1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Молекулярная биология
  4. T. 56, № 6, 2022

Молекулярная биология, 2022, T. 56, № 6, стр. 884-891

Противовирусное действие рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/Cas9 на модели вируса гепатита В in vivo

А. П. Костюшева a, С. А. Брезгин a, b, Н. И. Пономарева a, b, И. А. Гоптарь c, А. В. Никифорова c, В. И. Гегечкори a, В. Б. Полэуктова a, К. А. Туркадзе a, А. Е. Судьина d, В. П. Чуланов a, b, Д. С. Костюшев a, b, *

a Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Министерства здравоохранения (Сеченовский университет)
119048 Москва, Россия

b Научно-технологический университет “Сириус”
354340 Сочи, Россия

c Научно-исследовательский институт медицины труда
105275 Москва, Россия

d Центр стратегического планирования Федерального медико-биологического агентства России
119121 Москва, Россия

* E-mail: dkostushev@gmail.com

Поступила в редакцию 31.03.2022
После доработки 23.05.2022
Принята к публикации 23.05.2022

Полный текст (PDF)

Аннотация

Хронический гепатит В (ХГВ) вызывается вирусом гепатита В (ВГВ) и представляет одну из ключевых проблем мирового здравоохранения. Современные методы терапии не позволяют полностью элиминировать ВГВ из инфицированных клеток и, следовательно, излечить хроническую форму инфекции. Системы сайт-специфических нуклеаз CRISPR/Cas9 могут эффективно разрезать целевые последовательности ДНК, в том числе вирусные геномы. Разрезание основной формы генома ВГВ – кольцевой ковалентно замкнутой ДНК (ккзДНК) – приводит к значительному подавлению вирусной репликации, разрушению либо мутационной инактивации ккзДНК. К числу наиболее перспективных для “стерилизующего” излечения ХГВ, т.е. для полной элиминации вируса из организма, относятся подходы на основе CRISPR/Cas9. На модели ВГВ у мышей in vivo нами изучено противовирусное действие комплексов высокоспецифичного белка Cas9 и РНК-проводника, направленных на геном ВГВ. Показано, что однократная инъекция короткоживущих рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/Cas9 уже к 48 ч снижает уровни ДНК ВГВ в сыворотке и печени мышей примерно в 10 раз, при этом в оставшихся ДНК ВГВ детектируются редкие мутации по типу вставок и делеций. Создание препаратов для лечения ХГВ на основе рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/Cas9 в перспективе может существенно сократить сроки лечения и привести к полной элиминации вируса из организма.

Ключевые слова: генетическое редактирование, противовирусные препараты, геномные технологии, NGS

ВВЕДЕНИЕ

Хронический гепатит В (ХГВ) – тяжелое заболевание печени, вызываемое инфицированием гепатоцитов человека вирусом гепатита В (ВГВ). ХГВ встречается во всех странах земного шара, при этом наибольшее распространение ХГВ зарегистрировано в Азиатско-Тихоокеанском регионе, странах Африки и бассейне Амазонки, где до 8% населения являются носителями HBsAg ВГВ. В странах Восточной и Южной Европы, Ближнего Востока, Японии и ряде стран Южной Америки распространенность ХГВ варьирует в пределах 2–7%. В странах Северной Америки, Северной и Западной Европы, Австралии доля лиц с ХГВ в общей популяции составляет 0.5–2%. Распространенность ХГВ в Российской Федерации составляет около 2% [1]. Несмотря на существование эффективной вакцины, а также ряда безопасных лекарственных препаратов, способных подавлять репликацию ВГВ, ХГВ остается одной из главных проблем мирового здравоохранения. При прекращении приема противовирусных препаратов происходит восстановление репликации ВГВ, ассоциированной с высокими рисками развития рака и цирроза печени [2]. Причина хронизации инфекции и высокой персистенции вируса – сложный жизненный цикл ВГВ, ориентированный на сохранение в ядре инфицированных клеток основной формы вирусного генома – кольцевой ковалентно замкнутой ДНК (ккзДНК). ккзДНК ВГВ представляет собой минихромосому, с которой считываются все вирусные РНК. Длительное (в течение всей жизни инфицированных) поддержание пула ккзДНК связано с высокой стабильностью минихромосом, а также с существованием механизмов восполнения пула ккзДНК за счет образования ккзДНК de novo из формы-предшественника. Пул ккзДНК восстанавливается за счет реинфекции (повторного заражения клеток), а также реимпорта геномной формы-предшественника в ядро [3].

