1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Молекулярная биология
  4. T. 57, № 3, 2023

Молекулярная биология, 2023, T. 57, № 3, стр. 546-560

Нуклеазы CRISPR-Cas II типа: алгоритм поиска и in vitro характеристика

А. А. Васильева a, b, *, С. А. Алюкас c, П. А. Селькова a, b, А. Н. Арсениев a, b, В. Е. Чернова b, О. С. Мушарова a, Е. И. Климук a, М. А. Ходорковский b, К. В. Северинов a, d, **

a Институт молекулярной генетики Российской академии наук
123182 Москва, Россия

b Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого
195251 Санкт-Петербург, Россия

c ООО “Биотехнологический кампус”
117437 Москва, Россия

d Waksman Institute of Microbiology
08854 Piscataway, NJ, USA

* E-mail: daucussativus7@gmail.com
** E-mail: severik@waksman.rutgers.edu

Поступила в редакцию 25.11.2022
После доработки 18.12.2022
Принята к публикации 23.12.2022

Аннотация

Использование компонентов систем адаптивного иммунитета бактерий CRISPR-Cas для внесения направленных изменений в ДНК открыло широкие перспективы для программируемого редактирования геномов высших организмов. Наиболее широко используемые генные редакторы основаны на Cas9-эффекторах CRISPR-Cas систем II типа. Cas9 способны специфически вносить двунитевые разрывы в участки ДНК, комплементарные последовательностям направляющих РНК. Несмотря на широкий спектр охарактеризованных Cas9, поиск новых вариантов Cas9 остается актуальной задачей, так как доступные Cas9-редакторы имеют ряд ограничений. В данной работе представлен алгоритм поиска и последующей характеризации новых Cas9-нуклеаз, разработанный в нашей лаборатории. Приведены подробные протоколы, описывающие биоинформатический п-оиск, клонирование и выделение рекомбинантных белков Cas9, проверку наличия нуклеазной а-ктивности in vitro и определение PAM-последовательности, необходимой для узнавания ДНК-мишеней. Рассмотрены потенциальные сложности, которые могут возникнуть в процессе работы, а также способы их преодоления.

Ключевые слова: CRISPR-система, Cas9, нуклеаза, редактирование генома, биоинформатический поиск

Список литературы

  1. Jansen R., van Embden J.D.A., Gaastra W., Schouls L.M. (2002) Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes. Mol. Microbiol. 43, 1565‒1575.

  2. Barrangou R., Fremaux C., Deveau H., Richards M., Boyaval P., Moineau S., Romero D.A., Horvath P. (2007) CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 315, 1709‒1712.

  3. Marraffini L.A., Sontheimer E.J. (2008) CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA. Science. 322, 1843‒1845.

  4. Garneau J.E., Dupuis M.-È., Villion M., Romero D.A., Barrangou R., Boyaval P., Fremaux C., Horvath P., Magadán A.H., Moineau S. (2010) The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468, 67‒71.

  5. Makarova K.S., Wolf Y.I., Iranzo J., Shmakov S.A., Alkhnbashi O.S., Brouns S.J.J., Charpentier E., Cheng D., Haft D.H., Horvath P., Moineau S., Mojica F.J.M., Scott D., Shah S.A., Siksnys V., Terns M.P., Venclovas Č., White M.F., Yakunin A.F., Yan W., Zhang F., Garrett R.A., Backofen R., van der Oost J., Barrangou R., Koonin E.V. (2020) Evolutionary classification of CRISPR-Cas systems: a burst of class 2 and derived variants. Nat. Rev. Microbiol. 18, 67‒83.

  6. Cong L., Ran F.A., Cox D., Lin S., Barretto R., Habib N., Hsu P.D., Wu X., Jiang W., Marraffini L.A., Zhang F. (2013) Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339, 819‒823.

  7. Jinek M., East A., Cheng A., Lin S., Ma E., Doudna J. (2013) RNA-programmed genome editing in human cells. Elife. 2, e00471.

  8. Mali P., Yang L., Esvelt K.M., Aach J., Guell M., DiCarlo J.E., Norville J.E., Church G.M. (2013) RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823‒826.

  9. Deltcheva E., Chylinski K., Sharma C.M., Gonzales K., Chao Y., Pirzada Z.A., Eckert M.R., Vogel J., Charpentier E. (2011) CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III. Nature. 471, 602–607.

  10. Shah S.A., Erdmann S., Mojica F.J.M., Garrett R.A. (2013) Protospacer recognition motifs: mixed identities and functional diversity. RNA Biol. 10, 891–899.

  11. Luscombe N.M., Laskowski R.A., Thornton J.M. (2001) Amino acid–base interactions: a three-dimensional analysis of protein–DNA interactions at an atomic level. Nucleic Acids Res. 29, 2860–2874.

  12. Chatterjee P., Lee J., Nip L., Koseki S.R.T., Tysinger E., Sontheimer E.J., Jacobson J.M., Jakimo N. (2020) A Cas9 with PAM recognition for adenine dinucleotide. Nat. Commun. 11, 2474.

  13. Wei J., Hou L., Liu J., Wang Z., Gao S., Qi T., Gao S., Sun S., Wang Y. (2022) Closely related type II-C Cas9 orthologs recognize diverse PAMs. Elife. 11, e77825.

  14. Fedorova I., Vasileva A., Selkova P., Abramova M., Arseniev A., Pobegalov G., Kazalov M., Musharova O., Goryanin I., Artamonova D., Zyubko T., Shmakov S., Artamonova T., Khodorkovskii M., Severinov K. (2020) PpCas9 from Pasteurella pneumotropica ‒ a compact type II-C Cas9 ortholog active in human cells. Nucleic Acids Res. 48, 12297–12309.

  15. Bland C., Ramsey T.L., Sabree F., Lowe M., Brown K., Kyrpides N.C., Hugenholtz P. (2007) CRISPR Recognition Tool (CRT): a tool for automatic detection of clustered regularly interspaced palindromic repeats. BMC Bioinformatics. 8, 209.

  16. Couvin D., Bernheim A., Toffano-Nioche C., Touchon M., Michalik J., Néron B., Rocha E.P.C., Vergnaud G., Gautheret D., Pourcel C. (2018) CRI-SPRCasFinder, an update of CRISRFinder, includes a portable version, enhanced performance and integrates search for Cas proteins. Nucleic Acids Res. 46, W246–W251.

  17. Edgar R.C. (2007) PILER-CR: fast and accurate identification of CRISPR repeats. BMC Bioinformatics. 8, 18.

  18. Biswas A., Staals R.H.J., Morales S.E., Fineran P.C., Brown C.M. (2016) CRISPRDetect: a flexible algorithm to define CRISPR arrays. BMC Genomics. 17, i356–i356.

  19. Mitrofanov A., Alkhnbashi O.S., Shmakov S.A., Makarova K.S., Koonin E.V., Backofen R. (2021) CRISPRidentify: identification of CRISPR arrays using machine learning approach. Nucleic Acids Res. 49, e20.

  20. Mistry J., Finn R.D., Eddy S.R., Bateman A., Punta M. (2013) Challenges in homology search: HMMER3 and convergent evolution of coiled-coil regions. Nucleic A-cids Res. 41, e121.

  21. Dooley S.K., Baken E.K., Moss W.N., Howe A., Young J.K. (2021) Identification and evolution of Cas9 tracrRNAs. CRISPR J. 4, 438–447.

  22. Mitrofanov A., Ziemann M., Alkhnbashi O.S., Hess W.R., Backofen R. (2021) CRISPRtracrRNA: robust approach for CRISPR tracrRNA detection. Bioinformatics. 38, ii42–ii48.

  23. Livny J., Waldor M.K. (2007) Identification of small RNAs in diverse bacterial species. Curr. Opin. Microbiol. 10, 96–101.

  24. Lorenz R., Bernhart S.H., zu Siederdissen C.H., Tafer H., Flamm C., Stadler P.F., Hofacker I.L. (2011) ViennaRNA Package 2.0. Algorithms Mol. Biol. 6, 26.

  25. Harrington L.B., Burstein D., Chen J.S., Paez-Espino D., Ma E., Witte I.P., Cofsky J.C., Kyrpides N.C., Banfield J.F., Doudna J.A. (2019) Programmed DNA destruction by miniature CRISPR-Cas14 enzymes. Science. 362, 839–842.

  26. Zhang Y., Heidrich N., Ampattu B.J., Gunderson C.W., Seifert H.S., Schoen C., Vogel J., Sontheimer E.J. (2013) Processing-independent CRISPR RNAs limit natural transformation in Neisseria meningitidis. Mol. Cell. 50, 488–503.

  27. Ran F.A., Cong L., Yan W.X., Scott D.A., Gootenberg J.S., Kriz A.J., Zetsche B., Shalem O., Wu X., Makarova K.S., Koonin E.V., Sharp P.A., Zhang F. (2015) In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature. 520, 186–191.

  28. Kim E., Koo T., Park S.W., Kim D., Kim K., Cho H.-Y., Song D.W., Lee K.J., Jung M.H., Kim S., Kim J.H., Kim J.H., Kim J.-S. (2017) In vivo genome editing with a small Cas9 orthologue derived from Campylobacter j-ejuni. Nat. Commun. 8, 14500.

  29. Laemmli U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680–685.

  30. Selkova P., Vasileva A., Pobegalov G., Musharova O., Arseniev A., Kazalov M., Zyubko T., Shcheglova N., Artamonova T., Khodorkovskii M., Severinov K., Fedorova I. (2020) Position of Deltaproteobacteria Cas12e nuclease cleavage sites depends on spacer length of guide RNA. RNA Biol. 17, 1472–1479.

  31. Sun P., Tropea J.E., Waugh D.S. (2011) Enhancing the solubility of recombinant proteins in Escherichia coli by using hexahistidine-tagged maltose-binding protein as a fusion partner. Methods Mol. Biol. 705, 259–274.

  32. Esvelt K.M., Mali P., Braff J.L., Moosburner M., Yaung S.J., Church G.M. (2013) Orthogonal Cas9 proteins for RNA-guided gene regulation and editing. Nat. Methods. 10, 1116–1121.

  33. Zetsche B., Gootenberg J.S., Abudayyeh O.O., Slaymaker I.M., Makarova K.S., Essletzbichler P., Volz S.E., Joung J., van der Oost J., Regev A., Koonin E.V., Zhang F. (2015) Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163, 759–771.

  34. Crooks G.E., Hon G., Chandonia J.-M., Brenner S.E. (2004) WebLogo: a sequence logo generator. Genome Res. 14, 1188–1190.

  35. Hu Z., Wang S., Zhang C., Gao N., Li M., Wang D., Wang D., Liu D., Liu H., Ong S.-G., Wang H., Wang Y. (2020) A compact Cas9 ortholog from Staphylococcus auricularis (SauriCas9) expands the DNA targeting scope. PLoS Biol. 18, e3000686.

  36. Leenay R.T., Maksimchuk K.R., Slotkowski R.A., Agrawal R.N., Gomaa A.A., Briner A.E., Barrangou R., Beisel C.L. (2016) Identifying and visualizing functional PAM diversity across CRISPR-Cas systems. Mol. Cell. 62, 137–47.

  37. Cui Z., Tian R., Huang Z., Jin Z., Li L., Liu J., Huang Z., Xie H., Liu D., Mo H., Zhou R., Lang B., Meng B., Weng H., Hu Z. (2022) FrCas9 is a CRISPR/Cas9 system with high editing efficiency and fidelity. Nat. Commun. 13, 1425.

  38. Fedorova I., Arseniev A., Selkova P., Pobegalov G., Goryanin I., Vasileva A., Musharova O., Abramova M., Kazalov M., Zyubko T., Artamonova T., Artamonova D., Shmakov S., Khodorkovskii M., Severinov K. (2020) DNA targeting by Clostridium cellulolyticum CRISPR-Cas9 type II-C system. Nucleic Acids Res. 48, 2026–2034.

Дополнительные материалы

скачать ESM.zip
Приложение 1.

Инструменты

предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Молекулярная биология

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал