Молекулярная биология, 2022, T. 56, № 3, стр. 521-527

Новый метод оценки влияния модифицированных трифосфатов дезоксинуклеозидов на изменение состава комбинаторных библиотек для проведения SELEX

С. А. Лапа a*, О. С. Антипова a, А. В. Чудинов a

a Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук
119991 Москва, Россия

* E-mail: lapa@biochip.ru

Поступила в редакцию 21.12.2021
После доработки 13.01.2022
Принята к публикации 13.01.2022

Аннотация

Предложен новый способ оценки субстратной эффективности дезоксинуклеозидтрифосфатов (dNTP), содержащих функциональные группы, для селекции модифицированных аптамеров (mod-SELEX). Метод предполагает проведение трех последовательных раундов ПЦР с комбинаторной библиотекой и модифицированным dNTP – кандидатом для проведения mod-SELEX. Вывод о применимости конкретного производного dNTP основан на характере изменения амплификационной кривой в течение трех раундов ПЦР в режиме реального времени и не требует проведения раундов селекции аптамеров. Если в процессе амплификации библиотека вырождается (становится менее представительной), значит, конкретная модификация dNTP не может использоваться с выбранной полимеразой и другими выбранными условиями амплификации библиотеки, поскольку приводит к конкурентной амплификации. В случае, когда характер амплификационной кривой не меняется, делается вывод, что используемый модифицированный трифосфат дезоксинуклеозида не влияет на распределение олигонуклеотидов с различными последовательностями в составе библиотеки, т.е. не приводит к изменению ее состава с точки зрения применяемого метода детекции. Именно такие производные могут использоваться в выбранных условиях проведения селекции аптамеров. Метод применим для быстрой оценки субстратной пригодности модифицированных dNTP для проведения mod-SELEX и будет полезен при отборе аптамеров для клинической диагностики и научных исследований.

Ключевые слова: модифицированные dNTP, субстратная эффективность, ПЦР в режиме реального времени, mod-SELEX, аптамеры

Список литературы

  1. Rohloff J.C., Gelinas A.D., Jarvis T.C., Ochsner U.A., Schneider D.J., Gold L., Janjic N. (2014) Nucleic acid ligands with protein-like side chains: modified aptamers and their use as diagnostic and therapeutic agents. Mol. Ther. Nucl. Acids. 3, e201.

  2. Лапа С.А., Павлов А.С., Кузнецова В.Е., Шершов В.Е., Спицын М.А., Гусейнов Т.О., Радько С.П., Заседателев А.С., Лисица А.В., Чудинов А.В. (2019) Ферментативное получение модифицированных ДНК: изучение кинетики ПЦР в режиме реального времени. Молекуляр. биология. 53, 513–523.

  3. Tolle F., Wilke J., Wengel J., Mayer G. (2014) By-product formation in repetitive PCR amplification of DNA libraries during SELEX. PLoS One. 9, e114693.

  4. Shao K., Shi X., Zhu X., Cui L., Shao Q., Ma D. (2017) Construction and optimization of an efficient amplification method of a random ssDNA library by asymmetric emulsion PCR. Biotechnol. Appl. Biochem. 64, 239–243.

  5. Schütze T., Wilhelm B., Greiner N., Braun H., Peter F., Mörl M., Erdmann V.A., Lehrach H., Konthur Z., Menger M., Arndt P.F., Glökler J. (2011) Probing the SELEX process with next-generation sequencing. PLoS One. 6, e29604.

  6. Kolm C., Cervenka I., Aschl U.J., Baumann N., Jakwerth S., Krska R., Mach R.L., Sommer R., DeRosa M.C., Kirschner A.K.T., Farnleitner A.H., Reischer G.H. (2020) DNA aptamers against bacterial cells can be efficiently selected by a SELEX process using state-of-the art qPCR and ultra-deep sequencing. Sci. Rept. 10, 20917.

  7. Luo Z., He L., Wang J., Fang X., Zhang L. (2017) Developing a combined strategy for monitoring the progress of aptamer selection. Analyst. 142, 3136–3139.

