Молекулярная биология, 2022, T. 56, № 6, стр. 949-968

ВВЕДЕНИЕ

К трибе Пшеницевые (Triticeae Dumort.) относятся такие важнейшие для всего человечества злаковые культуры, как пшеница мягкая (Triticum aestivum L.), ячмень обыкновенный (Hordeum vulgare L.), рожь (Secale cereale L.), пшеница твердая (Triticim durum Desf.), тритикале (×Triticosecale Wittm. ex A.Camus) и некоторые другие виды. Пшеницу мягкую – основную сельскохозяйственную культуру, потребляют более 30% населения Земли [1]. Эта культура обеспечивает примерно 20% калорий суточного рациона человека [2]. Четвертой по значимости зерновой культурой после пшеницы мягкой, риса и кукурузы является ячмень [3]. К ключевым зерновым культурам в России и ряде других стран относятся также рожь, тритикале и пшеница твердая.

Многообразие экологических условий возделывания зерновых культур, в частности пшеницы, непредсказуемость погодных явлений, давление со стороны биотических стрессоров, антропогенных факторов и пестицидной нагрузки требуют большого разнообразия генофонда возделываемых сортов, в связи с чем актуальным становится ускорение темпов селекции. Так, в Национальном центре зерна имени П.П. Лукьяненко (Краснодар) за последние несколько лет (2014–2020) интенсивность создания сортов выросла почти в 10 раз в сравнении с периодом с 1913 по 1973 гг. [4]. Срок создания каждого сорта за это время также сократился, в том числе за счет отбора, контролируемого с помощью маркеров. Однако несмотря на развитие и разнообразие методов, применяемых в селекции, создание новых сортов происходит главным образом на основе комбинирования существующих в природе вариантов генов того же самого или близких видов растений [5]. Определенного прогресса в расширении аллельного разнообразия генов зерновых культур удалось добиться в результате внедрения методов химического и радиационного мутагенеза [6, 7]. Эффективным методом увеличения генетического разнообразия целого ряда культур стало применение генетической трансформации. Однако пшеница и родственные ей виды являются культурами, довольно сложными для генетической трансформации [8]. Основную проблему представляет то, что агробактерии Agrobacterium tumefaciens, широко используемые для генетической трансформации двудольных растений, в природе не инфицируют однодольные. Поэтому для трансформации однодольных в первое время использовали исключительно метод биобаллистики, менее эффективный, чем агробактериальная трансформация. Однако уже в 1997 году впервые разработали высокоэффективную методику агробактериальной трансформации мягкой пшеницы [9], после чего эти методы совершенствовались, а для ячменя стали уже классическими. Вторую проблему при генетической трансформации представителей трибы Пшеницевые представляет их очень низкая способность к регенерации в культуре in vitro. Эта проблема решена лишь отчасти, в основном путем постоянного поиска наиболее эффективно регенерирующих сортов и выбором подходящих эксплантов и состава питательной среды. В качестве эксплантов, пригодных для трансформации представителей трибы Пшеницевые, чаще всего выбирают незрелые зародыши [8], но даже при работе с ними возникают проблемы с уровнем регенерации. Среди сортов ячменя эффективным оказался Golden Promise, ставший хорошим модельным сортом для фундаментальных исследований. Однако использование модельных сортов (в случае ячменя основными объектами генно-инженерных исследований до сих пор остаются Golden Promise и Igri, несмотря на многократные попытки расширить круг используемых генотипов [10–12]), не снимает проблему практического применения методов генной инженерии, где в качестве объектов трансформации должны выступать разнообразные коммерческие сорта. Определенный выход из ситуации появился с открытием генов TFA (transformation amenability) ячменя. Предложено на ранних этапах селекции использовать Golden Promise в качестве донора генов TFA1, TFA2 и TFA3, проводить маркер-контролируемый отбор потомства от скрещиваний с коммерческими сортами, чтобы перспективный селекционный материал обладал свойством transformation amenability, как и модельные сорта [13]. Таким образом, не прекращается поиск способов повышения эффективности трансформации и регенерации представителей трибы Пшеницевые.

На сегодняшний день создано, в том числе с использованием нуклеаз ZFN [14] и TALEN [2], немалое число трансгенных и редактированных растений трибы Triticeae с хозяйственно-ценными признаками. Однако настоящей революцией стала разработка метода геномного редактирования CRISPR/Cas, где место действия редактирующей нуклеазы определяет короткая направляющая, или гидовая РНК (нРНК). Система CRISPR/Cas имеет ряд преимуществ перед методами ZFN/TALEN, включая больший ассортимент целевых сайтов, простоту создания генно-инженерных конструкций, возможность мультиплексного нокаута [15].

Системы CRISPR/Cas, состоящие из белка Cas и нРНК, вносят в мишени двухцепочечные разрывы (DSB), что приводит к индукции эндогенных механизмов репарации, которые могут зависеть от пути репарации и наличия или отсутствия донорной ДНК. Присутствие донорной ДНК, сходной с областью-мишенью, может способствовать направляемой гомологией репарации (HDR), тогда как отсутствие гомологичной донорной ДНК способствует репарации путем негомологичного соединения концов (NHEJ), которое подвержено ошибкам и приводит к случайным заменам нуклеотидов или же к коротким вставкам и делециям (инделям). нРНК можно подобрать практически к любому участку генома. При этом нужно учитывать, что для связывания нуклеазы критично присутствие мотива PAM с одной стороны выбранного участка редактирования (протоспейсера). Для SpCas9 последовательность PAM – это NGG с 5′-конца, для FnCas12a – TTN с 3′-конца, другие нуклеазы Cas также имеют свои особенности [16]. Cas9 обычно расщепляет ДНК на три нуклеотида выше PAM, тогда как Cas12b – в промежутке от 12 до 24 н. после PAM [5, 17].

Ввиду того, что с каждым годом появляется все больше экспериментальных работ, посвященных геномному редактированию злаковых культур, возникает необходимость в обобщении и осмыслении полученных данных, а также в сравнении эффективности используемого инструментария. Большая часть экспериментальных работ, проведенных на культурных видах семейства Злаковые, выполнена на растениях риса и кукурузы – сельскохозяйственных культурах, ключевых для стран Азии и Центральной Америки соответственно. Но для многих стран, включая Россию, наибольшее значение имеют злаковые культуры трибы Пшеницевые. Геномное редактирование растений этой группы, например, редактирование ячменя и мягкой пшеницы с помощью системы CRISPR/Cas рассмотрено в нескольких обзорах [18–20]. В нашем обзоре проанализированы данные об успехах геномного редактирования культурных растений трибы Triticeae и используемом для этого инструментарии.