Системы CRISPR/Cas9 считаются перспективными молекулярными инструментами, позволяющими осуществлять разработку препаратов для лечения ХГВ. Выраженная противовирусная активность различных систем CRISPR/Cas9 неоднократно показана на моделях ВГВ-инфекции in vitro и in vivo [4–12]. В ранних работах CRISPR/Cas9 доставляли с использованием ДНК-векторов на основе вирусов, тогда как в последнее время основное внимание привлекают невирусные методы доставки кодирующих мРНК Cas9/РНК-проводников [13] и РНП [14, 15]. Невирусные методы имеют несомненные преимущества как по эффективности действия CRISPR/Cas9, так и по безопасности (меньшая иммуногенность, меньшая вероятность внецелевого действия и др.) [16].

В нашей работе на модели ВГВ у мышей in vivo впервые оценен противовирусный эффект однократного введения РНП CRISPR/Cas9.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Получение РНК-проводника с помощью реакции транскрипции in vitro. Продукт ПЦР, кодирующий РНК-проводник под T7-промотором, получен с помощью Q5-полимеразы на основе продукта U6-PCR, как описано ранее [2]. В синтезе использовали праймеры ultramerT7_f и St1_r. ПЦР-продукт под Т7-промотором служил матрицей для in vitro транскрипции (IVT) с использованием набора для синтеза РНК HiScribe Quick T7 High Yield (“NEB”, США) по протоколу производителя. Продукт реакции IVT инкубировали в течение ночи, а затем обрабатывали ДНКазой I (“New England Biolabs”, Великобритания) в течение 15 мин при 37°C с последующей очисткой изопропанолом. К реакционной смеси добавляли изопропанол и 0.5 М NaCl, центрифугировали в течение 30 мин. Далее осадок дважды промывали 70 и 95%-ным этанолом. Высушенный на воздухе осадок ресуспендировали в воде, свободной от РНКаз, и хранили при –80°С. Нуклеотидные последовательности спейсеров РНК-проводников и праймеры описаны ранее [6].

Получение и очистка белка Cas9. Белок нарабатывали в клетках pLysS Escherichia coli BL21 (DE3) (“Novagen”). Клетки выращивали в среде LB (с добавлением соответствующего антибиотика, 0.5% сахарозы, 0.5% глицерина, 1 мМ хлорида магния, 50 мМ дигидрофосфата натрия, 50 мМ дигидрофосфата калия, 25 мМ сульфата аммония) при 30°C до OD600 = 1.2. Экспрессию белка индуцировали 0.1 мМ IPTG в течение 16 ч при 18°С. Белок очищали с помощью аффинной и ионообменной хроматографии. Клетки ресуспендировали в 50 мМ буфере Трис-HCl pH 8.0, содержащем 500 мМ NaCl, 1 мМ PMSF, 0.2% Triton X-100, 0.1% Tween-20, обрабатывали ультразвуком на льду и центрифугировали при 15000 g в течение 40 мин. Осветленный лизат обрабатывали 0.05%-ным полиэтиленимином в течение 30 мин при 4°C, полученную суспензию центрифугировали при 15000 g в течение 40 мин. Супернатант связывали с Ni-хелатирующей сефарозой (“GE Healthcare”, США), промывали в 50 мМ буфере Трис-HCl pH 8.0, содержащем 500 мМ NaCl, 0.05% Igepal CA-630, и элюировали 50 мМ Трис-HCl pH 8.0 со 150 мМ NaCl, 0.3 М имидазола, 10% глицерина. Затем белок связывали с SP-сефарозой (“GE Healthcare”) в 50 мМ Трис-HCl-буфере pH 7.5, содержащем 150 мМ NaCl, 0.01% Тriton Х-100, 2 мМ ДТТ, элюировали линейным градиентом NaCl (150 мМ–1 М). Добавляли глицерин до 50% и хранили при –20°С.

Реакция разрезания ДНК-мишени in vitro. Плазмида 1.1-мерВГВ, содержащая 1.1 генома ВГВ (генотип D, подтип ayw), предоставлена Dieter Glebe (Giessen University, Германия). Рекомбинантный белок Cas9 смешивали с транскрибированным in vitro РНК-проводником в молярном соотношении 1 : 1 в буфере NEB3.1 и инкубировали в течение 10 мин для сборки РНП-комплексов. Затем в реакцию добавляли 200 нг плазмиды 1.1-мерВГВ. Реакционную смесь инкубировали в течение 1 ч при 37°С с последующей инактивацией при 95°С в течение 3 мин. Продукты разрезания визуализировали с помощью гель-электрофореза в 0.8%-ном агарозном геле.

Эксперименты на мышах. Эксперименты проводили согласно [17] на мышах линии BALB/c (самцы 6–8 недель, по три особи в группе) с небольшими модификациями. Плазмиду 1.1-мерВГВ (4 мкг) вводили в хвостовую вену мышей в 0.9%-ном растворе NaCl, эквивалентном по массе 8% массы тела животного, в течение 5–8 с. Через 6 ч после гидродинамической инъекции в пробирках смешивали белок StCas9 и РНК-проводник St10 (либо контрольный РНК-проводник Stnc) в соотношении 3.15 мкг белка к 0.63 мкг РНК-проводника на мышь, смесь инкубировали в течение 10 мин для образования РНП-комплексов. Полученные РНП смешивали с 36 мкл реактива Lipofectamine3000 и инкубировали в течение 10 мин. Полученные липосомы вводили в хвостовую вену мышей. Через 48 ч после инъекции ВГВ-кодирующих плазмид животных усыпляли в эксикаторе с хлороформом, подвергали дислокации шейных позвонков, затем проводили эксплантацию органов, забор крови и отделение плазмы. Печень мышей погружали в среду O.C.T. (“SCIgen”, США), замораживали в жидком азоте и хранили при –80°С.

Выделение нуклеиновых кислот. Нуклеиновые кислоты выделяли с помощью набора РИБО-преп (“AmpliSens”, Россия) по протоколу производителя. Образцы печени животных гомогенизировали с помощью прибора MagNA Lyser (“Hoffmann-La Roche”, Швейцария) по протоколу производителя, к гомогенату добавляли лизирующий буфер. ДНК ВГВ выделяли из плазмы мышей с помощью набора РИБО-преп (“AmpliSens”) по протоколу производителя. Образцы нуклеиновых кислот, выделенных из гомогената печени, использовали для анализа внутрипеченочной ДНК ВГВ с нормированием на ген β-глобина, в образцах плазмы определяли количество ДНК ВГВ.

ПЦР-анализ. Полуколичественную ПЦР проводили со специфическими праймерами и зондами TaqMan для ДНК ВГВ и гена β-глобина [7, 12] на приборе Rotor Gene 6000. Использовали праймеры на ДНК ВГВ и ген β-глобина из коммерческого набора AmpliSens HBV-FL и V31-FEP-CE – АMPLISENS® HPV HCR-SCREEN (“AmpliSens”).

Иммуногистохимия. Криостатные срезы толщиной 6 мкм получены из блоков O.C.T. печени мышей. Срезы фиксировали в 4%-ном растворе параформальдегида в течение 10 мин при комнатной температуре. Срезы после отмывки в Трис-HCl (50 мМ, рН 8.0, 3 раза по 10 мин) инкубировали с блокирующим буфером (0.02% Тriton Х-100, 10% сыворотки лошади, 150 мМ NaCl в растворе Трис-HCl (50 мМ, рН 8.0)) в течение 30 мин. Далее срезы инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре с первичными анти-HBcAg-антителами мыши (ab8637) и первичными анти-FLAG-антителами кролика (ab1162), отмывали 3 раза по 10 мин промывочным буфером (0.02% Тритон Х-100, 200 мМ NaCl в растворе Трис-HCl (50 мМ, рН 8.0)), а затем инкубировали со вторичными антимышиными антителами козы AlexaFluor488 (ab150105), вторичными антикроличьими антителами козы AlexaFluor594 (ab150080) и реактивом Hoechst33324 (“Abcam” ab228351, Великобритания) в течение 1 ч при комнатной температуре. Срезы повторно промывали 3 раза по 10 мин промывочным буфером и фиксировали реагентом Fluoroshield (“Abcam” ab104135), визуализировали на флуоресцентном микроскопе Leica DMI6000 с иммерсионными объективами ×20. Работу проводили с использованием оборудования ЦКП ИБР им. Н.К. Кольцова РАН.

