбудителей пневмонии в одном образце; она имеет открытую архитектуру, что позволяет расширять спектр определяемых патогенных бактерий и вирусов.

Ключевые слова: ОТ-ПЦР в иммобилизованной фазе, мультиплексная ПЦР, инфекционная пневмония, грипп, SARS-CoV-2

Список литературы

  1. Henig O., Kaye K.S. (2017) Bacterial pneumonia in older adults. Infect. Dis. Clin. North. Am. 31, 689–713.

  2. Haq I.J., Battersby A.C., Eastham K., McKean M. (2017) Community acquired pneumonia in children. BMJ (Clinical Res. ed.). 356, j686.

  3. Ruuskanen O., Lahti E., Jennings L.C., Murdoch D.R. (2011) Viral pneumonia. Lancet. 9, 1264–1275.

  4. Galván J.M., Rajas O., Aspa J. (2015) Review of non-bacterial infections in respiratory medicine: viral pneumonia. Arch. Bronconeumol. 51, 590–597.

  5. Dandachi D., Rodriguez-Barradas M.C. (2018) Viral pneumonia: etiologies and treatment. J. Invest. Med. 66, 957–965.

  6. Chen X., Liao B., Cheng L., Peng X., Xu X., Li Y., Hu T., Li J. Zhou X., Ren B. (2020). The microbial coinfection in COVID-19. Appl. Microbiol. Biotechnol. 104, 7777–7785.

  7. Prasso J.E., Deng J.C. (2017) Postviral complications: bacterial pneumonia. Clin. Chest. Med. 38, 127–138.

  8. Harris M., Clark J., Coote N., Fletcher P., Harnden A., McKean M., Thomson A. (2011) British thoracic society standards of care committee. British thoracic society guidelines for the management of community acquired pneumonia in children: update 2011. Thorax. 66(Suppl. 2), ii1–ii23.

  9. Budayanti N.S., Suryawan K., Iswari I.S., Sukrama D.M. (2019) The quality of sputum specimens as a predictor of isolated bacteria from patients with lower respiratory tract infections at a tertiary referral hospital, Denpasar, Bali-Indonesia. Front. Med. (Lausanne). 6, 64.

  10. Lee N., Rainer T.H., Ip M., Zee B., Ng M.H., Antonio G.E., Chan E., Lui G., Cockram C.S., Sung J.J., Hui D.S. (2006) Role of laboratory variables in differentiating SARS-coronavirus from other causes of community-acquired pneumonia within the first 72 h of hospitalization. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 25, 765–772.

  11. Dorigo-Zetsma J.W., Zaat S.A., Wertheim-van Dillen P.M., Spanjaard L., Rijntjes J., van Waveren G., Jensen J.S., Angulo A.F., Dankert J. (1999) Comparison of PCR, culture, and serological tests for diagnosis of Mycoplasma pneumoniae respiratory tract infection in children. J. Clin. Microbiol. 37, 14–17.

  12. Cunha B.A. (2006) The atypical pneumonias: clinical diagnosis and importance. Clin. Microbiol. Infect. 12(Suppl.), 3, 12–24.

  13. Azoulay E., Russell L., Van de Louw A., Metaxa V., Bauer P., Povoa P., Montero J.G., Loeches I.M., Mehta S., Puxty K., Schellongowski P., Rello J., Mokart D., Lemiale V., Mirouse A. (2020) Diagnosis of severe respiratory infections in immunocompromised patients. Intensive Care Med. 46, 298–314.

  14. Mabie M., Wunderink R.G. (2003) Use and limitations of clinical and radiologic diagnosis of pneumonia. Semin. Respir. Infect. 18, 72–79.

  15. Aydemir Y., Aydemir Ö., Pekcan S., Özdemir M. (2015) Value of multiplex PCR to determine the bacterial and viral aetiology of pneumonia in school-age children. Paediatr. Int. Child Health. 37, 29–34.

  16. Wagner K., Springer B., Imkamp F., Opota O., Greub G., Keller P.M. (2018) Detection of respiratory bacterial pathogens causing atypical pneumonia by multiplex Lightmix® RT-PCR. Int. J. Med. Microbiol. 308, 317–323.

  17. Лапа С.А., Клочихина Е.С., Мифтахов Р.А., Золотов А.М., Заседателев А.С., Чудинов А.В. (2020) Мультиплексная ПЦР для выявления бактериальных возбудителей инфекционной пневмонии. Биоорган. химия. 46, 550–552.

  18. You H.-L., Chang S.-J., Yu H.-R., Li C.-C. Chen, C.-H., Liao W.-T. (2017) Simultaneous detection of respiratory syncytial virus and human metapneumovirus by one-step multiplex real-time RT-PCR in patients with respiratory symptoms. BMC Pediatrics, 17, 89.

  19. van Kasteren P.B., van der Veer B., van den Brink S., Wijsman L., de Jonge J., van den Brandt A., Molenkamp R., Reusken C.B.E.M., Meijer A. (2020) Comparison of seven commercial RT-PCR diagnostic kits for COVID-19. J. Clin. Virol. 128, 104412.

  20. Malhotra B., Swamy M.A., Reddy P.V.J., Kumar N., Tiwari J.K. (2016) Evaluation of custom multiplex real time RT-PCR in comparison to fast track diagnostics respiratory 21 pathogens kit for detection of multiple respiratory viruses. Virol. J. 13, 91.

  21. Zhang H., Wang Y., Porter E., Lu N., Li Y., Yuan F., Bai J. (2019) Development of a multiplex real-time RT-PCR assay for simultaneous detection and differentiation of influenza A, B, C and D viruses. Diagn. Microbiol. Infect. Disease. 95, 59–66.

  22. Chung H.Y., Jian M.J., Chang C.K., Lin J.C., Yeh K.M., Chen C.W., Chiu S.K., Wang Y.H., Liao S.J., Li S.Y., Hsieh S.S., Tsai S.H., Perng C.L., Yang J.R., Liu M.T., Chang F.Y., Shang H.S. (2021) Novel dual multiplex real-time RT-PCR assays for the rapid detection of SARS-CoV-2, influenza A/B, and respiratory syncytial virus using the BD MAX open system. Emerg. Microbes. Infect. 10, 161–166.

  23. Zhou B., Deng Y.-M., Barnes J.R., Sessions O.M., Chou T.-W., Wilson M., Wentworth D. (2017) Multiplex reverse transcription-PCR for simultaneous surveillance of influenza A and B viruses. J. Clin. Microbiol. 55, 3492–3501.

  24. Abarshi M.M., Mohammed I.U., Jeremiah S.C., Legg J.P., Kumar P.L., Hillocks R.J., Maruthi M.N. (2012) Multiplex RT-PCR assays for the simultaneous detection of both RNA and DNA viruses infecting cassava and the common occurrence of mixed infections by two cassava brown streak viruses in East Africa. J. Virol. Methods. 179, 176–184.

  25. Malandraki I., Varveri C., Vassilakos N. (2018) One-step multiplex quantitative RT-PCR for the simultaneous detection of viroids and phytoplasmas. Methods Mol. Biol. 1857, 151–157.

  26. Lung O., Fisher M., Beeston A., Hughes K.B., Clavijo A., Goolia, M., Deregt D. (2011) Multiplex RT-PCR detection and microarray typing of vesicular disease viruses. J. Virol. Methods. 175, 236–245.

  27. Scuderi G., Catara A.F., Licciardello G. (2019) Genotyping citrus tristeza virus isolates by sequential multiplex RT-PCR and microarray hybridization in a Lab-on-Chip device. Methods Mol. Biol. 2015, 127–142.

  28. Wilson K. (2001) Preparation of genomic DNA from bacteria. Curr. Protoc. Molec. Biol. 56, 2.4.1–2.4.5.

  29. Chan J.F., Yip C.C., To K.K., Tang T.H., Wong S.C., Leung K.H., Fung A.Y., Ng A.C., Zou Z., Tsoi H.W., Choi G.K., Tam A.R., Cheng V.C., Chan K.H., Tsang O.T., Yuen K.Y. (2020) Improved molecular diagnosis of COVID-19 by the novel, highly sensitive and specific COVID-19-RdRp/Hel real-time reverse transcription-PCR assay validated in vitro and with clinical specimens. J. Clin. Microbiol. 58(5), e00310–e00320.

  30. Rubina A.Yu., Pan’kov S.V., Dementieva E.I., Pen’kov D.N., Butygin A.V., Vasiliskov V.A., Chudi-nov A.V., Mikheikin A.L., Mikhailovich V.M., Mipzabekov A.D. (2004) Hydrogel drop microchips with immobilized DNA: properties and methods for large-scale production. Anal. Biochem. 325, 92–106.