ПОДБОР НАПРАВЛЯЮЩИХ РНК ДЛЯ ГЕНОМНОГО РЕДАКТИРОВАНИЯ

К важной составляющей технологии CRISPR/ Cas относится выбор мишеней – конкретных нуклеотидных последовательностей (протоспейсеров) – в намеченных для редактирования генах, сопряженный с дизайном нРНК с использованием специализированных компьютерных программ. Правила подбора нРНК и используемые для этого компьютерные программы опубликованы ранее [21, 22]. Для подбора нРНК с целью редактирования геномов Пшеницевых можно использовать большинство существующих программ. Однако имеются и специализированные программы, например, программа WheatCrispr ориентирована на дизайн нРНК исключительно для редактирования генома пшеницы мягкой. В этой программе для поиска протоспейсеров необходимо выбрать конкретный редактируемый ген из созданной усилиями International Wheat Genome Sequencing Consortium базы данных IWGSC RefSeq assembly (https://wheat-urgi.versailles.inra. fr/Seq-Repository/Assemblies) или самостоятельно ввести последовательность. Результаты ранжируются по общей эффективности редактирования с учетом возможных нецелевых сайтов. Учитывая, что пшеница мягкая имеет аллогексаплоидный геном, можно искать протоспейсеры в гомологичных последовательностях всех трех субгеномов: B, A и D, выбрав соответствующую опцию. Еще одна опция этой программы позволяет выбрать участок редактирования – кодирующие области или промоторы.

Многие компьютерные программы позволяют проводить поиск нецелевых участков, если геном организма депонирован в базу данных, например, геномы пшеницы мягкой и ячменя доступны в таких программах, как E-CRISP (http://www.e-crisp. org/E-CRISP/) [23], CRISPRdirect (http://crispr. dbcls.jp) [24], DESKGEN (https://www.deskgen.com/ landing/cloud) [25]. Однако на сегодняшний день наиболее предпочтительно использовать компьютерные программы по подбору нРНК, имеющие доступ к базе данных Ensembl. К примеру, программы Breaking Cas (http://bioinfogp.cnb. csic. es/tools/breakingcas/), CLD (https://github.com/ boutroslab/cld), Synthego CRISPR Design Tool (https://design.synthego.com/#/) работают совместно с базой Ensembl. Большинство новых программ по подбору нРНК имеют доступ к Ensembl.

В последнее время серьезное внимание при подборе нРНК стали уделять локализации редактируемых мест генома в эу- или гетерохроматиновых участках, так как от этого зависит эффективность процесса редактирования [22]. Особенно это актуально для полиплоидных видов трибы Пшеницевые. Так, web-ресурс CROP-IT (CRISPR/Cas9 Off-target Prediction and Identification Tool) [26] (http://www.adlilab.org/CROP-IT/cas9tool.html) рассчитан на дизайн нРНК и выявление потенциальных нецелевых сайтов редактирования с учетом состояния хроматина в этих местах.

Необходимо также учитывать наличие функционально заменяемых гомеологичных генов у представителей трибы Пшеницевые, имеющих полиплоидный геном, поэтому для полного нокаута следует подбирать нРНК, нацеленные на консервативные участки целевых генов [1]. С целью повышения эффективности геномного редактирования для нокаута одного гена могут быть отобраны до пяти разных нРНК [27].

КОНСТРУИРОВАНИЕ ВЕКТОРОВ ДЛЯ ГЕНОМНОГО РЕДАКТИРОВАНИЯ ВИДОВ ТРИБЫ ПШЕНИЦЕВЫЕ

Для трансформации клеток с целью получения трансгенных растений используют, как правило, векторы, содержащие область Т-ДНК, которая переносится в геном растений при агробактериальной трансформации. В пределах Т-области обычно располагаются минимум три последовательности с необходимыми регуляторными элементами, обеспечивающими их экспрессию: нРНК, ген Cas9 и ген селективного маркера, позволяющего произвести отбор трансформантов [5]. При бомбардировке золотыми (вольфрамовыми) частицами можно использовать молекулярные векторы без Т-границ.

Ассортимент инструментов, используемых в работах по геномному редактированию Пшеницевых, остается относительно небольшим. В геномном редактировании растений применяют ген Cas, оптимизированный по составу кодонов для однодольных или двудольных растений. Эффективность редактирования с помощью оптимизированного таким образом гена Cas выше, чем при использовании гена Cas, оптимизированного для человека [28–30].

В подавляющем большинстве случаев ген Cas9 находится под контролем промотора ZmUbi (ген убиквитина кукурузы) [2, 27, 31–33]. Крайне редко с этой целью используют другие промоторы, например промоторы TaUbi (ген убиквитина пшеницы) [34], OsUbi (ген убиквитина риса) [35] или 35S CaMV (вирус мозаики цветной капусты) [30]. Промотор 35S CAMV не получил распространения в геномном редактировании пшеницы, хотя довольно часто применяется в классической генной инженерии [36].

Большее разнообразие характерно для применяемых в геномном редактировании Пшеницевых промоторов, контролирующих экспрессию нРНК. Так, сравнивают промоторы U6 и U3 РНК-полимеразы (Pol) III, в том числе из разных видов растений [37, 38]. Среди промоторов TaU3 и TaU6 пшеницы, а также OsU3 и OsU6 риса наиболее эффективным оказался TaU3 [39]. Но наибольшую эффективность редактирования Пшеницевых, по всей видимости, обеспечивают промоторы Pol II. При использовании промотора вируса желтого скручивания листьев цеструма (CmYLCV) для полицистронной экспрессии нРНК, расщепляемых рибозимами, эффективность геномного редактирования пшеницы возросла более чем в 4 раза [40]. Промотор гена актина риса успешно применили для полицистронной экспрессии нРНК, расщепляемых РНКазами (система tRNA-gRNA), благодаря чему удалось создать единую мультиплексную конструкцию для 15 мишеней, причем эффективность редактирования достигала 75% [41].

В случае геномного редактирования H. vulgare нРНК экспрессировали с использованием промоторов TaU6 пшеницы [42, 43], OsU6 риса [27], а также HvU3 ячменя [44, 45]. При этом ген Cas9 во всех этих исследованиях находился под контролем промотора ZmUbi кукурузы.

В качестве селективного гена используют либо bar (ген устойчивости к фосфинотрицину/глюфосинату) [2, 46], либо hptII (ген устойчивости к гигромицину) [27, 47, 48]. Другие селективные гены при геномном редактировании Пшеницевых не применяли. В ряде случаев применяют селективные гены, которые дополняют репортерными генами, кодирующими флуоресцентные белки, такие как GFP [49] и DsRed [47].

Таким образом, можно констатировать, что в геномном редактировании Пшеницевых используется весьма скромный набор промоторов, особенно в случае гена Cas. Более того, в классической генной инженерии известно не так много растительных конститутивных промоторов, которые могли бы эффективно работать у Пшеницевых [50]. К наиболее хорошо изученным относятся промоторы генов актина (Actl) и алкогольдегидрогеназы (Adh1) [51]. Для трансформации пшеницы предлагались также промоторы палочковидного баднавируса сахарного тростника ScBV [52], вируса карликовости пшеницы (WDV) и LIR-промотор WDV [31], но они не получили широкого распространения.

Сравнительно небольшой набор инструментов, применяемых в геномном редактировании пшеницы, можно объяснить использованием традиционных “пустых” векторов и векторных систем с ограниченным набором промоторов [16, 53–70]. Поэтому актуальными остаются исследования, направленные на увеличение ассортимента доступных средств геномного редактирования Пшеницевых.

СПОСОБЫ ДОСТАВКИ КОМПОНЕНТОВ CRISPR/Cas И МЕТОДЫ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ

Процесс получения трансгенных однодольных растений достаточно длительный и трудоемкий, поэтому при планировании эксперимента по редактированию генома имеет смысл сначала протестировать редактирующую систему на популяции клеток (например, на протопластах или каллусах) при помощи транзиентной экспрессии [5]. Это позволяет быстро оценить эффективность разных вариантов генетических конструкций и выбрать наиболее подходящие для продолжения эксперимента и получения трансгенных растений. Именно поэтому во многих исследованиях эффективность генно-инженерных конструкций проверяют на протопластах [38]. Более того, результаты многих работ по геномному редактированию представителей трибы Пшеницевые публикуются на стадии проверки эффективности конструкций в протопластах [32, 49, 58].

При получении стабильных трансформантов или “нокаутных” растений без трансгенов в качестве эксплантов для генетической трансформации Пшеницевых чаще всего используют незрелые зародыши (табл. 1). Компоненты CRISPR/Cas в геном мягкой пшеницы часто доставляют с помощью бомбардировки золотыми частицами [1, 56]. Однако достаточно часто применяют и агробактериальную трансформацию [38, 48, 63]. Более того, подавляющее большинство экспериментов по геномному редактированию ячменя связано с использованием агробактерий [35, 45, 69]. Не прекращаются работы по повышению эффективности методов генетической трансформации и регенеративной способности эксплантов Пшеницевых. Например, разработана надежная и воспроизводимая система трансформации, опосредованной Agrobacterium tumefaciens, которая позволила добиться 33%-ной эффективности трансформации пшеницы мягкой. В качестве исходного материала использовали незрелые зародыши, которые центрифугировали перед агробактериальной инокуляцией [71].

Широкое распространение получили также способы доставки компонентов CRISPR/Cas в клетки растений с использованием вирусов растений, позволяющих существенно увеличить наработку нРНК и Cas-нуклеазы, а при необходимости и донорной ДНК, и повысить эффективность редактирования [72, 73]. Gil-Humanes и соавт. [31] разработали на основе репликонов систему генетического редактирования зерновых культур с использованием WDV. Использованный в этой работе вектор pWDV2, содержащий как ген Cas9, так и нРНК, оказался в 12 раз эффективнее других векторов. Обычно компоненты CRISPR/Cas при использовании вирусных векторов в геном не встраиваются.

Чтобы избежать интеграции чужеродной ДНК в процессе редактирования генома, разработан также подход, в котором используется готовый РНП-комплекс из соответствующей Cas-нуклеазы и нРНК, сорбированных на золотых частицах, доставку которых осуществляли с помощью биобаллистики [72]. На примере пшеницы мягкой показано, что использование РНП снижает вероятность нецелевых мутаций, которые могут возникать при интеграции компонентов CRISPR/Cas в геном. Поскольку при редактировании генома, опосредованном РНП, чужеродная ДНК не используется, полученные мутанты не содержат трансгенов [74]. Разработан также подробный протокол геномного редактирования пшеницы мягкой с помощью биобаллистической рибонуклеопротеидной трансформации [75].

Одной из самых трудноразрешимых проблем при генетической трансформации Пшеницевых остается низкий уровень регенерации и невозможность геномного редактирования многих элитных сортов. Одним из подходов, направленных на решение этой проблемы, можно назвать бомбардировку золотыми частицами апикальных меристем побега in planta (метод iPB). Сообщалось о применении метода iPB к коммерчески значимым японским элитным сортам пшеницы; при этом проводили бомбардировку набухших зрелых семян с обнаженной апикальной меристемой побега [67]. В дальнейшем анализировали мутации в гене-мишени в ткани флагового листа. В результате мутантные аллели выявили в тканях 2.51% растений, подвергшихся бомбардировке, однако все мутантные растения были химерными, и в поколении T₂ обнаружен лишь один тройной рецессивный гомозиготный мутант.

На решение проблем, связанных с низким уровнем регенеративной способности Пшеницевых, направлены также подходы к использованию гаплоиндукторов в геномном редактировании. Разработаны методы индукции гаплоидов Arabidopsis thaliana in planta путем элиминации генома одного родителя путем модификации гена CENTROMERIC HISTONE 3 (CENH3) [76] кукурузы и риса путем нокаута гена спермоспецифичной фосфолипазы [77, 78], а также пшеницы – посредством межродового скрещивания с кукурузой [79]. Ранее сообщалось о гаплоиндукции в сочетании с сайт-направленным мутагенезом у A. thaliana, кукурузы и пшеницы [80]. Накопленный опыт позволил развивать методы геномного редактирования Пшеницевых с использованием гаплоиндукторов. К примеру, в геном кукурузы внедрили последовательности Cas9 и нРНК, подобранные для нокаута всех гомеологов генов TaBRI1 и TaSD1 у мягкой и твердой пшеницы [81]. Эмбрионы, полученные в результате межродовых скрещиваний трансгенной кукурузы и мягкой пшеницы, регенерировали в условиях in vitro с образованием “нокаутных” растений пшеницы.

В целом, одним из популярных направлений геномного редактирования Пшеницевых является получение мутантных растений, не содержащих трансгенов. В результате обеспечивается более низкий уровень редактирования нецелевых участков, а растения, не содержащие трансгенов, могут быстрее получить разрешение на коммерческое возделывание [72, 73]. Одними из первых этот подход реализовали Zhang и соавт. [46], в работе которых компоненты CRISPR/Cas транзиентно экспрессировались в ткани каллуса, а побеги-регенеранты уже не содержали трансгенов. Трансгены обычно не интегрируются в геном растения и при использовании вирусных векторов [31]. Однако, несмотря на очевидные преимущества получения нетрансгенных растений, при этом возможны сложности с селективным отбором.

Отдельно необходимо отметить, что эффективность (полнота) геномного редактирования и его специфичность (воздействие преимущественно или исключительно на целевые сайты) фактически противостоят друг другу. Так, эффективность редактирования намеченных участков генома будет тем выше, чем дольше в клетке работают Cas-нуклеаза и нРНК, но при этом возрастает вероятность нецелевого редактирования [22].

ГЕНОМНОЕ РЕДАКТИРОВАНИЕ КУЛЬТУР ПЫЛЬНИКОВ И МИКРОСПОР ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ ТРИБЫ ПШЕНИЦЕВЫЕ

Микроспоры, или незрелые пыльцевые зерна, представляют собой гаплоидные клетки, обладающие способностью регенерировать in vitro в целые растения. Тотипотентность микроспор обычно используется для создания дигаплоидных растений в рамках ускоренной селекции сельскохозяйственных культур. Гаплоидная стратегия на основе микроспор также вдвое снижает количество редактируемых аллелей. Например, у гексаплоидной пшеницы количество редактируемых аллелей уменьшается с шести до трех. Таким образом, относительная простота выделения и возможность быстрого получения гомозиготных диплоидных трансгенных растений за одну стадию делают одноклеточные микроспоры привлекательной мишенью для редактирования генома, особенно у устойчивых к трансформации видов, к которым относятся все виды Пшеницевых. Исходя из этих соображений, Bhowmik и соавт. [47] исследовали ряд факторов, которые могут повлиять на доставку компонентов CRISPR/Cas9 в микроспоры, и обнаружили, что электропорация не менее 75 000 клеток с использованием 10–20 мкг ДНК и импульсного напряжения 500 В оптимальна для трансфекции микроспор мягкой пшеницы. С использованием нескольких конструкций Cas9 и нРНК удалось внести целевые модификации и выполнить нокаут генов TaLox2 и TaUbiL1, кодирующих липоксигеназу и убиквитин [47].

Еще одна работа по геномному редактированию культуры пыльников проведена на растениях ячменя. В каллусах нескольких сортов ячменя, полученных из микроспор, методом агробактериальной трансформации удалось отредактировать ген фитоендесатуразы (HvPDS) [82]. Этот протокол оказался более эффективным, чем агробактериальная трансформация незрелых зародышей. Предложен также подробный протокол геномного редактирования культуры клеток пыльников ячменя, который позволяет с помощью метода удвоения гаплоидов сразу создавать линии, гомозиготные по отредактированному аллелю [83].

МОЛЕКУЛЯРНЫЙ АНАЛИЗ РАСТЕНИЙ ПОСЛЕ ГЕНОМНОГО РЕДАКТИРОВАНИЯ

Существуют три основных метода выявления мутаций, индуцированных CRISPR/Cas: ПЦР/рестрикционный анализ (PCR/Re, CAPS), анализ с помощью нуклеазы T7EI или ее аналогов, а также клонирование ампликонов с последующим секвенированием. Эти методы широко используются при геномном редактировании Пшеницевых. Обязательным условием первого метода является то, что локус-мишень должен включать сайт соответствующей рестриктазы, который нарушается мутациями, индуцированными CRISPR/Cas. В этом случае ампликоны с мутациями окажутся устойчивыми к расщеплению ферментами рестрикции и на электрофореграмме будут визуализироваться нерасщепленные ампликоны. Для этого проводят ПЦР-анализ целевых генов в предполагаемых трансформантах, после чего ампликоны расщепляют ферментом рестрикции, который распознает последовательности-мишени дикого типа [15]. Мутантные аллели можно дополнительно анализировать путем клонирования в вектор и секвенирования нерасщепленных ампликонов [39]. ПЦР/рестрикционный анализ нельзя применять к локусу-мишени, в котором нет подходящих сайтов эндонуклеаз рестрикции. В качестве альтернативы можно использовать ферменты, расщепляющие неправильно спаренные участки ДНК. В геномном редактировании Пшеницевых широко используются нуклеазы T7EI [65] и Cel I (SURVEYOR) [46]. Продукты ПЦР (смесь аллеля дикого типа и мутантного аллеля) сначала подвергают денатурации, а затем ренатурации для образования гетеродуплексов. Продукты реакции обрабатывают нуклеазами T7EI или Cel I, а затем визуализируют при помощи электрофореза в 2%-ном агарозном геле. Гетеродуплексы расщепляются T7EI/Cel I, тогда как гомодуплексы дикого типа и мутантные гомодуплексы остаются интактными [58]. Небольшие точечные мутации можно обнаружить с помощью ПЦР/рестрикционного анализа и подтвердить секвенированием. Поскольку сайты рестрикции часто нарушаются при мутациях, индуцированных при NHEJ и HDR, мутантные последовательности оказываются устойчивыми к расщеплению и предпочтительно амплифицируются в последующем цикле ПЦР. После этого редактированный генотип можно подтвердить клонированием и секвенированием [15]. Можно использовать и полногеномное секвенирование отредактированных растений [48, 54], при котором выявляются также нецелевые участки геномного редактирования.

ГЕНОМНОЕ РЕДАКТИРОВАНИЕ CRISPR/Cas ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯ ОТДЕЛЬНЫХ ХОЗЯЙСТВЕННО ЦЕННЫХ ПРИЗНАКОВ У ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ ТРИБЫ ПШЕНИЦЕВЫЕ

Основные успехи были достигнуты при улучшении моно- или олигогенно контролируемых признаков, когда положительному проявлению признака препятствует ген – негативный регулятор. В этих случаях проблема решается нокаутом гена.

Одной из важнейших проблем при возделывании мягкой пшеницы является чувствительность этой культуры к мучнистой росе, вызываемой фитопатогенным грибом. Распространение мучнистой росы на посевах приводит к существенному снижению урожая. В пионерской работе по геномному редактированию мягкой пшеницы сделана попытка создания сортов, устойчивых к мучнистой росе, путем нокаута гена TaMLO, однако это привело к снижению урожайности у редактированных растений [2]. Позднее проблему негативного плейотропного эффекта нокаута этого гена удалось решить с помощью небольшой делеции в локусе MLO-B1 [84]. Устойчивость пшеницы к мучнистой росе удалось повысить также путем внесения мутаций в ген EDR1 [57]. Еще одно не менее опасное заболевание представителей трибы Пшеницевые – фузариоз, вызывается грибом Fusarium graminearum. Brauer и соавт. [34] идентифицировали ген TaNFXL1, кодирующий фактор транскрипции, индуцируемый микотоксином дезоксиниваленолом. С помощью CRISPR/Cas доказано, что продукт гена TaNFXL1 подавляет устойчивость растений пшеницы к F. graminearum. Таким образом, нокаут гена TaNFXL1 может повышать устойчивость мягкой пшеницы к фузариозу (табл. 1). Белки семейства Microrchidia (MORC) играют важную роль в эпигенетическом сайленсинге генов и стабилизации генома в клетках растений и животных, а также действуют как медиаторы передачи сигналов защиты, запускаемой R-белками различных классов. Методом CRISPR/Cas получены двойные мутанты ячменя hvmorc1/hvmorc6a c высоким уровнем устойчивости к биотрофным (Blumeria graminis) и некротрофным (F. graminearum) фитопатогенным грибам [45].

Одну из серьезных проблем при возделывании Пшеницевых представляют многочисленные вирусные инфекции. С помощью технологии CRISPR/Cas можно воздействовать на гены самого растения, продукты которых важны для развития вирусной инфекции. К примеру, гены Ta-eIF4E и Ta-eIF(iso)4E, кодирующие высококонсервативные факторы инициации трансляции, одновременно служат факторами восприимчивости (S), необходимыми вирусам семейства Potyviridae для завершения жизненного цикла. Предполагается, что линии мягкой пшеницы с нокаутом генов Ta-eIF4E и Ta-eIF(iso)4E будут устойчивы к вирусу веретенообразной мозаики пшеницы (WSSMV) и вирусу желтой мозаики пшеницы (WYMV) [67]. Другой подход применили для борьбы против вируса WDV. Растения, постоянно экспрессирующие белок Cas и нРНК против WDV, характеризовались повышенной устойчивостью к данному вирусу [85].

Еще одну проблему при культивировании Пшеницевых представляют такие вредители, как тля. Растения защищаются от тли, закупоривая поврежденные ситовидные трубки отложениями каллозы. Однако эти вредители приобрели способность индуцировать растительные гены, кодирующие β-1,3-глюканазу, которая разлагает каллозу, что позволяет тле преодолевать защитные системы растения-хозяина. Чтобы повредить этот механизм, методом CRISPR/Cas получили нокаут двух генов β-1,3-глюканазы (1636 и 1639) в геноме ячменя [86]. В трех из четырех двойных мутантных линий выявили значительное снижение активности β-1,3-глюканазы, причем листья двойных мутантов содержали гораздо больше каллозы, чем листья контрольных растений или одинарных мутантов. Однако при этом у мутантных растений не повышалась устойчивость к тле Rhopalosiphum padi L., что могло быть связано с более высоким уровнем экспрессии третьего гена β-1,3-глюканазы – 1637, который тоже активируется под влиянием патогена.

Дефицит влаги, вызванный засухой и гипотермией, остается наиболее значимым абиотическим стрессовым фактором при выращивании всех сельскохозяйственных культур. Для повышения стрессоустойчивости пшеницы использовали нокаут генов TaDREB2 и TaERF3, кодирующих факторы транскрипции, которые регулируют чувствительность к обезвоживанию [58]. Эти эксперименты проведены только на протопластах, однако предполагается, что полноценные растения будут отличаться повышенной устойчивостью к дефициту влаги.

Одной из важных причин снижения урожайности Пшеницевых остается так называемое прорастание на корню (прорастание зерновок в колосе). Методом CRISPR/Cas Abe и соавт. [48] внесли мутации в три гомеолога гена Qsd1, участвующих в контроле покоя семян. Путем дальнейших скрещиваний удалось получить редактированные растения, семена которых, как полагают, будут иметь более продолжительный период покоя и будут менее подвержены прорастанию на корню. Нокаут гена Qsd1 использовали также в работе, направленной на отработку технологии геномного редактирования путем генетической трансформации апикальной меристемы побега in planta [68]. Проблема прорастания на корню особенно актуальна для тритикале. Однако, учитывая сложность генома, слабую изученность и очень низкие способности тритикале к регенерации, геномное редактирование этой культуры требует больших затрат и времени, его проводят лишь в нескольких лабораториях мира [87]. Одной из вероятных генетических детерминант прорастания на корню считается ген ABA 8'-HYDROXYLASE 1. Michalski и соавт. [49] создали конструкции для нокаута этого гена методом CRISPR/Cas и испытали их путем трансфекции в протопласты тритикале. Далее с помощью анализа T7E1 и секвенирования доказали возникновение мутаций в целевом гене. Это единственная на сегодняшний день работа по геномному редактированию тритикале, однако следует отметить, что полноценные растения получены не были [49].

Со времен первой зеленой революции одним из хозяйственно ценных признаков Пшеницевых остается короткостебельность. Поэтому не удивительно, что этот фенотипический признак становится целью геномного редактирования. Например, с использованием гаплоиндукторов получены растения мягкой и твердой пшеницы с нокаутом генов BRASSINOSTEROID-INSENSITIVE 1 (BRI1) и SEMI-DWARF 1 (SD1) [81]. Предполагается, что редактированные растения будут иметь более короткий стебель и увеличенную урожайность.

Важным направлением селекции культурных растений трибы Пшеницевые остается повышение эффективности азотного питания. Недавно Zhang и соавт. [65] идентифицировали и охарактеризовали три гомеолога гена TaARE1. Методом CRISPR/Cas они создали мутантные линии пшеницы с тройными нулевыми аллелями taare. Все мутантные линии имели повышенную устойчивость к азотному голоданию, замедленное старение и повышенную урожайность в полевых условиях. Похожие работы проведены также на ячмене. У мутантных линий ячменя hvare1 наблюдалось увеличение высоты растений, числа побегов, содержания белка в зерне и урожайности. Кроме того, мутанты ячменя hvare1 отличались повышенным содержанием хлорофилла, отсроченным старением, а также имели высокое содержание азота в побегах в условиях низкого содержания азота в почве [88].

К важнейшим характеристикам урожайности культурных растений трибы Пшеницевые относятся масса и размеры семян. Показано увеличение ширины и массы зерновок в растениях с нокаутом гомеологов гена TaGW7 в геномах B и D, при этом наблюдалось уменьшение длины зерновок. Причем наиболее значительные эффекты получены при внесении изменений в оба гомеолога [60]. Нокаут гомологичного гена TaGW2 во всех субгеномах мягкой пшеницы также способствовал увеличению признака “масса тысячи зерен” [32].

Некоторые работы по редактированию с помощью системы CRISPR/Cas направлены на улучшение качества зерна. Например, Li и соавт. [1] получили линии яровой и озимой пшеницы мягкой с высоким содержанием амилозы за счет внесения мутаций в ген TaSBEIIa, кодирующий ветвящий фермент крахмала. Блокирование экспрессии этого гена привело к снижению содержания амилопектина в крахмале и увеличению содержания амилозы. Raffan и соавт. [66] удалось внести мутационные изменения во все шесть аллелей гена TaASN2, кодирующего аспарагинсинтетазу, что привело к существенному снижению содержания свободного аспарагина в зерне пшеницы мягкой. Свободный аспарагин является предшественником акриламида, который образуется во время высокотемпературной обработки продуктов, приготовленных из пшеницы, поэтому предполагается возможность снижения канцерогенности продуктов из растений с редактированным геномом.

Инозитолтрифосфат-киназы 5/6 (ITPK) составляют небольшую группу ферментов, участвующих в последовательном фосфорилировании инозитолфосфата в инозитолгексафосфат (IP6), который является основной формой хранения фосфата в зерне злаков. Создание линий Пшеницевых с пониженным содержанием IP6 может повысить биодоступность фосфатов в пище и кормах. С целью выяснения роли гена HvITPK1 в биосинтезе IP6 созданы мутантные растения ячменя [89] с измененными уровнями фосфатов в зрелых зернах – от 65 до 174% относительно содержания в зерновках дикого типа. К тому же мутанты с инсерциями были более солеустойчивыми, чем растения дикого типа и делеционные мутанты. Результаты этого исследования доказывают участие генов ITPK не только в накоплении фосфатов, но и в передаче сигналов абиотического стресса.

Более 7% населения западных стран страдает повышенной чувствительностью к глютену, а наибольшей иммунореактивностью обладает 33-мерный пептид α-глиадина [56]. С целью создания растений мягкой и твердой пшеницы с пониженной иммунореактивностью сконструированы две нРНК для нацеливания на консервативную область, примыкающую к последовательности гена α-глиадина, кодирующей 33-мер. Мутантные линии характеризовались снижением содержания α-глиадинов и иммунореактивности [56]. С пшеницей связаны и такие заболевания человека, как астма пекарей и нецелиакийная чувствительность к пшенице (NCWS). Предполагается, что патогенез этих болезней связан с ингибиторами α-амилазы и трипсина (ATI), кодируемыми субъединицами WTAI-CM3 и WTAI-CM16. С целью получения линий твердой пшеницы с уменьшенным количеством потенциальных аллергенов проведено редактирование этих двух субъединиц в зерне итальянского сорта Svevo с использованием стратегии мультиплексного CRISPR/Cas9 [64]. В итоге редактирование двух целевых генов подтверждено как на молекулярном (секвенирование и исследование экспрессии генов), так и на биохимическом (иммунологический тест) уровнях.

Для пивоварения предпочтительно использовать ячмень с низким содержанием (1,3;1,4)-β-глюкана. Так как гены (1,3;1,4)-β-глюкансинтаз ячменя изучены недостаточно, методом CRISPR/Cas выполнен нокаут четырех генов (HvCslH1, HvCslF3, HvCslF6 и HvCslF9), предположительно кодирующих ферменты семейства гликозилтрансфераз GT2 [90]. Мутации в генах HvCslH1, HvCslF3 и HvCslF9 не влияли на содержание (1,3;1,4)-β-глюкана в зерне, тогда как нокаут гена HvCslF6 приводил к существенному уменьшению содержания этого вещества.

Гордеины – запасные белки ячменя, одна из фракций которых, называемая D-гордеинами, ассоциирована с низким качеством солодового экстракта. При этом механизм отрицательного влияния D-гордеина на качество солода не установлен. С целью функционального анализа гена D-гордеина проведен его нокаут и получены три гетерозиготных мутантных растения [91]. Гомозиготные мутанты второго поколения имели более мелкие зерновки, содержание проламинов в них было снижено, а глютенинов увеличено.

Голозерность ячменя связывают с делецией гена NUD, кодирующего транскрипционный фактор AP2/ERF, контролирующий образование цементирующего слоя между околоплодником, нижней и верхней цветковой чешуями. Правильность этих данных подтверждает конверсия фенотипа ячменя из пленчатого в голозерный при направленном нокауте гена NUD с использованием РНК-управляемой эндонуклеазы Cas9 [92]. Отмечается, что из-за высокого содержания β‑глюкана голозерный ячмень может считаться диетическим продуктом.

В ряде работ проведено одновременное мультиплексное геномное редактирование нескольких генов. Множественные спейсеры в одной нРНК получали, используя классическую мультиплексную систему, где каждая нРНК находится под контролем собственного промотора U3 или U6 (система TRSP), а также ряд систем процессинга тРНК [53], рибозимов [93] и Csy4 [54], экспрессирующихся полицистронно. Для проверки эффективности этих систем Li и соавт. [1] проводили одновременное геномное редактирование генов TaDA1, TaPDS и TaNCED1 с использованием первых трех подходов. В итоге системы процессинга тРНК и рибозимов оказались более эффективными и надежными, чем система TRSP. Luo и соавт. [41] разработали эффективную стратегию мультиплексного редактирования генома пшеницы мягкой с использованием промотора Pol II риса для управления экспрессией тандемных повторов единиц тРНК-нРНК, добавив полиA-сигнал и nos-терминатор для повышения уровня экспрессии транскриптов, что увеличивало частоту редактирования множественных генов в нескольких локусах пшеницы. Показана возможность одновременного редактирования 2, 3, 4 и 5 генов в 15 геномных локусах в одном поколении. Одновременно проведено редактирование генов Pinb, Waxy и DA1, мутации в которых могут способствовать повышению твердозерности, увеличению содержания амилопектина и увеличению показателя “масса тысячи зерен” соответственно [38]. Wang и соавт. [33] применили мультиплексную конструкцию, созданную путем объединения тандемно расположенных единиц тРНК-нРНК, для создания наследуемых мутаций в генах TaGW2, TaLpx-1 и TaMLO гексаплоидной пшеницы. Образовавшиеся во всех трех гомеологичных копиях гена TaGW2 мутации привели к значительному увеличению размера зерновок и показателя “масса тысячи зерен”.

Системы мультиплексного геномного редактирования также были апробированы на ячмене. Cконструировали две разные нРНК для обычного редактирования и одну полицистронную конструкцию тРНК-нРНК для мультиплексного редактирования с использованием эндогенной системы процессинга тРНК для нокаута генов цитокининоксидазы/дегидрогеназы: одного – HvCKX1, и двух – HvCKX1 и HvCKX3 соответственно [94]. Сообщается также, что высокая частота индуцированных мутаций была достигнута за счет использования оптимизированного синтетического гена Cas9 и усиленного интроном UBQ10-i1 из A. thaliana в сочетании с эффективным методом агробактериальной трансформации. В дальнейшем Gasparis и соавт. [95] продолжили исследование растений ячменя с нокаутом и выявили значительное снижение активности фермента CKX в колосьях линий ckx1, в то время как у линий ckx3 активность оставалась на том же уровне, что и в контрольных растениях. Несмотря на эти различия, урожайность мутантных линий не изменилась. В свою очередь, различия в активности CKX в корнях мутантов ckx1 и ckx3 отражались на морфологии корней. Снижение активности CKX в линии ckx1 приводило к увеличению длины корней, площади поверхности и количества корневых волосков и к противоположным результатам у мутантов ckx3.

Очень удобным инструментом, используемым в селекционных работах, являются системы индукции мужской стерильности. С целью индукции мужской стерильности отредактировали все три гомеолога гена TaNP1, кодирующего предполагаемую глюкозометанол-холиноксидоредуктазу, необходимую для поддержания мужской фертильности (табл. 1). Тройные гомозиготные мутации в генах TaNP1 приводили к полной мужской стерильности [39]. Редактированные линии пшениц с мужской стерильностью предлагают использовать в селекции пшеницы. В другом исследовании путем направленного мутагенеза с использованием системы CRISPR/Cas мутации внесли во все три гомеолога гена Ms45 (ген мужской стерильности) и получили стерильные растения пшеницы мягкой [96]. Однако после получения гибридных линий возникает необходимость восстановления мужской фертильности, что можно сделать путем нокаута генов мужской стерильности. К примеру, Tang и соавт. [63] внесли мутации в ген Ms2, контролирующий цитоплазматическую мужскую стерильность, что привело к восстановлению фертильности у отредактированных растений. В табл. 1 представлена информация о целевых генах, методах доставки компонентов CRISPR/Cas и фенотипических проявлениях нокаута этих генов в растениях мягкой и твердой пшеницы, ячменя и тритикале. Результаты геномного редактирования других представителей трибы Пшеницевые пока не опубликованы.

МЕТОД CRISPR/Cas В ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЯХ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ ТРИБЫ ПШЕНИЦЕВЫЕ

Пшеница мягкая имеет большой (17 Гб) и сложный полиплоидный геном с высокой долей повторяющихся последовательностей (>80%). Эти особенности создают проблемы для генетического и функционального анализа генома пшеницы [2, 38]. Однако с появлением системы CRISPR/Cas гораздо быстрее начали развиваться фундаментальные исследования пшеницы мягкой и других Пшеницевых методами обратной генетики. На сегодняшний день опубликовано уже более 10 работ, в которых представлены результаты изучения Пшеницевых с использованием мутантов с нокаутом определенных генов, полученных методом CRISPR/Cas. К примеру, Wang и соавт. [100] получили мутанты пшеницы по гену TaPHT1;9-4B, которые при достаточном количестве фосфатов в почве содержат меньше фосфатов в корнях и побегах, чем растения дикого типа. В то же время при дефиците фосфора эти мутанты накапливали фосфаты в корнях, но не в побегах. Таким образом доказано, что продукт гена TaPHT1;9-4B участвует в переносе фосфатов от корней к побегу. Путем нокаута гена гистон-ацетилтрансферазы TaHAG1 методом CRISPR/Cas доказана его важная роль в регуляции солеустойчивости посредством ацетилирования гистонов Н3 различных генов, участвующих в модуляции выработки активных форм кислорода [97].

Для изучения роли гена TaMBF1 в регуляции и обеспечении жароустойчивости методом CRISPR/Cas созданы растения с нокаутом всех трех гомеологичных генов [98]. Мутантные растения, в отличие от растений дикого типа, характеризовались пониженной устойчивостью к действию высоких температур – в условиях теплового стресса они имели более короткий стебель и меньшую сырую массу. Однако нокаут только одного гомеолога TaMBF1 не привел к существенному изменению жароустойчивости, что свидетельствует о функциональной избыточности гомеологов этого гена в ответе на тепловой стресс. Ген TaBAK1-2 мягкой пшеницы является гомологом гена BAK1 A. thaliana, кодирующего BRI1-ассоциированную рецепторную киназу 1, важный регулятор иммунитета и развития растений. Для выяснения функций гена TaBAK1-2 использовали нокаут всех трех его гомеологов; эта мутация успешно наследовалась в последующих поколениях [67].

Продукт гена FLOWERING LOCUS T (FT) способен перемещаться из флоэмы листа в апикальную меристему побега, где инициирует переход к цветению. Предполагается, что данный ген также может участвовать в регуляции числа колосков у Пшеницевых. Путем редактирования гена FT-D1 с использованием системы CRISPR/Cas доказано участие этого гена в определении числа колосков и времени колошения [99].

Угол роста корней определяет их направление к вектору силы тяжести и является одним из наиболее важных факторов, устанавливающих архитектонику корневой системы. Путем нокаута гомеологов гена EGT2 в субгеномах A и B твердой пшеницы показана эволюционно консервативная роль этого гена в контроле угла роста корней [3]. Применение микродиссекции с лазерным захватом и секвенирования РНК позволило обнаружить, что в растениях с нокаутом этого гена подавлена экспрессия семи генов экспансинов в зоне растяжения. Эти данные свидетельствуют о том, что EGT2 кодирует регулятор угла роста корней, который может быть ценной мишенью для улучшения роста корней у Пшеницевых.

Среди культурных видов трибы Пшеницевые наиболее удобным для проведения фундаментальных исследований оказался ячмень, имеющий диплоидный геном. На модельных сортах этого вида хорошо отработана методика генетической трансформации. Чтобы изучить механизм модификации и удаления N-гликанов из белков, Kapusi и соавт. [27] выбрали в качестве мишени для редактирования генома предполагаемый эндогенный ген эндо-N-ацетил-β-D-глюкозаминидазы (ENGase) ячменя. В зерновках ячменя при прорастании активируется ENGase, которая способствует удалению N-гликанов из молекул белка, что приводит к мобилизации запасных гликопротеинов. Редактированные растения ячменя с биаллельными или гомозиготными мутациями в предполагаемом гене ENGase не имели фенотипических отличий от растений дикого типа. Планируется провести биохимический анализ полученных растений, чтобы выявить возможные изменения в составе N-гликанов эндогенных и рекомбинантных белков, а также воздействие этих мутаций на физиологию эндосперма. Другой пример – особенности биосинтеза витамина Е у однодольных растений. С целью изучения биосинтеза этого витамина созданы мутантные растения ячменя с нокаутом генов HvHPT и HvHGGT, кодирующих ферменты, вовлеченные в биосинтез витамина Е [35]. С использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) показано, что целенаправленная мутация гена HvHPT значительно снижает содержание как токоферолов, так и токотриенолов, тогда как мутация гена HvHGGT полностью блокирует биосинтез токотриенолов в зернах ячменя. Это означает, что продукт гена HvHGGT является ключевым ферментом биосинтеза токотриенолов.

Гены MPK, роль которых в развитии растений хорошо изучена у A. thaliana и риса, кодируют митоген-активируемые протеинкиназы. При этом функции ортологов гена МРК6 у Пшеницевых оставались неизученными. Krenek и соавт. [69] методом CRISPR/Cas создали растения ячменя с нокаутом гена HvMPK6, однако фенотипически они не отличались от растений дикого типа. Показано, что все эти мутанты гетерозиготные, а второй аллель всегда содержит нативный ген HvMPK6. Полученные результаты говорят о летальности биаллельных мутантов. В дальнейшем удалось получить семена этих мутантов, однако проростки оказались аномальными, без побегов и с редуцированной корневой системой. Исходя из полученных результатов, а также результатов изучения ортологов гена MPK6 в A. thaliana и риса, сделан вывод о важной роли HvMPK6 в эмбриональном и раннем развитии проростков ячменя.

Геномное редактирование CRISPR/Cas может оказаться весьма полезным при функциональном анализе промоторов различных генов растений. К примеру, с помощью этого подхода анализировали промотор гена фитазы ячменя HvPAPhy_a. Белковый продукт этого гена, как предполагалось, является основной фитазой, присутствующей в зрелых зерновках ячменя и определяющей их фитазную активность (MGPA) [43]. Результаты этой работы подтвердили, что фермент PAPhy_a ячменя вносит основной вклад в MGPA. Кроме того, анализ промоторной области гена HvPAPhy_a, содержащей мотив GCN4/Skn1/RY, показал его важность для экспрессии HvPAPhy_a, поскольку MGPA в зерновках линий растений с мутациями в этом мотиве значительно снижена. Интересно, что в линиях ячменя с делециями нуклеотидов в промоторе, расположенными ниже этого мотива, уровни MGPA еще более снижены, указывая на то, что мотив GCN4/SKn1/RY не является единственным элементом промотора, ответственным за уровень экспрессии PAPhy_a во время созревания зерна.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Применение системы CRISPR/Cas9 имеет широкие перспективы как в фундаментальных исследованиях, так и для решения прикладных задач. Одна из таких перспектив – возможность значительного ускорения многих исследований, связанных с выяснением функций генов и генетического контроля признаков. С помощью метода CRISPR/Cas получено большое количество растений пшеницы мягкой и ячменя, в том числе, с улучшенными хозяйственно ценными признаками. Опубликованы результаты геномного редактирования пшеницы твердой и тритикале [46, 49, 56, 64, 81]. Однако целый ряд культурных растений трибы Пшеницевые, таких как рожь, пшеницы-однозернянки и пшеницы-двузернянки, остаются неисследованными в контексте геномного редактирования, Тем не менее, недавние успехи в генной инженерии и генетической трансформации этих видов [101–103] позволяют надеяться на скорое вовлечение новых представителей трибы Пшеницевые в исследования, предполагающие изменение генома с помощью систем CRISPR/Cas. Одним из существенных препятствий к широкому применению методов CRISPR/Cas остается крайне низкая способность представителей трибы Пшеницевые к регенерации. Поэтому возрастает актуальность разработки новых способов доставки компонентов системы CRISPR/Cas, в том числе, в апикальную меристему или в пыльцевые зерна, чтобы получить полноценные растения с редактированными геномами без этапа культивирования in vitro. Разработка таких методов позволит проводить геномное редактирование не только на модельных, но и на коммерчески значимых сортах.

В России систему CRISPR/Cas9 успешно применяют для редактирования генома ячменя в Институте цитологии и генетики СО РАН [92, 104]. Геном мягкой пшеницы редактируют сотрудники Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной биотехнологии [105]. Однако редактированные растения в сельскохозяйственном производстве нашей страны пока не применяются. Одну из проблем представляет присутствие в геномах трансгенных растений “служебной” чужеродной ДНК. Система CRISPR/Cas позволяет удалять нежелательные последовательности из генома, поэтому редактированные растения не могут относиться к ГМО, так как не содержат трансгенов, что позволяет в случае диверсифицированного подхода в сфере правового регулирования допускать к использованию сорта, в ходе получения которых применялось геномное редактирование.

Обзорное исследование Кулуева Б.Р., Михайловой Е.В., Галимовой А.А. и Хлесткиной Е.К. поддержано грантом Минобрнауки РФ (соглашение № 075-15-2021-1066 от 28 сентября 2021 г.), работы Кулуева А.Р. и Заикиной Е.А. выполнены в рамках государственного задания № 122030200143-8.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов исследования.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.