Высокопроизводительное секвенирование. Регион ДНК ВГВ, кодирующий РНК-проводник St10, амплифицировали с помощью высокоточной полимеразы Q5 (“New England Biolabs,”CША) из образцов ДНК из ткани печени. Использовали праймеры:

Seq_f: 5′-TTAACAGGCCTATTGATTGGAAA-3′; Seq_r: 5′-CAGAGGAGCCGAAAAGGTTC-3′. Ампликоны очищали на агарозном геле и выделяли с помощью набора Qiagen Gel Extraction Kit (“QIAGEN”, CША), концентрацию ампликонов измеряли на флуориметре Qubit 2.0 (“Life Technologies”, США). Далее проводили лигирование адапторов для секвенирования на платформе Illumina. Полученные библиотеки секвенировали с помощью парных прочтений на инструменте MiSeq (“Illumina”, CША). Выравнивание на референсную последовательность и получение сборок проводили в программе Geneious. Количество вставок и делеций нуклеотидов в сборках подсчитывали с помощью кода Python (доступен на GitHub, https://github.com/babinyurii/crispr_cas9).

Статистический анализ. Статистическую обработку проводили с помощью t-критерия Стьюдента с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 7; попарные апостериорные сравнения проводили с помощью критерия Тьюки. Различия считали статистически значимыми при p < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Оценка разрезания генома ВГВ РНП-комплексами CRISPR/Cas9

В работе мы использовали белок Cas9 Streptococcus thermophilus (StCas9) и высокоэффективный РНК-проводник St10, описанные ранее [6]. Для оценки возможности разрезания плазмиды 1.1-мерВГВ (плазмида содержит 1.1-мер генома ВГВ под контролем цитомегаловирусного промотора) получены РНП CRISPR/Cas9, состоящие из рекомбинантного белка StCas9 и РНК-проводника St10, транскрибированного в реакции in vitro. При инкубации РНП CRISPR/Cas9 с ВГВ-кодирующей плазмидой (1 ч при 37°C) система StCas9-St10 эффективно разрезала ДНК-мишень, о чем можно судить по изменению электрофоретической подвижности линеаризованной плазмиды (рис. 1). Следовательно, полученные комплексы РНП CRISPR/Cas9 эффективно разрезают мишень ВГВ в плазмиде.

Рис. 1.

Нуклеолитическое действие РНП StCas9 с РНК-проводником St10 с ВГВ-кодирующей плазмидой. М – маркер длин фрагментов ДНК; ВГВ – ВГВ-кодирующая плазмида; St10 – ВГВ-кодирующая плазмида, разрезанная комплексом StCas9 с РНК-проводником St10.

РНП CRISPR/Cas9 снижают уровни ДНК и HBcAg ВГВ in vivo

Плазмиду 1.1мерВГВ вводили в хвостовую вену мышей BALB/c с помощью гидродинамической инъекции. Через 6 ч с использованием реактива Lipofectamine 3000 проводили инъекцию РНП StCas9-St10. Контролем служили комплексы РНП StCas9-Stnc с некодирующим РНК-проводником. Противовирусное действие анализировали через 48 ч после начала эксперимента по уровню ДНК ВГВ в сыворотке крови и ткани печени, а также по иммуногистохимическому окрашиванию на HBcAg ВГВ. Для определения меченных FLAG StCas9-белков в гепатоцитах мыши проводили иммуногистохимическое окрашивание с антителами к FLAG (схема эксперимента представлена на рис. 2а).

Рис. 2.

Противовирусное действие РНП CRISPR/Cas9 на модели гидродинамической инъекции ВГВ-кодирующей плазмиды. а – Схема эксперимента. Анализ уровней ДНК ВГВ: ДНК ВГВ в сыворотке крови (б) и внутрипеченочная ДНК ВГВ (в) через 48 ч после инъекции. Планки погрешностей соответствуют стандартным отклонениям. ns – статистически незначимые отличия. Рис. а создан в программе BioRender. ИГХ – иммуногистохимический анализ.

В результате, к 48 ч после однократного введения РНП StCas9-St10 наблюдали снижение уровня ДНК ВГВ в сыворотке крови (ns, p = 0.0520) (рис. 2б) и в ткани печени примерно в 10 раз (p = = 0.0203) (рис. 2в).