  31. Shershov V.E., Lapa S.A., Kuznetsova V.E., Spitsyn M.A., Guseinov T.O., Polyakov S.A., Stomahin A.A., Zasedatelev A.S., Chudinov A.V. (2017) Comparative study of novel fluorescent cyanine nucleotides: hybridization analysis of labeled PCR products using a biochip. J. Fluoresc. 27, 2001–2016.

  32. Лапа С.А., Клочихина Е.С., Мифтахов Р.А., Заседателев А.С., Чудинов А.В. (2021) Мультиплексная ПЦР на чипе с прямой детекцией удлинения иммобилизованного праймера. Биоорган. химия.https://doi.org/10.31857/S0132342321050298

  33. Lapa S.A., Klochikhina E.S., Miftakhov R.A., Zasedatelev A.S., Chudinov A.V. (2021) Development of multi-primer PCR system with an open architecture for rapid detection of infectious pneumonia causative agents. AIP Conf. Proc. In Press.

  34. Mellroth P., Daniels R., Eberhardt A., Rönnlund D., Blom H., Widengren J., Normark S., Henriques-Normark B. (2012) LytA, major autolysin of Streptococcus pneumoniae, requires access to nascent peptidoglycan. J. Biol. Chem. 287, 11018–11029.

  35. Morona J.K., Morona R., Miller D.C., Paton J.C. (2002) Streptococcus pneumoniae capsule biosynthesis protein CpsB is a novel manganese-dependent phosphotyrosine-protein phosphatase. J. Bacteriol. 184, 577–583.

  36. Downer R., Roche F., Park P.W., Mecham R.P., Foster T.J. (2002) The elastin-binding protein of Staphylococcus aureus (EbpS) is expressed at the cell surface as an integral membrane protein and not as a cell wall-associated protein J. Biol. Chem. 4, 243–250.

  37. Abdeldaim G.M., Stralin K., Olcén P., Blomberg J., Mölling P., Herrmann B. (2013) Quantitative fucK gene polymerase chain reaction on sputum and nasopharyngeal secretions to detect Haemophilus influenzae pneumonia. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 76, 141–146.

  38. Llamas M.A., Rodríguez-Herva J.J., Hancock R.E., Bitter W., Tommassen J., Ramos J.L. (2003) Role of Pseudomonas putida tol-oprL gene products in uptake of solutes through the cytoplasmic membrane. J. Bacteriol. 185, 4707–4716.

  39. Gilmour M.W., Bernard K., Tracz D.M., Olson A.B., Corbett C.R., Burdz T., Ng B., Wiebe D., Broukhan-ski G., Boleszczuk P., Tang P., Jamieson F., Van Domselaar G., Plummer F.A., Berry J.D. (2007) Molecular typing of a Legionella pneumophila outbreak in Ontario, Canada. J. Med. Microbiol. 56, 336–341.

  40. Li G., Sun S., Zhao Z.Y., Sun Y. (2019) The pathogenicity of rmpA or aerobactin-positive Klebsiella pneumoniae in infected mice. J. Int. Med. Res. 47, 4344–4352.

  41. Ishige T., Murata S., Taniguchi T., Miyabe A., Kitamura K., Kawasaki K., Nishimura M., Igari H., Matsushita K. (2020) Highly sensitive detection of SARS-CoV-2 RNA by multiplex rRT-PCR for molecular diagnosis of COVID-19 by clinical laboratories. Clin. Chim. Acta. 507, 139–142.

  42. Inui K., Nguyen T., Tseng H.J., Tsai C.M., Tsai Y.L., Chung S., Padungtod P., Zhu H., Guan Y., Kalpra-vidh W., Claes F. (2019) A field-deployable insulated isothermal RT-PCR assay for identification of influenza A (H7N9) shows good performance in the laboratory. Influenza Other Respir. Viruses. 13, 610–617.

  43. Strizhkov B.N., Drobyshev A.L., Mikhailovich V.M., Mirzabekov A.D. (2000) PCR amplification on a microarray of gel-immobilized oligonucleotides: detection of bacterial toxin- and drug-resistant genes and their mutations. BioTechniques. 29, 844–857.

  44. Михайлович В.М., Лапа С.А., Грядунов Д.А., Стрижков Б.Н., Соболев А.Ю., Скотникова О.И., Иртуганова О.А., Мороз А.М., Литвинов В.И., Шипина Л.К., Владимирский М.А., Черноусова Л.Н., Ерохин В.В., Мирзабеков А.Д. (2001) Выявление устойчивых к рифампицину штаммов микобактерий туберкулеза методом гибридизации и полимеразной цепной реакции на специализированном туберкулезном микрочипе. Бюлл. эксп. биол. мед. 131, 94–98.

  45. Mikhailovich V., Lapa S., Gryadunov D., Sobolev A., Strizhkov B., Chernyh N., Skotnikova O., Irtuganova O., Moroz A., Litvinov V., Vladimirskii M., Perelman M., Chernousova L., Erokhin V., Zasedatelev A., Mirzabekov A. (2001) Identification of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains by hybridization, PCR, and ligase detection reaction on oligonucleotide microchips. J. Clin. Microbiol. 39, 2531–2540.

  46. Tillib S.V., Strizhkov B.N., Mirzabekov A.D. (2001) Integration of multiple PCR amplifications and DNA mutation analyses by using oligonucleotide microchip. Anal. Biochem. 292, 155–160.

  47. Westin L., Xu X., Miller C., Wang L., Edman C.F., Nerenberg M. (2000) Anchored multiplex amplification on a microelectronic chip array. Nat. Biotechnol. 18, 199–204.

  48. Pemov A., Modi H., Chandler D.P., Bavykin S. (2005) DNA analysis with multiplex microarray-enhanced PCR. Nucl. Acids Res. 33, e11.

  49. Lapa S., Mikheev M., Shchelkunov S., Mikhailovich V., Sobolev A., Blinov V., Babkin I., Guskov A., Sokunova E., Zasedatelev A., Sandakhchiev L., Mirzabekov A. (2002) Species-level identification of orthopoxviruses with an oligonucleotide microchip. J. Clin. Microbiol. 40, 753–757.

  50. Михеев М.В., Лапа С.А., Щелкунов С.Н., Чикова А.К., Михайлович В.М., Соболев А.Ю., Бабкин И.В., Грядунов Д.А., Булавкина М.А., Гуськов А.А., Сокунова Е.Б., Кочнева Г.В., Блинов В.М., Сандахчиев Л.С., Заседателев А.С., Мирзабеков А.Д. (2003) Видовая идентификация ортопоксвирусов на олигонуклеотидных микрочипах. Вопр. вирусол. 48, 4–9.

  51. Bespyatykh J.A., Zimenkov D.V., Shitikov E.A., Kulagina E.V., Lapa S.A., Gryadunov D.A., Ilina E.N., Govorun V.M. (2014) Spoligotyping of Mycobacterium tuberculosis complex isolates using hydrogel oligonucleotide microarrays. Infect. Genet. Evol. 26, 41–46.

  52. Рудинский Н.И., Михайлович В.М., Донников М.С., Лапа С.А., Суханова А.Л., Казеннова Е.В., Бобков А.Ф., Заседателев А.С., Покровский В.В., Мирзабеков А.Д. (2004) Разработка биологических микрочипов для выявления мутаций устойчивости ВИЧ-1 к ингибиторам протеазы и результаты их применения. Вопр. вирусол. 49, 10–15.

  53. Gryadunov D., Mikhailovich V., Lapa S., Roudinskii N., Donnikov M., Pan’kov S., Markova O., Kuz’min A., Chernousova L., Skotnikova O., Moroz A., Zasedatelev A., Mirzabekov A. (2005) Evaluation of hybridisation on oligonucleotide microarrays for analysis of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis. Clin. Microbiol. Infect. 11, 531–539.

  54. Inglis P.W., Pappas M.C.R., Resende L.V., Grattapaglia D. (2018) Fast and inexpensive protocols for consistent extraction of high quality DNA and RNA from challenging plant and fungal samples for high-throughput SNP genotyping and sequencing applications. PLoS One. 13, e0206085.

  55. Chiquito-Almanza E., Acosta-Gallegos J.A., García-Álvarez N.C., Garrido-Ramírez E.R., Montero-Tavera V., Guevara-Olvera L., Anaya-López J.L. (2017) Simultaneous detection of both RNA and DNA viruses infecting dry bean and occurrence of mixed infections by BGYMV, BCMV and BCMNV in the Central-West Region of Mexico. Viruses. 9, 63.

Дополнительные материалы отсутствуют.