  8. Sanchez J.C., Zhang L., Evoli S., Schnicker N.J., Nunez-Hernandez M., Yu L., Wereszczynski J., Pufall M.A., Musselman C.A. (2020) The molecular basis of selective DNA binding by the BRG1 AT-hook and bromodomain. Biochim. Biophys. Acta Gene Regul. Mech. 1863, 194566.

  9. Amano R., Aoki K., Miyakawa S., Nakamura Y., Kozu T., Kawai G., Sakamoto T. (2017) NMR monitoring of the SELEX process to confirm enrichment of structured RNA. Sci. Rep. 7, 283.

  10. Müller J., El-Maarri O., Oldenburg J., Pötzsch B., Mayer G. (2008) Monitoring the progression of the in vitro selection of nucleic acid aptamers by denaturing high-performance liquid chromatography. Anal. Bioanal. Chem. 390, 1033–1037.

  11. Thevendran R., Citartan M. (2022) Assays to estimate the binding affinity of aptamers. Talanta. 238, 122971.

  12. Gooch J., Tungsirisurp S., Costanzo H., Napier R., Frascione N. (2021) Generating aptamers towards human sperm cells using massively parallel sequencing. Anal. Bioanal. Chem. 413, 5821–5834.

  13. Чудинов А.В., Шершов В.Е., Павлов А.С., Волкова О.С., Кузнецова В.Е., Заседателев А.С., Лапа С.А. (2020) Одновременное встраивание модифицированных производных dU и dC в растущую цепь ДНК в реакции удлинения праймера и ПЦР. Биоорг. химия. 46, 546–549.

  14. Лапа С.А., Волкова О.С., Кузнецова В.Е., Заседателев А.С., Чудинов А.В. (2022) Изучение множественного ферментативного встраивания модифицированных нуклеотидов пуриновой и пиримидиновой природы в растущую цепь ДНК. Молекуляр. биология. 56, 157–167.

  15. Rahimizadeh K., AlShamaileh H., Fratini M., Chakravarthy M., Stephen M., Shigdar S., Veedu R.N. (2017) Development of cell-specific aptamers: recent advances and insight into the selection procedures. Molecules. 22, 2070.

  16. Sefah K., Shangguan D., Xiong X., O’Donoghue M.B., Tan W. (2010) Development of DNA aptamers using cell-SELEX. Nat. Protoc. 5, 1169–1185.

  17. Чудинов А.В., Киселева Я.Ю., Кузнецова В.Е., Шершов В.Е., Спицын М.А., Гусейнов Т.О., Лапа С.А., Тимофеев Э.Н., Арчаков А.И., Лисица А.В., Радько С.П., Заседателев А.С. (2017) Ферментативный синтез ДНК с высокой степенью модификации. Молекуляр. биология. 51, 534–544.

  18. Лапа С.А., Ромашова К.С., Спицын М.А., Шершов В.Е., Кузнецова В.Е., Гусейнов Т.О., Заседателева О.А., Радько С.П., Тимофеев Э.Н., Лисица А.В., Чудинов А.В. (2018) Получение модифицированных комбинаторных ДНК-библиотек методом ПЦР в обратной эмульсии с последующим разделением цепей. Молекуляр. биология. 52, 984–996.

  19. Ramakers C., Ruijter J.M., Deprez R.H., Moorman A.F. (2003) Assumption-free analysis of quantitative realtime polymerase chain reaction (PCR) data. Neurosci. Lett. 339, 62–66.

  20. Радько С.П., Лапа С.А., Чудинов А.В., Хмелёва С.А., Маннанова М.М., Курбатов Л.К., Киселёва Я.Ю., Заседателев А.С., Лисица А.В. (2019) Оценка разнообразия комбинаторных ДНК-библиотек на основе анализа формы амплификационных кривых для мониторинга эффективности селекции аптамеров. Биомед. хим. 65, 477–484.

Дополнительные материалы отсутствуют.