С использованием иммуногистохимического окрашивания на срезах печени выявлены многочисленные HBcAg-позитивные клетки, что подтверждает эффективную доставку ВГВ-кодирующих плазмид в гепатоциты при помощи гидродинамической инъекции. Сравнение групп StCas9-St10 и StCas9-Stnc показало незначительное снижение содержания (%) HBcAg-позитивных клеток в группе с ВГВ-таргетирующим РНК-проводником St10, однако эти различия оказались статистически незначимыми (p = 0.1021). Окрашивание на белок StCas9 не выявило клеток с внутриядерной локализацией StCas9, что может свидетельствовать либо об исчезновении короткоживущих РНП из ткани печени, либо о низкой эффективности доставки РНП в составе липосом.

Таким образом, на модели гидродинамической инъекции ВГВ in vivo нами впервые показана противовирусная активность однократно введенных короткоживущих комплексов РНП CRISPR/Cas9.

Рис. 3.

Оценка StCas9- и HBcAg-позитивных клеток в гистологических срезах печени мышей. а – Иммунофлуоресцентное окрашивание срезов печени мышей через 48 ч после инъекции: StCas9 (красное), HBcAg (зеленое), ядра клеток (синее). Размерная шкала 50 нм. б – Полуколичественная оценка содержания HBcAg-позитивных клеток в группах мышей (процент от общего числа клеток в видимом поле). Планки погрешностей соответствуют стандартным отклонениям. ns – статистически незначимые отличия.

Анализ генетического редактирования ДНК ВГВ при использовании StCas9 РНП in vivo

Разрезание генома ВГВ системами CRISPR/Cas9 приводит к значительному подавлению репликации вируса. Разрывы генома ВГВ, вызванные действием сайт-специфических нуклеаз, либо репарируются, как правило, со сдвигом рамок считывания [4], либо разрушаются [7]. Для оценки частоты мутаций в геноме ВГВ в ответ на РНП CRISPR/Cas9 из ткани печени мышей выделена ДНК ВГВ. Участок вирусного генома, фланкирующий мишень St10, был амплифицирован с помощью специфических праймеров и проанализирован с помощью высокопроизводительного секвенирования.

В результате, в образцах, полученных от контрольных мышей с StCas9-Stnc, не обнаружили мутаций по типу делеций и вставок нуклеотидов в целевом сайте В то же время, в группе мышей с таргетирующим РНК-проводником St10 детектируются редкие делеции и вставки нуклеотидов. Таким образом, частоты генетического редактирования внутрипеченочной ДНК ВГВ составляют 0.319693 – для делеций и 0.155376 – для вставок нуклеотидов на 1000 прочтений.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Эффективность противовирусного действия CRISPR/Cas9 на моделях ХГВ определяется множеством вирусологических, иммунологических, молекулярных и технических факторов (подробно рассмотрено в обзоре [16]). Наиболее перспективной для создания препаратов, эффективных при ХГВ, представляется доставка РНП CRISPR/Cas9 в гепатоциты человека с помощью функционализированных (гепатотропных) наночастиц. Быстрое разрезание вирусных геномов при минимальных рисках внецелевого разрезания короткоживущими РНП может обеспечивать широкое окно терапевтического действия с минимальными рисками развития токсических эффектов. Дополнительные уровни безопасности могут обеспечиваться высокоспецифичными вариантами Cas-белков (слитые белки и белки с увеличенной специфичностью, такие как eSpCas9, Hypa-Cas9, Sniper-Cas9, evoCas9 и др.) [6, 16, 18], а также улучшенными версиями РНК-проводников, в том числе, с помощью химических и генетических модификаций структуры РНК-проводников и отдельных нуклеотидов [19].

Создание эффективных и безопасных методов системной доставки РНП CRISPR/Cas9 является одним из ключевых направлений в области разработки лекарственных средств на основе технологий генетического редактирования. В последние годы создан ряд перспективных средств доставки, включая вирусоподобные частицы, биологические частицы, наночастицы на основе биополимеров, композитных материалов и др. [20, 21].

Нами впервые изучено противовирусное действие РНП CRISPR/Cas9 при его однократном введении на модели ВГВ у мышей in vivo. Однократное введение РНП CRISPR/Cas9, даже с учетом неоптимальной системы доставки в виде коммерческих липосом, снижало примерно в 10 раз вирусную нагрузку по параметру ДНК ВГВ в сыворотке крови и печени мышей (рис. 2б, в). Процент ВГВ-позитивных клеток (по параметру HBcAg) практически не изменялся, что можно объяснить как длительным периодом полужизни вирусных белков, так и неполной элиминацией вируса из инфицированных клеток. При анализе целевых мутаций, обусловленных действием CRISPR/Cas9, обнаружены редкие делеции и вставки нуклеотидов (частота ~0.1–0.3/1000 прочтений). Важно отметить, что схожие значения частоты мутаций в целевом сайте наблюдались в ходе длительной (до 62 суток) продукции CRISPR/Cas9 с аденоассоциированного вектора у гуманизированных мышей, инфицированных ВГВ [22]. Низкая частота мутаций в сайте целевого разрезания на моделях ВГВ с одновременным значительным подавлением вирусной нагрузки, скорее всего, связана с преимущественным разрушением вирусных геномов, как описано ранее [7].

Системы CRISPR/Cas9 позволяют в короткие сроки элиминировать бóльшую часть геномов ВГВ из инфицированных клеток. Использование CRISPR/Cas9 в виде РНП в сочетании с невирусными методами доставки может существенно сократить процесс лечения пациентов с ХГВ и обеспечить полную элиминацию ВГВ из организма. Учитывая, что уже существуют подходы к созданию эффективных и безопасных комплексов CRISPR/Cas9 для разрезания ВГВ, ключевым барьером на пути использования систем генетического редактирования в клинической практике является отсутствие эффективных и безопасных средств системной доставки РНП.

Благодарим Юрия Бабина за помощь в анализе биоинформатических данных.

Работа выполнена при поддержке гранта Российского научного фонда (№ 20-15-00373).

Все процедуры, проведенные с участием животных, соответствовали этическим стандартам учреждений или принятой практике таких исследований.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Список литературы

  1. World Health Organization (2017) Global Hepatitis Report, 2017.

  2. Чуланов В.П., Зуева А.П., Костюшев Д.С., Брезгин С.А., Волчкова Е.В., Малеев В.В. (2017) Гепатит С стал излечим. Гепатит В – следующий? Терапевтический архив. 89, 4–13.

  3. Ko C., Chakraborty A., Chou W.-M., Hasreiter J., Wettengel J.M., Stadler D., Bester R., Asen T., Zhang K., Wisskirchen K. (2018) Hepatitis B virus (HBV) genome recycling and de novo secondary infection events maintain stable cccDNA levels. J. Hepatol. 69(6), 1231–1241. https://doi.org/10.1016/j.jhep.2018.08.012

  4. Seeger C., Sohn J.A. (2016) Complete spectrum of CRISPR/Cas9-induced mutations on HBV cccDNA. Mol. Ther. 24, 1258–1266. https://doi.org/10.1038/mt.2016.94

  5. Seeger C., Sohn J.A. (2014) Targeting hepatitis B virus with CRISPR/Cas9. Mol. Ther. Nucl. Acids. 3, e216. https://doi.org/10.1038/mtna.2014.68

  6. Kostyushev D., Brezgin S., Kostyusheva A., Zarifyan D., Goptar I., Chulanov V. (2019) Orthologous CRISPR/Cas9 systems for specific and efficient degradation of covalently closed circular DNA of hepatitis B virus. Cell. Mol. Life Sci. 76(9), 1779–1794. https://doi.org/10.1007/s00018-019-03021-8

  7. Kostyushev D., Kostyusheva A., Brezgin S., Zarifyan D., Utkina A., Goptar I., Chulanov V. (2019) Suppressing the NHEJ pathway by DNA-PKcs inhibitor NU7026 prevents degradation of HBV cccDNA cleaved by CRISPR/Cas9. Sci. Rep. 9, 1847.

  8. Li H., Sheng C., Liu H., Wang S., Zhao J., Yang L., Jia L., Li P., Wang L., Xie J., Xu D., Sun Y., Qiu S., Song H. (2018) Inhibition of HBV expression in HBV transgenic mice using AAV-delivered CRISPR-SaCas9. Front. Immunol. 9, 2080. https://doi.org/10.3389/fimmu.2018.02080

  9. Lin S.-R., Yang H.-C., Kuo Y.-T., Liu C.-J., Yang T.-Y., Sung K.-C., Lin Y.-Y., Wang H.-Y., Wang C.-C., Shen Y.-C., Wu F.-Y., Kao J.-H., Chen D.-S., Chen P.-J. (2014) The CRISPR/Cas9 system facilitates clearance of the intrahepatic HBV templates in vivo. Mol. Ther. Nucl. Acids. 3, e186. https://doi.org/10.1038/mtna.2014.38

  10. Kennedy E.M., Kornepati A.V.R., Cullen B.R. (2015) Targeting hepatitis B virus cccDNA using CRISPR/Cas9. Antiviral Res. 123, 188–192. https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2015.10.004

  11. Zhen S., Hua L., Liu Y.H., Gao L.C., Fu J., Wan D.Y., Dong L.H., Song H.F., Gao X. (2015) Harnessing the clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/CRISPR-associated Cas9 system to disrupt the hepatitis B virus. Gene Ther. 22, 404–412. https://doi.org/10.1038/gt.2015.2

  12. Kostyusheva A.P., Kostyushev D.S., Brezgin S.A, Zarifyan D.N, Volchkova E.V., Chulanov V.P. (2019) Small molecular inhibitors of DNA double strand break repair pathways increase the anti-HBV activity of CRISPR/Cas9. Mol. Biol. 53, 274–285.

  13. Jiang C., Mei M., Li B., Zhu X., Zu W., Tian Y., Wang Q., Guo Y., Dong Y., Tan X. (2017) A non-viral CRISPR/Cas9 delivery system for therapeutically targeting HBV DNA and pcsk9 in vivo. Cell. Res. 27, 440.

  14. Suzuki Y., Onuma H., Sato R., Sato Y., Hashiba A., Maeki M., Tokeshi M., Kayesh M.E.H., Kohara M., Tsukiyama-Kohara K., Harashima H. (2021) Lipid nanoparticles loaded with ribonucleoprotein-oligonucleotide complexes synthesized using a microfluidic device exhibit robust genome editing and hepatitis B virus inhibition. J. Control. Release. 330, 61–71. https://doi.org/10.1016/j.jconrel.2020.12.013

  15. Wang D., Chen L., Li C., Long Q., Yang Q., Huang A., Tang H. (2022) CRISPR/Cas9 delivery by NIR-responsive biomimetic nanoparticles for targeted HBV therapy. J. Nanobiotechnol. 20, 1–16.

  16. Kostyushev D., Kostyusheva A., Ponomareva N., Brezgin S., Chulanov V. (2021) CRISPR/Cas and hepatitis B therapy: technological advances and practical barriers. Nucl. Acid Ther. 32(1), 14–28. https://doi.org/10.1089/nat.2021.0075

  17. Li L., Li S., Zhou Y., Yang L., Zhou D., Yang Y., Lu M., Yang D., Song J. (2017) The dose of HBV genome contained plasmid has a great impact on HBV persistence in hydrodynamic injection mouse model. Virol. J. 14, 1–11.

  18. Liu Y., Zhao M., Gong M., Xu Y., Xie C., Deng H., Li X., Wu H., Wang Z. (2018) Inhibition of hepatitis B virus replication via HBV DNA cleavage by Cas9 from Staphylococcus aureus. Antiviral Res. 152, 58–67. https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2018.02.011

  19. Yin H., Song C.-Q., Suresh S., Wu Q., Walsh S., Rhym L.H., Mintzer E., Bolukbasi M.F., Zhu L.J., Kauffman K. (2017) Structure-guided chemical modification of guide RNA enables potent non-viral in vivo genome editing. Nat. Biotechnol. 35, 1179–1187.

  20. Banskota S., Raguram A., Suh S., Du S.W., Davis J.R., Choi E.H., Wang X., Nielsen S.C., Newby G.A., Randolph P.B. (2022) Engineered virus-like particles for efficient in vivo delivery of therapeutic proteins. Cell. 185(2), 250–265.e16. https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.12.021

  21. Kostyushev D., Kostyusheva A., Brezgin S., Smirnov V., Volchkova E., Lukashev A., Chulanov V. (2020) Gene editing by extracellular vesicles. Int. J. Mol. Sci. 21, 7362.

  22. Stone D., Long K.R., Loprieno M.A, De Silva Feelixge H.S., Kenkel E.J., Liley R.M., Rapp S., Roychoudhury P., Nguyen T., Stensland L., Colón-Thillet R., Klouser L.M., Weber N.D., Le C., Wagoner J., Goecker E.A., Li A.Z., Eichholz K., Corey L., Tyrrell D.L., Greninger A.L., Huang M.-L., Polyak S.J, Aubert M., Sagartz J.E., Jerome K.R. (2020) CRISPR/Cas9 gene editing of hepatitis B virus in chronically infected humanized mice. Mol. Ther. – Methods Clin. Dev. 20, 258–275. https://doi.org/10.1016/j.omtm.2020.11.014

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Молекулярная биология

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал