Молекулярная биология, 2022, T. 56, № 4, стр. 557-563

ВВЕДЕНИЕ

Ранее мы выделили и охарактеризовали белок ENY2, который оказался компонентом множества белковых комплексов, вовлеченных в регуляцию транскрипции и репликации. ENY2 входит в состав транскрипционных комплексов SAGA, AMEX, THO и связывает различные этапы экспрессии генов ‒ организацию транскрипционных доменов и модификацию хроматина, активацию и элонгацию транскрипции, экспорт мРНК и регуляцию пространственного расположения генов в ядре [1‒6]. Кроме того, ENY2 входит также в состав репликационного комплекса ORC, ответственного за позиционирование точек начала репликации [7‒10]. Показано, что белок Su(Hw), содержащий домены цинковых пальцев, взаимодействует с ENY2-содержащими комплексами дрозофилы и необходим для их привлечения на сайты связывания Su(Hw), что необходимо для создания активной структуры хроматина и позиционирования точек начала репликации [1, 2, 5].

В ходе предыдущей работы мы обнаружили взаимодействие ENY2 с еще одним ранее не охарактеризованным белком – CG9890, который содержит домен цинковых пальцев, как и Su(Hw) [11]. Установлено, что белок CG9890 локализован в ядре клетки. Биохимическими методами показано взаимодействие белка CG9890 с комплексами SAGA, ORC, dSWI/SNF, TFIID и THOC [11]. CG9890 связывается с транскрипционными комплексами, вовлеченными в инициацию и элонгацию транскрипции, но не взаимодействует с комплексом AMEX, участвующим в экспорте мРНК из ядра в цитоплазму, что указывает на работу CG9890 в первых стадиях транскрипционного цикла.

Идентифицированы сайты связывания CG9890 в геноме и показано, что они локализованы преимущественно на промоторах генов. Определена полногеномная корреляция сайтов связывания CG9890 и комплексов SAGA, ORC и dSWI/SNF. Сайты связывания белка CG9890 характеризуются более низкой плотностью нуклеосом (представленностью гистона H3), чем в среднем по геному и на промоторах, что указывает на активное состояние этих регуляторных элементов [12]. С использованием метода ОТ-кПЦР проанализировано изменение уровня мРНК 21 CG9890-ассоциированного гена в клетках после РНК-интерференции CG9890 по сравнению с контрольными образцами. Обнаружено, что пять из 10 генов, экспрессия которых изменилась статистически значимо после РНК-интерференции белка CG9890, это гены экдизонового каскада [12].

Учитывая полученные ранее данные, предположили, что белок CG9890 может участвовать в регуляции не только базальной, но и активируемой транскрипции экдизонзависимых генов. Для изучения этого вопроса проведен биоинформатический анализ и идентифицированы все экдизонзависимые гены, промоторы которых содержат белок CG9890. Далее проанализировали активацию этих экдизонзависимых генов после обработки клеток S2 Шнейдер дрозофилы 20-гидроксиэкдизоном как в норме, так и после РНК-интерференции CG9890.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Культивирование клеток линии S2 Шнейдер. РНК-интерференция. Индукция экспрессии экдизонзависимых генов. Клетки культивировали при 25°С в среде Schneider’s insect medium (“Sigma”, США), содержащей 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (“HyClone”, США). дцРНК синтезировали с использованием TranscriptAid T7 High Yield Transcription Kit (“ThermoScientifiс”, США). Нокдаун белков проводили с помощью РНК-интерференции согласно протоколу [13]. Для нокдауна белка CG9890 синтезировали дцРНК длиной 500 п.н., соответствующую начальному участку его кодирующей последовательности. В качестве контроля использовали дцРНК, соответствующую 500-нуклеотидному фрагменту плазмиды pBluescipt II SK(–) (“Stratagene”, США). дцРНК синтезировали с использованием следующих праймеров:

CG9890, CGACTCACTATAGGGAGAACGTAAACAAATGGAGCACG и CGACTCACTATAGGGAGAAGGTGCGGTCGGTTAG;

pBluesciptIISK(–), GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGAGTTACATGATCCCCCATG и GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGATTTCGCCCCGAAGAACG.

В каждый эксперимент по РНК-интерференции дцРНК брали из расчета 30 мкг на 1 млн клеток. По прошествии 5 дней инкубации в среде с дцРНК клетки из каждой чашки рассаживали на две чашки, на следующие сутки (6-е с начала инкубации) в одной из них индуцировали экдизоновый каскад. Клетки из второй чашки служили отрицательным контролем. Все эксперименты по индукции экспрессии экдизонзависимых генов в норме и на фоне РНК-интерференции CG9890 проводили в трех повторах. Для активации экдизонового каскада в клеточную среду добавляли 20-гидроксиэкдизон (“Sigma”, h5142) до концентрации 0.3 мкМ и инкубировали в течение 3 ч. Уровень экспрессии CG9890, экдизонзависимых и контрольных генов, использованных в качестве контроля, измеряли методом обратной транскрипции с последующей ПЦР в реальном времени. Использовали следующие праймеры:

CG9890, GCCGATGTGGAGGATATAGC и GGATGTCACACAGCAGGTAG;

Eip75B-RA, CCTCGTCCATCTCCTCCAG и CACCAGCACCAGCAACAA;

Eip75B-RC, GACGGAGGAGTTGGGAGAA и TACCAGCACAACAGCAAGC;

DHR3, CGGTTGCGATTAACACGGTCC и CTGCAAGGGATTCTTTCGAAGATC;

HR4, GTGCGTCTGCACAATGTTGG и GGAACAGTCCATCAGCTCCTCG;

Eip78C, GCATCTACTACAGCAGCAACA и ATTTGTGGCGTTTGTGGAGTA;

Tret1-1, CATCAACCGCTGAGCAACG и TCCTCTGGCAGAATTGTGTCC;

CR43626, TTCGGTGTGTGGACAGCAAG и GGTTCGATGTCGTACCAACTTCT;

Actin 5C, GGCACCACACCTTCTACAATGAGC, GAGGCGTACAGCGAGAGCACAG;

Tubulin 56D, CGAGAACACGGACGAGACCTACTG и GGAATCGGAGGCAGGTGGTTACG;

ras2, GAGGGATTCCTGCTCGTCTTCG и GTCGCACTTGTTACCCACCATC;

CG5455, TTGGAGGTGGTGGAGAAGAA и CAGCGGTGGTGATTCATCC;

СG8745, TCCAGTGTGCTCGCACGTT и ACATGCACGTAGTCGGGCTT;

CG15279, GGCATAGGATCGAATATAGCCATG и CAGCTCGGCGATTCCCAGTA;

E23, AGCAGCAGCAGCAACAACAG и GCAACTGTTTCCTGTTTAGCTGG;

Fatp3, CAGTGGTGGCTCTCCTGCTC и ATCGTCCATCACGAAGCATGT;

Eip74EF, GTCGGAGGCTACGGATTCAGA и ACCAGGTGCCATAGTTGATACCG.

Идентификация сайтов связывания белка CG9890 в геноме дрозофилы. Исходные данные с геномного секвенатора Illumina HiSeq2000 выравнивали на геном дрозофилы dmel_r6.40 с помощью программы Hisat2 в режиме end-to-end. Программа Hisat2 предназначена для обработки данных РНК-Seq, но ее также удобно использовать и для данных ChIP-Seq с ключом no-spliced-alignment. Также устанавливали ключ -a, который позволяет искать множественные выравнивания, с целью их исключения из анализа. В дальнейшую работу брали только уникально картированные риды, обрабатывая флаг “NH:i” в результатах вывода программы Hisat2. Также брали только те риды, уровень мисматчей в которых был менее 5%, обрабатывая флаг “XM:i” в результатах вывода программы Hisat2. Фильтрацию осуществляли с помощью собственной программы. Сайты связывания белка CG9890 определяли с помощью программы MACS2 с использованием параметров по умолчанию (q-value < 0.05).

Анализ сайтов связывания белка CG9890 в промоторных областях генов. Промоторные области определяли из аннотации транскриптов генома дрозофилы dmel_r6.40. Промоторной областью считали интервал ±500 п.н. от старта транскрипции. Считали, что сайт связывания находится в промоторной области гена, если пик сайта связывания попадает в заданный интервал. Анализ проводили с помощью программы bedtools. Кроме того, сайты связывания белка CG9890 в области экдизоновых генов дополнительно контролировали путем совмещения структуры транскриптов из геномного браузера и профиля ChIP-Seq (рис. 1). Исследование зависимости транскрипции генов от обогащения белка CG9890 на их промоторах проводили в программе Microsoft Excel, включая расчет коэффициента корреляции.

Рис. 1.

ChIP-Seq-профиль белка CG9890 в области экдизонзависимого гена Eip75B. На верхней панели представлена структура транскриптов из геномного браузера, на нижней панели – сам ChIP-Seq -профиль.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

CG9890 принимает участие в активации экдизонзависимых генов

Далее провели анализ активации выбранных на предыдущем этапе экдизонзависимых генов в обработанных 20-гидроксиэкдизоном клетках ‒ нормальных и после РНК-интерференции CG9890. Проанализировали два разных экдизонзависимых транскрипта гена Eip75B ‒ содержащего CG9890 на промоторе и без этого белка. Результаты анализа представлены на рис. 2.

Рис. 2.

Активация транскрипции экдизонзависимых (а‒г) и контрольных генов (д) в ответ на добавление 20-гидроксиэкдизона к S2 клеткам дрозофилы через 3 ч после индукции. Названия генов указаны под диаграммами. На вертикальной оси указана степень активации транскрипции. Светлые столбцы соответствуют активации транскрипции в нормальных клетках, темные столбцы ‒ активации транскрипции при РНК-интерференции гена CG9890. Измерения проводили в трех повторах. Линии погрешностей соответствуют стандартной ошибке среднего.

Экспрессия экдизонзависимых генов существенно повышается в ответ на обработку клеток экдизоном в отличие от контрольных генов. Еще большая степень активации 8 из 12 генов наблюдается в клетках после РНК-интерференции белка CG9890 по сравнению с контрольной линией клеток (рис. 2а‒в). Транскрипция контрольных генов при РНК-интерференции CG9890 не изменяется (рис. 2д). Интересно, что уровень транскрипта Eip75B-RC, синтезируемого с промотора, с которым связывается CG9890, повышается при РНК-интерференции CG9890, тогда как уровень транскрипта Eip75B-RA, синтезируемого с промотора, не занятого белком CG9890, не отличается от уровня в контрольных клетках (рис. 2в). На активацию четырех экдизонзависимых генов РНК-интерференция CG9890 не влияет (рис. 2г). На основе полученных данных можно сделать вывод, что белок CG9890 выступает как репрессор экдизонзависимой активации транскрипции.

Характеристика группы CG9890-ассоциированных генов

Ранее мы изучали роль CG9890 в регуляции базальной транскрипции (без активации экдизоном) и обнаружили, что транскрипция части генов возрастает, а части снижается в результате РНК-интерференции CG9890. Белок CG9890 входит в семейство белков с доменами цинковых пальцев, значительная часть которых является факторами транскрипции [15]. Показана зависимость между присутствием многих из белков этого семейства на промоторах и уровнем экспрессии соответствующих генов [16, 17]. Мы решили проверить существование подобной зависимости для белка CG9890. Мы проанализировали ChIP-Seq-профиль белка CG9890 и обнаружили его сайты связывания на промоторах 3160 индивидуальных транскриптов ‒ продуктов 2803 генов, что составляет 15.8% от общего числа аннотированных генов дрозофилы. Так как ChIP-Seq CG9890 выполнен в клетках линии S2, мы проанализировали транскрипцию соответствующих генов также в этой линии и исследовали зависимость транскрипции генов от обогащения белка CG9890 на их промоторах. Результаты представлены на рис. 3. Видно отсутствие корреляции между уровнем представленности белка CG9890 на промоторах данных генов и уровнем их экспрессии в клетках S2 (коэффициент корреляции Спирмена 0.03).

Рис. 3.

Обогащение белка CG9890 на промоторах генов и уровень их экспрессии. По горизонтальной оси представлены 2803 гена, отсортированные по убыванию экспрессии слева направо. Сплошной линией показана экспрессия соответствующих генов, точки указывают представленность CG9890 на промоторах этих генов в терминах z-score (стандартные отклонения относительно среднего).

Иными словами, белок CG9890 локализован на промоторах генов как с сильной, так и со слабой экспрессией. Такая локализация на промоторах генов с различной экспрессией характерна также для классических репрессорных факторов — NELF [18, 19] и белков Polycomb-группы [20]. Этот результат позволяет нам предположить, что белок CG9890 не является классическим транскрипционным фактором-активатором, а функционирует по сходным с белками-репрессорами механизмам. Противоположное влияние белка CG9890 на экспрессию различных генов может быть опосредовано вторичными эффектами его нокдауна в клетке. Ранее мы показали, что белок CG9890 локализуется на промоторах многих генов регуляторных факторов. Изменение экспрессии этих белков влияет на экспрессию подконтрольных им генов. В частности, при РНК-интерференции изучаемого белка на 40% падает количество мРНК белка Su(z)2 [12], субъединицы комплекса PRC1, который участвует в репрессии большого числа генов дрозофилы. Это, в свою очередь, может привести к активации каких-то PRC-зависимых генов и изменению экспрессии их генов-мишеней.

Ранее мы обнаружили взаимодействие белка CG9890 с мультифункциональным консервативным белком ENY2 и с белковыми комплексами SAGA, ORC, dSWI/SNF, TFIID и THOC [11]. Cайты связывания CG9890 в геноме дрозофилы локализованы преимущественно на промоторах генов. Белок CG9890 участвует в регуляции экспрессии части генов, на промоторах которых он находится [12]. Нами изучена роль белка CG9890 в регуляции экдизонзависимой индуцибельной транскрипции. С этой целью идентифицированы 12 экдизонзависимых генов, на промоторах которых локализован белок CG9890. Изучена их активация, вызванная добавлением 20-гидроксиэкдизона, как в нормальных клетках, так и после РНК-интерференции CG9890. Экспрессия экдизонзависимых генов существенно повышается в ответ на обработку клеток экдизоном, в отличие от контрольных генов. Причем в клетках после РНК-интерференции CG9890 транскрипция 8 из 12 генов была значительно выше, чем в контрольной линии. Таким образом, белок CG9890 участвует в регуляции транскрипции экдизонзависимых генов, выступая в большинстве случаев, в роли репрессора.

Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда (грант № 20-14-00269). Работа выполнена с использованием оборудования ЦКП ИБГ РАН.

В данной работе не использовали людей и животных в качестве объектов исследования.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.