Молекулярная биология. T. 57, Номер 5, 2023

  1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Молекулярная биология
  4. T. 57, № 5, 2023

Молекулярная биология, 2023, T. 57, № 5, стр. 833-852

Продолжительность жизни Drosophila melanogaster регулируется экспрессией гена nejire в периферических тканях и нервной системе

Л. А. Коваль a, Е. Н. Прошкина a, Н. В. Земская a, И. А. Соловьёв a, b, Е. В. Щеголева a, М. В. Шапошников a, А. А. Москалев a, c, d, *

a Институт биологии Коми научного центра Уральского отделения Российской академии наук
167982 Сыктывкар, Россия

b Сыктывкарский государственный университет им. Питирима Сорокина
167001 Сыктывкар, Россия

c Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук
119991 Москва, Россия

d Российский клинический научный центр геронтологии, Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова Министерства здравоохранения Российской Федерации
129226 Москва, Россия

* E-mail: amoskalev@ib.komisc.ru

Поступила в редакцию 25.12.2022
После доработки 27.03.2023
Принята к публикации 28.03.2023

Полный текст (PDF)

Аннотация

Гистонацетилтрансферазы семейства CBP/p300 участвуют в регуляции транскрипции и в осуществлении ряда биологических процессов (пролиферации и дифференцировки клеток, развитии организма, регуляции стресс-ответа и метаболизма). В исследовании на плодовой мушке Drosophila melanogaster нами впервые проанализировано влияние сверхэкспрессии и нокдауна гена nejire (nej), кодирующего ортолог белков CBP/p300 человека, в различных тканях (жировом теле, кишечнике, нервной системе) и на разных стадиях жизненного цикла (все стадии развития или только имаго) на продолжительность жизни. Активация nej оказывала, в зависимости от способа индукции, а также от половой принадлежности, как положительное, так и отрицательное влияние на продолжительность жизни мух. Установлен эффект увеличения продолжительности жизни (на 6–15%) самок при кондиционной сверхэкспрессии nej в кишечнике и конститутивной сверхэкспрессии nej в нервной системе. В остальных случаях наблюдали укорочение жизни (до 44%) либо отсутствие статистически значимых изменений. Кроме того, активация nej приводила к изменению экспрессии генов стресс-ответа (Sod1, Gadd45, Hsp27, Hsp68, Hif1). В то же время нокдаун nej в большинстве вариантов эксперимента приводил к выраженному отрицательному воздействию на длительность жизни дрозофил.

Ключевые слова: гистонацетилтрансфераза, CBP/p300, nejire, продолжительность жизни, стрессоустойчивость, Drosophila melanogaster

ВВЕДЕНИЕ

Старение – многофакторный процесс дерегуляции гомеостаза и гомеодинамики организма, связанный с дегенеративными изменениями на молекулярном, клеточном, тканевом и системном уровнях [1]. В основе старения лежит нарушение баланса между возникновением повреждений макромолекул клетки, с одной стороны, и эффективностью работы компенсаторных механизмов, с другой [1]. Значительную роль играют эпигенетические механизмы, поскольку от них зависит архитектура хроматина и глобальная регуляция экспрессии генов. В частности, ацетилирование гистонов критически важно для формирования структуры хроматина при изменении условий окружающей среды, поддержании протеостаза и митохондриальной функции, для дифференцировки клеток и обеспечения функционирования тканей за счет контроля экспрессии генов гистонацетилтрансферазами [2].

Белки CBP (белок, связывающий CREB) и p300 относятся к транскрипционным коактиваторам из класса ацетилтрансфераз, которые модифицируют ряд ядерных белков, включая гистоны H3 (по K18 и K27) и H4 (по K8) [3]. Однако эти ацетилтрансферазы могут регулировать также активность негистоновых белков [4, 5]. Изучение профилей экспрессии генов, регулируемых CBP/p300, показало, что они вовлечены в такие процессы, как клеточная сигнализация, пролиферация и дифференцировка, развитие организма, малигнизация, ответ на воздействие стресс-факторов [6, 7]. CBP/p300 вносит важный вклад в запуск механизмов клеточного старения. Например, p300 индуцирует динамическое гиперацетилированное состояние хроматина и способствует образованию активных энхансерных элементов в некодирующих участках генома, что приводит к запуску специфичной для клеточного старения программы экспрессии генов [8]. CBP/p300 вместе с транскрипционным фактором р53 вовлечены в индукцию р21 при клеточном старении [9, 10]. Вместе с тем, с возрастом активность p300 в некоторых тканях снижается, а геропротекторные вмешательства, такие как ограничение питания, усиливают функцию CBP/p300 [2].

Высококонсервативные ацетилтрансферазы семейства СBP/p300 встречаются как у беспозвоночных, так и у млекопитающих [11]. Несмотря на важную роль СBP/p300 в процессах клеточного старения, его вклад в продолжительность жизни организма не исследован. Цель данной работы состояла в изучении эффектов сверхэкспрессии и нокдауна гена nejire (nej) Drosophila melanogaster, кодирующего ортолог СBP, в клетках жирового тела, кишечника и нервной системы на продолжительность жизни (ПЖ) мух.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Линии D. melanogaster. В работе использовали трансгенные линии дрозофил с UAS-конструкциями и драйверами GAL4.

Линия EP-nej (#30733, Блумингтон, США) содержит в X хромосоме инсерцию энхансерного элемента (EP), определяющего активацию экспрессии nej под контролем промотора UAS [12, 13]. UAS-nej (#32573, Блумингтон) содержит в третьей хромосоме копию гена nej под контролем промотора UAS. UAS-nej.siRNA(X) (#32576, Блумингтон) и UAS-nej.siRNA(2) (#32577, Блумингтон) экспрессируют двухцепочечную РНК для РНК-интерференции nej под контролем UAS. Конструкции встроены в X и вторую хромосомы соответственно. Эффективность использованных UAS-конструкций подтверждена ранее [14–16].

Конструкция ELAV-GS-GAL4 (#43642, Блумингтон), встроенная в хромосому 3, активирует RU486-зависимую экспрессию GS-GAL4 в нейронах под действием мифепристона (RU486). S106-GS-GAL4 (#8151, Блумингтон) экспрессирует RU486-активируемый GS-GAL4 в клетках жирового тела. Конструкция встроена во вторую хромосому. TIGS-2-GS-GAL4 (получена от L. Seroude, Университет Куинс, Кингстон, Канада) содержит конструкцию для экспрессии GS-GAL4 в клетках кишечника. ELAV-GAL4 (#8765, Блумингтон), локализованная во второй хромосоме, вырабатывает конститутивный драйвер GAL4 в клетках нервной системы. D42-GAL4 (#8816, Блумингтон), встроенная в третью хромосому, конститутивно экспрессирует GAL4 в мотонейронах.

Активация сверхэкспрессии и сайленсинг гена nejire. Для сверхэкспрессии и нокдауна гена nej использовали систему GAL4/UAS [17, 18].

В случае сверхактивации UAS-линия содержала дополнительную копию исследуемого гена под контролем промотора UAS. При нокдауне она несла дцРНК, специфично подавляющую один из исследуемых генов посредством РНК-интерференции, под контролем UAS.

В качестве GAL4-компонента использовали кондиционные (мифепристон-активируемые) драйверы GAL4-GeneSwitch или конститутивные GAL4. Применение этих драйверов позволяет контролировать уровень экспрессии исследуемых генов, стадию развития (имаго или в течение всего жизненного цикла) и возраст дрозофил, при котором происходит индукция экспрессии, а также локализацию подавления или сверхактивации генов (повсеместно или тканеспецифично).

Для получения экспериментальных особей, содержащих обе конструкции, девственных самок UAS-линии скрещивали с самцами GAL4-линии.

Если использовали один из кондиционных драйверов, то добавление мифепристона (RU486, “Merck”, США) в питательную среду потомства от этого скрещивания приводило к активации транскрипционного фактора GAL4-GeneSwitch и индукции транскрипции UAS-конструкции. Чтобы снизить влияние мифепристона на продолжительность жизни, отбирали самцов и девственных самок [19], которых рассаживали раздельно по 30 особей в пробирку. На поверхность питательной среды в пробирках с опытными вариантами наносили по 30 мкл раствора мифепристона (3.2 мг/мл в 96%-ном этаноле). В качестве контроля использовали мух c тем же генотипом, но живущих на питательной среде без мифепристона (в пробирки с этими мухами добавляли по 30 мкл 96%-ного этанола). Схема и условия эксперимента со сверхэкспрессией и нокдауном nej были идентичными, отличались только линии, используемые для скрещивания.

При конститутивной сверхэкспрессии nej у потомков скрещивания транскрипционный фактор GAL4 запускал экспрессию дополнительной копии этого гена в течение всего жизненного цикла. В качестве контроля использовали дрозофил родительских линий. Генетический фон всех используемых линий был предварительно выровнен по линии w1118 (#3605, Блумингтон).

Условия содержания дрозофил. Мух содержали в постоянных условиях в климатической камере Binder KBF720-ICH (“Binder”, Германия) при температуре 25°С, относительной влажности воздуха 60% и 12 ч режиме освещения. Состав питательной среды, на которой содержали контрольных и опытных мух при проведении всех экспериментов, адаптирован из работы [20]: вода – 1 л, кукурузная мука – 92 г, сухие дрожжи – 32.1 г, агар-агар – 5.2 г, глюкоза – 136.9 г.

Количественная ПЦР в реальном времени с этапом обратной транскрипции. Для верификации сверхэкспрессии гена nej и анализа уровня экспрессии генов стресс-ответа использовали по 20 имаго самцов и 10 имаго самок в возрасте 5 сут. Экспрессию измеряли методом количественной ПЦР в режиме реального времени с этапом обратной транскрипции (ОТ-ПЦР). РНК выделяли из целых тел имаго с помощью Aurum Total RNA Mini Kit (“Bio-Rad”, США) по инструкции изготовителя. Концентрацию РНК измеряли с помощью Quant-iT RNA Assay Kit (“Invitrogen”, США). Далее синтезировали кДНК по инструкции iScript cDNA Synthesis Kit (“Bio-Rad”). Смесь для проведения реакции ПЦР готовили по инструкции изготовителя qPCRmix-HS SYBR (“Евроген”, Россия) и праймеров (табл. 1). ПЦР проводили в амплификаторе CFX96 (“Bio-Rad”), используя следующую программу:

Таблица 1.  

Нуклеотидные последовательности праймеров

Ген-мишень Прямой праймер (5' → 3') Обратный праймер (5' → 3')
nej GATCCACTGCAATCGCAAACCC TCCAGTTCGAGGTGATCGTTCTTC
Gadd45 AAGTCGCGCACAGATACTCACG TTTGTTGGTTCGGCAGCTGGTC
Hif1 TGAGCACAGGCGACCCAAATTAC TGTCCTGTATGTTCGCCTCGTC
Hsp27 ACTGGGTCGTCGTCGTTATTCG CGCGCGACGTGACATTTGATTG
Hsp68 TCAAGTGTTTGAGGGCGAGAGG ACGCCAGTGAGATCGAATGTGC
Sod1 TGCACGAGTTCGGTGACAACAC TCCTTGCCATACGGATTGAAGTGC
β-Tubulin56D GCAACTCCACTGCCATCC CCTGCTCCTCCTCGAACT
eEF1α2 AGGGCAAGAAGTAGCTGGTTTGC GCTGCTACTACTGCGTGTTGTTG
RpL32 GAAGCGCACCAAGCACTTCATC CGCCATTTGTGCGACAGCTTAG

1) 95.0°C, 30 с;

2) 95.0°C, 10 с;

3) 60.0°C, 30 с;

4) пункты 2 и 3 повторяли 39 раз.

Уровень экспрессии гена nej в скрещиваниях рассчитывали относительно экспрессии гена домашнего хозяйства β-Tubulin56D с использованием программного обеспечения CFX Manager 3.1 (“Bio-Rad”). Статистическую значимость различий оценивали с помощью t-критерия Стьюдента.

Уровень экспрессии гена nej и генов стресс-ответа (Gadd45, Hif1, Hsp27, Hsp68, Sod1) рассчитывали относительно уровня референсных генов (β‑Tubulin56D, eEF1α2, RpL32) с использованием программного обеспечения CFX Manager 3.1 (“Bio-Rad”). Значимость различий оценивали с помощью критерия Манна–Уитни.

Анализ параметров продолжительности жизни. Самцов и девственных самок для анализа ПЖ получали из синхронных кладок. Отбор имаго проводили в течение 6 ч после вылета из куколок с использованием аппарата для CO2-анестезии Benchtop Flowbuddy Complete (“Genesee Scientific”, США). Мух (по 30 особей) рассаживали в пробирки с контрольной и экспериментальной питательной средой. Самцы и самки жили раздельно. Три–пять пробирок использовали в каждой повторности эксперимента. Умерших мух учитывали каждые 24 ч. Два раза в неделю мух переносили на свежую среду.

Результаты представляли в виде кривых дожития. Также рассчитывали медианную ПЖ (длительность жизни наиболее типичных представителей выборки) и возраст 90%-ной смертности (показатель максимальной ПЖ). При статистической обработке данных применяли непараметрические методы. Функции дожития сравнивали, используя критерий Колмогорова–Смирнова [21]. Достоверность различий по медианной ПЖ оценивали с помощью критериев Мантеля–Кокса [22] и Гехана–Бреслоу–Вилкоксона [23]. Статистическую значимость различий максимальной ПЖ определяли с использованием метода Ванг–Аллисона [24]. Статистическую обработку данных проводили с помощью программы Statistica, версия 6.1 (StatSoft, США), статистической среды R, версия 2.15.1 (The R Foundation) и онлайн-приложения OASIS 2 (Online application for survival analysis) [25].

Анализ стрессоустойчивости D. melanogaster. Устойчивость к неблагоприятным факторам изучали на особях в возрасте 10 сут. Мух содержали на среде, состоящей из 2% агар-агара и 5% сахарозы в воде. Для определения устойчивости к окислительному стрессу в среду добавляли 20 ммоль/л параквата (Methyl Viologen, “Merck”), а для оценки устойчивости к стрессу эндоплазматической сети (ЭПС) – 12 мкмоль/л туникамицина (“Merck”). Погибших мух идентифицировали с помощью монитора индивидуальной активности DAM2 Drosophila Activity Monitor (“TriKinetics Inc.”, США) по полному отсутствию движения. Стрессовые условия сохранялись до гибели мух без пересадки в свежие пробирки. В каждом варианте опыта использовали 16–32 мухи в 2–4 повторностях (всего 32–112 особей).

Cтатистическую значимость различий оценивали с использованием дисперсионного анализа по Краскелу–Уоллису и апостериорного U-критерия Манна–Уитни с поправкой Бонферрони [26].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Уровень экспрессии гена nej. Кондиционную сверхэкспрессию гена nej подтверждали, сравнивая уровень экспрессии этого гена у особей с генотипами S106-GS-GAL4>EP-nej и S106-GS-GAL4>UAS-nej, а также TIGS-2-GS-GAL4>EP-nej и TIGS-2-GS-GAL4>UAS-nej, содержащихся на среде с мифепристоном (особи с кондиционной сверхэкспрессией гена nej), и у особей с таким же генотипом, но содержащихся на среде без мифепристона. Показано увеличение активности nej у самцов в 2.8–4.1, а у самок – в 1.2–4.7 раза (рис. 1).

Рис. 1.

Верификация сверхэкспрессии гена nej у самцов (а, в, д, ж) и самок (б, г, е, з) D. melanogaster. ***p < 0.001; **p < 0.01; *p < 0.05 по t-критерию Стьюдента.

Для подтверждения конститутивной сверхэкспрессии гена nej сравнивали уровень экспрессии этого гена между родительскими линиями и потомками от скрещиваний ELAV-GAL4>EP-nej, ELAV-GAL4>UAS-nej, D42-GAL4>EP-nej, D4-2-GAL4>UAS-nej. В случае линии с драйвером ELAV транскрипция гена nej у самцов была в 2.3–3.4 раза выше, чем в UAS-родительской линии, а у самок – в 1.2–2.0 раза (рис. 1д, 1е). У самцов, полученных в скрещивании с линией с драйвером D42, экспрессия nej была в 4.5–11.0, а у самок – в 2.0–15.0 раз выше, чем в родительской линии (рис. 1ж, 1з).

Стоит отметить, что в некоторых случаях различия не имели статистической значимости (p > 0.05).

Влияние сверхэкспрессии гена nejire на продолжительность жизни и стрессоустойчивость D. melanogaster. Нами изучено влияние сверхэкспрессии гена nej в жировом теле, кишечнике и нервной системе на ПЖ самцов и самок D. melanogaster.

Обнаружено, что кривые выживаемости дрозофил с генотипами S106-GS-GAL4>UAS-nej и S106-GS-GAL4>EP-nej с мифепристон-индуцированной сверхэкспрессией гена nej в жировом теле расположены ниже, чем кривые особей без сверхэкспрессии (p < 0.001). Анализ параметров ПЖ подтверждает данный результат. Медианная ПЖ в результате активации nej была снижена на 9.5–39.0% (p < 0.001), а максимальная – на 6.9–36.4% (p < 0.01) (рис. 2, табл. 2). Однако у самок S106-GS-GAL4>EP-nej с индукцией сверхэкспрессии nej отсутствовали статистически значимые изменения параметров ПЖ. В то же время, активация экспрессии nej у самок S106-GS-GAL4>UAS-nej вызывала существенное (p < 0.001) снижение устойчивости к индуктору стресса ЭПС туникамицину, но статистически значимого влияния на стрессоустойчивость самцов не обнаружено (p > 0.05) (табл. S1 , см. Дополнительные материалы на сайте http://www.molecbio.ru/downloads/ 2023/5/supp_Koval_rus.pdf).

Рис. 2.

Влияние сверхэкспрессии гена nej в жировом теле на продолжительность жизни самцов (а, в) и самок (б, г) D. melanogaster. ***p < 0.001; **p < 0.01; *p < 0.05 по критерию Колмогорова–Смирнова.

Таблица 2.  

Влияние сверхэкспрессии гена nej в жировом теле на продолжительность жизни D. melanogaster

Генотип Пол RU486 (+/–) М dM Лог-ранговый критерий, p 90% d90% Критерий Ванг–Аллисона, p n
S106-GS-GAL4>UAS-nej ♂ – 59 66 145
S106-GS-GAL4>UAS-nej ♂ + 36 –39.0 1.4e–49 42 –36.4 0.0007 146
S106-GS-GAL4>UAS-nej ♀ – 73 85 142
S106-GS-GAL4>UAS-nej ♀ + 46 –37.0 8.4e–29 71 –16.5 5.1e–9 158
S106-GS-GAL4>EP-nej ♂ – 63 72 165
S106-GS-GAL4>EP-nej ♂ + 57 –9.5 0.000044 67 –6.9 0.0075 144
S106-GS-GAL4>EP-nej ♀ – 61 71 162
S106-GS-GAL4>EP-nej ♀ + 61 0 0.9574 71 0 0.8207 155

Примечание. Здесь и в табл. 3–6. ♂ – самцы. ♀ – самки. RU486 (+/–) – отсутствие “–”; контроль или наличие “+”; эксперимент кондиционной сверхэкспрессии. M – медианная продолжительность жизни (сут). 90% – возраст 90%-ной смертности (сут). dM и d90% – отношение значений в эксперименте и в контроле (%). n – количество мух в выборке.

Кривая выживаемости у самцов TIGS-2-GS-GAL4>UAS-nej с кондиционной сверхэкспрессией гена nej в кишечнике располагается ниже, чем у самцов без сверхэкспрессии этого гена (p < 0.001). Медианная ПЖ и возраст 90%-ной смертности меньше на 14.9 и 30.3%, соответственно, (p < 0.001), чем у контрольных мух без сверхэкспрессии (рис. 3, табл. 3). При этом кривые выживаемости самцов и самок TIGS-2-GS-GAL4>EP-nej, а также самок TIGS-2-GS-GAL4>UAS-nej с активацией nej в кишечнике расположены выше, чем кривые популяций контрольных особей (p < 0.05). Медианная ПЖ у данных особей больше на 6.4–8.0% (p < 0.01), а увеличение возраста 90% смертности на 5.1% (p < 0.05) наблюдали только у самок с генотипом TIGS-2-GS-GAL4>EP-nej (рис. 3, табл. 3).

Рис. 3.

Влияние сверхэкспрессии гена nej в кишечнике на продолжительность жизни самцов (а, в) и самок (б, г) D. melanogaster. ***p < 0.001; **p < 0.01; *p < 0.05 по критерию Колмогорова–Смирнова.

Таблица 3.  

Влияние сверхэкспрессии гена nej в кишечнике на продолжительность жизни особей D. melanogaster

Генотип Пол RU486 (+/–) М dM Лог-ранговый критерий, p 90% d90% Критерий Ванг–Аллисона, p n
TIGS-2-GS-GAL4>UAS-nej ♂ – 47 66 157
TIGS-2-GS-GAL4>UAS-nej ♂ + 40 –14.9 8.20E–22 46 –30.3 2.3E–06 155
TIGS-2-GS-GAL4>UAS-nej ♀ – 47 59 164
TIGS-2-GS-GAL4>UAS-nej ♀ + 50 6.4 0.001 62 5.1 0.2826 164
TIGS-2-GS-GAL4>EP-nej ♂ – 50 59 65
TIGS-2-GS-GAL4>EP-nej ♂ + 54 8.0 0.0014 62 5.1 0.246 36
TIGS-2-GS-GAL4>EP-nej ♀ – 65 78 78
TIGS-2-GS-GAL4>EP-nej ♀ + 67 3.1 0.1034 82 5.1 0.0269 79

Примечание. Обозначения, как в табл. 2.

В следующей серии экспериментов изучено влияние сверхэкспрессии гена nej в нервной системе.

У самок ELAV-GS-GAL4>UAS-nej с кондиционной активацией nej в нервной системе наблюдали статистически значимое сокращение медианной ПЖ 16.9% (p < 0.0001) (рис. 4, табл. 4). Самки с генотипом ELAV-GS-GAL4>EP-nej и сверхэкспрессией nej имели максимальную (но не медианную) ПЖ, на 10.4% (p < 0.05) большую, чем в контрольной группе, не получавшей мифепристон. В то же время не выявлено статистически значимых различий у самцов (рис. 4, табл. 4).

Рис. 4.

Влияние сверхэкспрессии гена nej в нервной системе на продолжительность жизни самцов (а, в) и самок (б, г) D. melanogaster. ***p < 0.001; **p < 0.01; *p < 0.05 по критерию Колмогорова–Смирнова.

Таблица 4.  

Влияние сверхэкспрессии гена nej в нервной системе на продолжительность жизни особей D. melanogaster

Генотип Пол RU486 (+/–) M dM, % Лог-ранговый критерий, p 90% d90% Критерий Ванг–Аллисона, р n
ELAV-GS-GAL4>UAS-nej ♂ – 79 92 353
ELAV-GS-GAL4>UAS-nej ♂ + 78 –1.3 0.519 89 –3.3 <0.0001 313
ELAV-GS-GAL4>UAS-nej ♀ – 89 105 307
ELAV-GS-GAL4>UAS-nej ♀ + 74 –16.9 <0.0001 92 –12.4 <0.0001 311
ELAV-GS-GAL4>EP-nej ♂ – 61 73 77
ELAV-GS-GAL4>EP-nej ♂ + 65 6.6 0.0915 75 2.7 0.022 67
ELAV-GS-GAL4>EP-nej ♀ – 60 77 49
ELAV-GS-GAL4>EP-nej ♀ + 66.5 10.8 0.153 85 10.4 0.042 54

Примечание. Обозначения, как в табл. 2.

Среди мух с конститутивной сверхэкспрессией гена nej в нервной системе наблюдали статистически значимое сокращение количества самцов ELAV-GAL4>EP-nej, достигших возраста медианной ПЖ (на 11.2% по сравнению с особями драйверной линии ELAV-GAL4), а также сдвиг кривой дожития влево (табл. 5, рис. 5a). Отмечено статистически значимое увеличение медианной ПЖ у самок ELAV-GAL4>UAS-nej и ELAV-GAL4> EP-nej – на 10.2–15.3% (p <0.001) относительно родительских линий и сдвиг кривых дожития вправо (табл. 5, рис. 5б). При этом у особей обоего пола увеличивался возраст 90%-ной гибели (на 6.2–20.6% по сравнению с контрольными генотипами (p <0.05)) либо отсутствовал статистически значимый эффект (табл. 5).

Таблица 5.  

Влияние конститутивной сверхэкспрессии гена nej в нервной системе на продолжительность жизни D. melanogaster

Генотип Пол M dM,
% 		Лог-ранговый критерий, p 90% d90% Критерий Ванг–Аллисона, p n
UAS-nej ♂ 54 66 158
EP-nej ♂ 47 65 151
ELAV-GAL4 ♂ 54 65 276
ELAV-GAL4>UAS-nej ♂ 54 0'
0* 		0.0056
0.1285 		68 4.6'
3.03* 		0.0878
0.5377 		309
ELAV-GAL4>EP-nej ♂ 48 –11.1'
2.1#		 0.3878
0.6899 		69 6.2'
6.2#		 0.0418
0.1272 		300
UAS-nej ♀ 58 68 167
EP-nej ♀ 61 72 158
ELAV-GAL4 ♀ 59 71 301
ELAV-GAL4>UAS-nej ♀ 65 10.2'
12.1* 		0
0 		82 15.5'
20.6* 		0
0 		320
ELAV-GAL4>EP-nej ♀ 68 15.3'
11.5#		 0
0 		75 5.7'
4.2#		 0
0.1253 		288

'Относительно ELAV-GAL4. *Относительно UAS-nej. #Относительно EP-nej.

Рис. 5.

Влияние конститутивной сверхэкспрессии гена nej в нервной системе на продолжительность жизни самцов (а) и самок (б) D. melanogaster. р <0.05 по критерию Колмогорова–Смирнова относительно драйверной (*) или UAS (#) линий соответственно.

Наблюдали также повышение устойчивости самцов и самок линий ELAV-GAL4>UAS-nej и самцов ELAV-GAL4>EP-nej к воздействию туникамицина по сравнению с мухами линии ELAV-GAL4 (табл. S1 , см. Дополнительные материалы на сайте http://www.molecbio.ru/downloads/2023/5/supp_Koval_rus.pdf).

У мух линий D42-GAL4>UAS-nej и D42-GAL4> EP-nej обоего пола, конститутивно сверхэкспрессирующих nej в мотонейронах в условиях окислительного стресса, наблюдалось сокращение медианной выживаемости на 27.1–43.8% (p < 0.001) и максимальной выживаемости на 13.8–24.7% (p < 0.01) относительно родительских линий (табл. 6). Эти эффекты подтверждают графики выживаемости (рис. 6). Кроме того, выживаемость самок D42-GAL4>UAS-nej в условиях окислительного стресса также была существенно снижена (p < 0.001) по сравнению с контрольной родительской линией D42-GAL4 (табл. S1 ).

Таблица 6.  

Влияние конститутивной сверхэкспрессии гена nej в мотонейронах на продолжительность жизни мух D. melanogaster

Генотип Пол M dM, % Лог-ранговый критерий, p 90% d90% Критерий Ванг–Аллисона, p n
UAS-nej ♂ 54 66 158
EP-nej ♂ 47 65 151
D42-GAL4 ♂ 48 58 139
D42-GAL4>UAS-nej ♂ 35 –27.1' –35.2* 0.0000061'
0* 		54 –6.9'
–18.2* 		0.4454'
0.0076* 		133
D42-GAL4>EP-nej ♂ 34 –29.2'
–27.7#		 0'
0#		 50 –13.8'
–23.1#		 0.0104'
0.0031#		 114
UAS-nej ♀ 58 68 167
EP-nej ♀ 61 72 158
D42-GAL4 ♀ 64 77 134
D42-GAL4>UAS-nej ♀ 36 –43.8' –37.9* 0'
0* 		58 –24.7'
–14.7* 		0.0006'
0.0028* 		131
D42-GAL4>EP-nej ♀ 40 –37.5' –34.4# 0'
0#		 58 –24.7' –19.4# 0.0006'
0.0057#		 121

'Относительно D42-GAL4. *Относительно UAS-nej. #Относительно EP-nej.

Рис. 6.

Влияние конститутивной сверхэкспрессии гена nej в мотонейронах на продолжительность жизни самцов (а) и самок (б) D. melanogaster. р <0.05 по критерию Колмогорова–Смирнова относительно драйверной (*) или UAS (#)-линий соответственно.

С возрастом происходит нарушение регуляции транскрипции многих генов. В данной серии экспериментов нами впервые показано влияние тканеспецифичной сверхэкспрессии гена nej (CBP/p300), кодирующего коактиватор транскрипции, на ПЖ целого организма. Установлено, что эффекты сверхэкспрессии гена nej зависят от драйвера, типа ткани, в которой происходит индукция сверхэкспрессии, а также половой принадлежности. В некоторых вариантах активация nej вызывает незначительное увеличение медианной и максимальной ПЖ (до 8–15%), но при этом может (в других случаях) приводить к существенному негативному эффекту (до 30–44%).

Влияние сверхэкспрессии гена nejire на активность генов стресс-ответа. Повышенная экспрессия гена nej в жировом теле, нервной системе и кишечнике приводила к изменению активности генов стресс-ответа D. melanogaster, обеспечивающих детоксикацию свободных радикалов (Sod1), ответ на повреждение ДНК (Gadd45) и белков (Hsp27, Hsp68), а также ответ на гипоксию (Hif1) (рис. 7, 8). При этом наблюдали как стимуляцию, так и подавление транскрипции генов Sod1, Gadd45, Hsp27, Hsp68 в зависимости от пола, использованных конструкций (UAS и GAL4) и ткани с повышенной активностью nej. Наиболее воспроизводимой была тенденция к снижению экспрессии гена белка теплового шока Hsp27 (в 2–5 раз) у самцов и самок с тканеспецифичной активацией nej. Кроме того, сверхэкспрессия гена nej в различных тканях самцов и самок дрозофилы приводила к подавлению транскрипции Hif1 (рис. 7, 8).

Рис. 7.

Влияние активации дополнительной копии гена nej под контролем промотора UAS (а) или элемента EP (б) на экспрессию генов стресс-ответа у самцов D. melanogaster. *p < 0.05 по t-критерию Манна–Уитни.

Рис. 8.

Влияние активации дополнительной копии гена nej под контролем промотора UAS (а) или элемента EP (б) на экспрессию генов стресс-ответа у самок D. melanogaster. *p <0.05 по t-критерию Манна–Уитни.

Влияние нокдауна гена nejire, вызванного РНК-интерференцией, на продолжительность жизни D. melanogaster. При снижении активности nej в жировом теле и кишечнике происходило уменьшение медианной ПЖ (на 10–77%, p < 0.0001) и возраста 90%-ной смертности (на 11–74%, p < 0.0001) у самцов и самок D. melanogaster (рис. 9, 10, табл. 7). Менее выраженное снижение медианной ПЖ (на 9–10%, p < 0.05) наблюдалось также у мух со сниженной активностью nej в нервной системе в случае с локализацией UAS-конструкции в хромосоме 2 (рис. 11, табл. 7). В то же время, у самок с конструкцией UAS для РНК-интерференции nej, встроенной в хромосому X, нейрон-специфичный нокдаун приводил к увеличению медианной ПЖ и возраста 90%-ной смертности на 11% (p < 0.05) (рис. 11, табл. 7).

Рис. 9.

Влияние нокдауна гена nej в жировом теле на продолжительность жизни самцов (а, в) и самок (б, г) D. melanogaster. ***p < 0.0001 по критерию Колмогорова–Смирнова.

Рис. 10.

Влияние нокдауна гена nej в кишечнике на продолжительность жизни самцов (а, в) и самок (б, г) D. melanogaster. *p < 0.01, ***p < 0.0001 по критерию Колмогорова–Смирнова.

Таблица 7.

Влияние тканеспецифичного нокдауна гена nej на продолжительность жизни D. melanogaster

Генотип RU486 Пол M, сут dM,% МК, p ГВ, p 90%, сут d90% (%) ВА, p n
S106-GS-GAL4> UAS-nej.siRNA(X) – ♂ 68 83 137
+ ♂ 33 –51 <0.0001 <0.0001 41 –51 <0.0001 148
– ♀ 64 78 76
+ ♀ 46 –28 <0.0001 <0.0001 54 –31 <0.0001 126
S106-GS-GAL4> UAS-nej.siRNA(2) – ♂ 63 73 143
+ ♂ 62 –2 >0.05 >0.05 76 +4 >0.05 133
– ♀ 76 83 106
+ ♀ 48 –37 <0.0001 <0.0001 73 –12 <0.0001 137
TIGS-2-GS-GAL4> UAS-nej.siRNA(X) – ♂ 65 80 149
+ ♂ 15 –77 <0.0001 <0.0001 21 –74 <0.0001 160
– ♀ 55 70 92
+ ♀ 18 –67 <0.0001 <0.0001 25 –64 <0.0001 122
TIGS-2-GS-GAL4> UAS-nej.siRNA(2) – ♂ 63 72 155
+ ♂ 39 –38 <0.0001 <0.0001 46 –36 <0.0001 152
– ♀ 52 65 95
+ ♀ 47 –10 <0.0001 <0.01 58 –11 <0.0001 112
ELAV-GS-GAL4> UAS-nej.siRNA(X) – ♂ 75 84 101
+ ♂ 72 –4 <0.05 >0.05 81 –4 <0.01 128
– ♀ 56 71 117
+ ♀ 62 +11 <0.001 <0.0001 79 +11 <0.05 124
ELAV-GS-GAL4> UAS-nej.siRNA(2) – ♂ 70 84 251
+ ♂ 64 –9 <0.01 <0.05 81 –4 <0.05 246
– ♀ 70 84 242
+ ♀ 63 –10 <0.01 <0.001 83 –1 >0.05 235

Примечание. M – медианная продолжительность жизни (сут). 90% – возраст 90%-ной смертности (сут). dM и d90% – различия между медианной продолжительностью жизни и возрастом 90%-ной смертности у контрольных и экспериментальных мух соответственно (%). ГВ – критерий Гехана–Вилкоксона. МК – критерий Мантеля–Кокса. ВА – тест Ванг–Аллисона. n – количество особей в выборке.

Рис. 11.

Влияние нокдауна гена nej в нервной системе на продолжительность жизни самцов (а, в) и самок (б, г) D. melanogaster. *p < 0.01, **p < 0.001 по критерию Колмогорова–Смирнова.

Полученные результаты согласуются с результатами исследований, проведенных на нематоде Caenorhabditis elegans. Полный нокдаун cbp-1 (ортолог CBP/p300 у нематод) вызывал уменьшение средней ПЖ на 30% и выживаемости в условиях окислительного стресса [27].

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Нами изучено влияние сверхэкспрессии и нокдауна гена nej в жировом теле, кишечнике и нервной системе на ПЖ D. melanogaster.

Сверхактивация nej в жировом теле, как правило, оказывала отрицательное влияние на ПЖ и стрессоустойчивость мух. Но повышенная экспрессия этого гена в кишечнике, напротив, чаще вызывала увеличение ПЖ. При этом эффект активации nej в клетках нервной системы варьировал в зависимости от используемых UAS- и GAL4-конструкций. Кондиционная сверхэкспрессия nej с использованием UAS-nej или EP-nej в нервной системе оказывала противоположные эффекты на ПЖ мух. Конститутивная сверхэкспрессия nej в нервной системе, как правило, увеличивала ПЖ и устойчивость к индуктору стресса ЭПС, но повышение активности этого гена в мотонейронах приводило к отрицательным изменениям. Эти эффекты сопровождались разнонаправленным изменением уровней экспрессии генов стресс-ответа с общей тенденцией к снижению.

Разнонаправленные эффекты тканеспецифичной сверхэкспрессии гена nej могут быть связаны с тем, что семейство ацетилтрансфераз CBP/p300, к которому относится белок, кодируемый изучаемым нами геном, имеет целый ряд мишеней в клетке (включая гистоновые и негистоновые белки), на которые воздействует разными способами, проявляя ферментативную и неферментативную активности.

Ацетилтрансферазы CBP/p300 способствуют транскрипции путем “разрыхления” хроматина, рекрутирования РНК-полимеразы II и перехода к элонгации, а также усиления связывания факторов транскрипции с геномной ДНК [28, 29]. Это необходимо для поддержания нормального функционирования клеток и организма в меняющихся условиях окружающей среды. CBP/p300 регулируют клеточную локализацию и активность таких транскрипционных факторов, как p53 [30–32], FOXO [33], NRF2 [27, 34], HSF1 [35], HIF-1 [36], влияют на экспрессию их генов-мишеней (например, генов, кодирующих супероксид-дисмутазы, белки ответа на повреждение ДНК и контроля клеточного цикла, белки теплового шока). Так, активация CBP/p300 в клетках рака кишечника повышает уровень Gadd45 и p21 – важных регуляторов ответа на повреждение ДНК и ингибиторов роста опухолей [10]. Однако в нашем исследовании количество мРНК гена Gadd45 как увеличивалось, так и снижалось у мух со сверхэкспрессией nej в различных тканях и, по-видимому, не было связано с изменениями ПЖ. CBP-1 идентифицирован как негативный регулятор HSF-1 у C. elegans [37], что согласуется со сниженной активностью генов белков теплового шока у дрозофил со сверхэкспрессией гена nej.

Известно, что CBP стабилизирует РНК-полимеразу II в репрессивных сайтах, связанных с белками группы Polycomb, и способствует приостановке полимеразы. Это необходимо для образования гибрида РНК-ДНК (R-петли) и истощения нуклеосом в элементах ответа на Polycomb [38]. Эпигенетическая регуляция с помощью Polycomb является важным негативным регулятором скорости старения и стрессоустойчивости организма [39, 40].

На посттранскрипционном уровне CBP/p300 могут влиять на генную экспрессию путем ацетилирования экзорибонуклеазы CAF1a с последующим усилением распада поли(А)РНК и усилением обмена мРНК. Стимуляция обмена мРНК необходима для пролиферации и дифференцировки клеток, развития организма в целом. Кроме того, обмен мРНК помогает клеткам поддерживать высокодинамичный режим регуляции экспрессии генов [41]. С другой стороны, чрезмерная активация ацетилтрансфераз может вызывать усиленную деградацию мРНК, необходимых для поддержания жизнеспособности организма.

CBP/p300 участвует во многих молекулярных путях и клеточных процессах, детерминируя баланс между ними и конечную судьбу клетки и организма. Так, исследования, проведенные на клетках немелкоклеточного рака легких, показали, что CBP/p300 играет важную роль в поддержании баланса между продукцией активных форм кислорода, ответом на повреждение ДНК и запуском аутофагии; от его активности зависит, будут клетки делиться дальше либо они подвергнутся остановке клеточного цикла или апоптозу [42].

Белки CBP/p300 необходимы для запуска ответа на повреждение ДНК. Прежде всего, они ацетилируют гистоны в местах повреждения ДНК для облегчения репарации. Однако они также способны ацетилировать ключевые белки, обеспечивающие передачу сигналов о повреждении ДНК и разные механизмы репарации ДНК, за счет чего регулируют каталитическую активность, ядерную локализацию, связывание с ДНК и обмен данных белков [4]. С другой стороны, можно предположить, что дополнительная активация CBP/p300 (например, в результате сверхэкспрессии гена nej) приводит к чрезмерной релаксации хроматина в результате избыточного ацетилирования гистонов, повышающего уязвимость генетического материала для повреждающих факторов различной природы [43]. В нашей работе это могло привести к снижению выживаемости особей D. melanogaster в нормальных и стрессовых условиях, а также к изменению уровней транскрипции генов стресс-ответа.

Ацетилтрансферазы CBP/p300 являются важными регуляторами аутофагии (положительными или отрицательными, в зависимости от условий) и способны осуществлять эту функцию как на транскрипционном, так и на пострансляционном уровне [2, 5, 44]. Снижение активности CBP/p300 в скелетных мышцах, сердце, печени, жировой ткани животных, связано с усилением аутофагии, а повышение – с ее подавлением [2]. Например, p300 опосредует вызванное активацией mTORC1 подавление аутофагии, связанное с голоданием, и активирует клеточный липогенез [45]. Механически активация p300 обусловлена его фосфорилированием с помощью mTORC1, которое предотвращает связывание каталитического домена HAT с ингибирующим доменом RING, устраняя тем самым внутримолекулярное подавление активности p300 [45]. Однако в in vitro исследованиях установлено, что в ответ на цитотоксическое воздействие арсенидом сигнальный путь IKKα/CHK1/p300/CBP/p53 важен для активации аутофагии [32].

Несмотря на то, что CBP/p300 способствуют старению за счет уменьшения аутофагии в периферических тканях, ацетилирование гистонов на промоторе нейропротекторных генов, включая гены-мишени фактора транскрипции EB (TFEB), приводит к усилению биогенеза лизосом и аутофагии и, напротив, способствует долголетию [2]. Возможно, аналогичный механизм лежит в основе положительного влияния сверхэкспрессии nej в нервной системе на ПЖ и устойчивость к протеотоксическому воздействию. В исследовании, проведенном на клетках студенистого ядра, выделенных из межпозвонковых дисков с возрастной дегенерацией, обнаружено, что активация p300 способствует пролиферации и аутофагии, но ингибирует апоптоз через сигнальный путь FOXO3/SIRT1 [46]. С другой стороны, на in vitro и in vivo моделях таупатии показано, что гиперактивация p300/CBP блокирует поток аутофагии и увеличивает секрецию тау-белка в нейронах, а ингибирование p300/CBP оказывает противоположный эффект, уменьшая распространение тау-белка [47].

Роль CBP-1 как важного регулятора митохондриального ответа на “развернутые” белки (UPRmt) и митохондриального стресс-индуцированного иммунного ответа показана в исследованиях на С. elegans. Ацетилирование гистонов с помощью CBP-1 в сочетании с их деметилированием ферментами JMJD-1.2/JMJD-3.1 индуцирует транскрипцию широкого спектра генов, необходимых для восстановления работы митохондрий в условиях стресса [11, 48]. Уровни транскриптов CBP/p300 положительно коррелируют с уровнями транскриптов генов UPRmt и долголетием в популяциях мышей и у человека. Ингибирование CBP/p300 нарушает работу механизма UPRmt, в то время как принудительной экспрессии p300 достаточно для его активации в клетках млекопитающих [11, 48].

Также ацетилтрансфераза, кодируемая геном nej D. melanogaster, сопряжена с димером CLOCK/CYCLE и является неотъемлемым компонентом циркадных часов, выполняющим регуляторные функции, связанные с транскрипцией, ассоциированной с осциллятором. При этом усиление экспрессии nej связано с потерей поведенческих и молекулярных ритмов [49].

Таким образом, CBP/p300 и его ортолог у D. melanogaster, кодируемый геном nej, способны действовать разными путями как способствующими долгожительству, так и усиливающими старение. Более того, известно, что активность CBP/p300 осуществляется во взаимодействии с рецептором эстрогена и гормональная регуляция CBP/p300 оказывает влияние на все мишени данных ацетилтрансфераз [50]. Для понимания и предсказания эффектов активации CBP/p300 на ПЖ требуется проведение детальных исследований с учетом максимального количества возможных механизмов.

CBP/p300 часто описывают как фактор, способствующий клеточному старению за счет образования гиперацетилированного хроматина и активных энхансерных элементов в некодирующих областях генома [8]. Ингибирование p300 лежит в основе геропротекторного действия спермидина [12] и нордигидрогваяретовой кислоты [51]. Также фармакологические ингибиторы CBP/P300 облегчают течение радиационно-индуцированного желудочно-кишечного синдрома, способствуя восстановлению стволовых клеток и крипт кишечника путем задержки клеточного цикла [52].

Тем не менее, в нашей работе РНК-интерференция гена nej в кишечнике и жировом теле D. melanogaster преимущественно снижала медианную ПЖ мух вне зависимости от пола и использованных UAS-конструкций. Однако нокдаун nej в нервной системе самок продлевал жизнь при локализации UAS-конструкции на X-хромосоме (а не на второй хромосоме), что указывает на критичность положения трансгена, по-видимому, обусловленную состоянием хроматина [53]. В то же время существует вероятность того, что наблюдаемый положительный результат может быть обусловлен действием мифепристона [54].

Полученные данные в целом согласуются с результатами [55], согласно которым инактивация CBP/p300 с помощью РНК-интерференции значительно уменьшает ПЖ тлей Acyrthosiphon pisum, ускоряет их старение, снижает число потомков и укорачивает репродуктивную фазу. На это же указывают результаты изучения C. elegans с мутацией cbp-1 [37], а также с повсеместной, а в некоторых случаях тканеспецифичной РНК-интерференцией cbp-1 (специфичной для нервной системы, кишечника и зародышевой линии) [56]. При этом описан эффект удвоения ПЖ у нематод (в аксенической культуре), критическую роль в котором играет активность cbp-1, действующая через механизмы нейропептидной регуляции в ГАМКергических нейронах. Нокдаун cbp-1 в нервной системе препятствовал положительному влиянию ограничения питания [56].

Примечательно также, что мутации в структуре домена CH1 ацетилтрансфераз CBP и p300 приводят к значительному снижению массы тела у мышей CBP∆CH1/∆CH1 и p300∆CH1/∆CH1 и повышенной чувствительности к инсулину [57]. p300/CBP является ключевым регулятором энергетического обмена в печени (у дрозофилы аналогом печени является жировое тело), в том числе, липогенеза, экспорта липидов, глюконеогенеза [58]. На ключевую роль в координации баланса между анаболизмом и катаболизмом на клеточном уровне играет путь mTORC1/p300 [45]. Следовательно, семейство транскрипционных регуляторов p300/CBP может влиять на контроль ПЖ и старение, действуя через энергетический гомеостаз. Кроме того, нокаут гена p300 S89A негативно сказывался на состоянии кишечника у мышей, способствовал изменению состава микробиоты и иммунных реакций, приводил к изменениям в метаболических сигнальных путях [59].

Отметим, что наиболее интересные данные получены нами при сверхактивации и нокдауне гена nej в нервной системе. Критическую роль в проявлении их эффектов (помимо прочих факторов) сыграл тип клеток нервной системы, в котором менялась активность nej; стадия жизненного цикла, на которой работал драйвер; локализация UAS-конструкции. CBP/p300 определяют развитие нервной системы, регуляцию транскрипции и пластичности в постмитотических нейронах [60]. У дрозофилы белок p300 также идентифицирован как важный регулятор синаптического возбуждения через модуляцию пути Pum/Mef2 [61]. Полученные нами результаты и опубликованные данные [60, 61] показывают, что в нервной системе семейство CBP/p300 ацетилтрансфераз действуют через сеть механизмов, которые могут как способствовать долголетию, так и снижать ПЖ. Белки CBP/p300 можно рассматривать в качестве мишени для геропротекторных вмешательств, направленных специфично на нервную систему, но требуется четкая настройка их экспрессии с учетом возможных негативных последствий.

Известно, что ацетилтрансферазы CBP/p300 вовлечены в патогенез таупатий, включая болезнь Альцгеймера. Гиперактивация CBP/p300 усиливает секрецию тау в результате блокирования аутофагии [47]. Накопление β-амилоида (Aβ) мешает активности белка CREB (с которым связываются коактиваторы CBP/p300), важного для формирования памяти. Вирусная доставка CBP в головной мозг приводит к восстановлению функции CREB, улучшает обучаемость и снижает дефицит памяти у мышей, используемых в качестве модели болезни Альцгеймера. Примечательно, что такое улучшение наступает без изменения концентрации пептида Aβ и тау-белка, при этом оно связано с повышенным уровнем нейротрофического фактора головного мозга [62]. Индуцированная Aβ деградация BMAL1 (белок, подобный ядерному транслокатору AHR) и CBP приводит к нарушению циркадного ритма при болезни Альцгеймера [63]. Кроме того, CBP-1 участвует в снижении агрегации β-амилоида и увеличении ПЖ у C. elegans [11].

Важно отметить, что CBP/p300 вносит вклад в процесс старения, участвуя в патогенезе ряда других возрастзависимых заболеваний [2]. Изменение активности этих ацетилтрансфераз, причем как в сторону подавления, так и в сторону гиперактивации, может привести к возникновению различных типов рака [64‒67]. Например, мутации CBP находят при синдроме Рубинштейна‒Тайби, который характеризуется повышенной предрасположенностью к злокачественным новообразованиям уже в детском возрасте [64]. Повышенная активность CBP/p300 усиливает активацию андрогеновых и эстрогеновых рецепторов, за счет чего способствует развитию рака предстательной железы или молочной железы [66]. Нарушение регуляции CBP/р300 вызывает изменение профилей экспрессии генов, вовлеченных в гипертрофические и фиброгенные процессы в миокарде, что приводит к развитию гипертрофии сердца, инфаркта миокарда, сердечной недостаточности, диабетической кардиомиопатии [68]. С другой стороны, подавление CBP/p300 у млекопитающих может быть связано с метаболическими расстройствами ‒ от чрезмерного снижения жировых запасов и массы тела [57] до развития ожирения [2]. Применение ингибиторов данных ацетилтрансфераз подавляет патологическое изменение органов при сахарном диабете, например, посредством регуляции продукции активных форм кислорода и снижения воспаления [69].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На плодовой мушке D. melanogaster нами впервые проанализировано влияние сверхэкспрессии и нокдауна гена nejire (nej), кодирующего ортолог белков CBP/p300 человека, в различных тканях на ПЖ. В зависимости от использованного драйвера и типа ткани, в которой индуцировали nej, а также от половой принадлежности мух, активация nej оказала как положительное, так и отрицательное влияние на ПЖ. Эффект увеличения ПЖ наблюдали у самок при кондиционной сверхэкспрессии nej в кишечнике и конститутивной сверхэкспрессии nej в нервной системе. В то же время нокдаун nej в большинстве вариантов эксперимента снижал ПЖ D. melanogaster.

Анализ опубликованных данных позволил нам выявить комплексную связь CBP/p300 с механизмами, вовлеченными в регуляцию ПЖ и старения организма, а также обозначить вклад дерегуляции этих ацетилтрансфераз в развитие возрастных заболеваний человека. Дальнейшее изучение ортологов, относящихся к семейству CBP/p300 (включая белок, кодируемый nej), перспективно с точки зрения его использования в качестве фармакологической мишени. Однако необходимо учитывать, что такое воздействие требует тонкой настройки и детального изучения вовлеченных механизмов, поскольку для положительного эффекта может потребоваться подавление либо стимуляция активности ацетилтрансфераз в конкретных тканях. Так, в настоящее время достигнут прогресс в разработке ингибиторов CBP/p300 применительно к лечению онкологических, воспалительных, сердечно-сосудистых, аутоиммунных заболеваний человека [67, 70, 71]. При этом активация ацетилирования белков может требоваться для терапии нейродегенеративных расстройств [72, 73].

Авторы выражают благодарность Институту биологии ФИЦ Коми НЦ УрО РАН за предоставленную коллекцию лабораторных линий плодовых мушек Drosophila.

Исследования выполнены в рамках государственного задания Института биологии ФИЦ Коми НЦ УрО РАН по теме “Генетические и функциональные исследования эффектов геропротекторных интервенций на модели Drosophila melanogaster” (№ 122040600022-1).

В работе соблюдены все применимые международные, национальные и/или институциональные принципы ухода и обращения с животными.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Список литературы

  1. Прошкина Е.Н., Соловьёв И.А., Шапошников М.В., Москалев А.А. 2020. Ключевые молекулярные механизмы старения, биомаркеры и потенциальные интервенции. Молекуляр. биология. 54(6), 883‒921.

  2. Bradshaw P.C. (2021) Acetyl-CoA metabolism and histone acetylation in the regulation of aging and lifespan. Antioxidants (Basel). 10, 572.

  3. Santos-Rosa H., Valls E., Kouzarides T., Martinez-Balbas M. (2003) Mechanisms of P/CAF auto-acetylation. Nucl. Acids Res. 31, 4285–4292.

  4. Dutto I., Scalera C., Prosperi E. (2018) CREBBP and p300 lysine acetyl transferases in the DNA damage response. Cell Mol. Life Sci. 75, 1325–1338.

  5. Xu Y., Wan W. (2023) Acetylation in the regulation of autophagy. Autophagy. 19, 379–387.

  6. Goodman R.H., Smolik S. (2000) CBP/p300 in cell growth, transformation, and development. Genes Dev. 14, 1553–1577.

  7. Xue Y., Wen H., Shi X. (2018) CBP/p300: intramolecular and intermolecular regulations. Front. Biol. 13, 168–179.

  8. Sen P., Lan Y., Li C.Y., Sidoli S., Donahue G., Dou Z., Frederick B., Chen Q., Luense L.J., Garcia B.A., Dang W., Johnson F.B., Adams P.D., Schultz D.C., Berger S.L. (2019) Histone acetyltransferase p300 induces de novo super-enhancers to drive cellular senescence. Mol. Cell. 73, 684–698 e688.

  9. Vaziri H., West M.D., Allsopp R.C., Davison T.S., Wu Y.S., Arrowsmith C.H., Poirier G.G., Benchimol S. (1997) ATM-dependent telomere loss in aging human diploid fibroblasts and DNA damage lead to the post-translational activation of p53 protein involving poly(ADP-ribose) polymerase. EMBO J. 16, 6018–6033.

  10. Huang W.S., Kuo Y.H., Kuo H.C., Hsieh M.C., Huang C.Y., Lee K.C., Lee K.F., Shen C.H., Tung S.Y., Teng C.C. (2017) CIL-102-Induced cell cycle arrest and apoptosis in colorectal cancer cells via upregulation of p21 and GADD45. PLoS One. 12, e0168989.

  11. Li T.Y., Sleiman M.B., Li H., Gao A.W., Mottis A., Bachmann A.M., El Alam G., Li X., Goeminne L.J.E., Schoonjans K., Auwerx J. (2021) The transcriptional coactivator CBP/p300 is an evolutionarily conserved node that promotes longevity in response to mitochondrial stress. Nat. Aging. 1, 165–178.

  12. Madeo F., Carmona-Gutierrez D., Kepp O., Kroemer G. (2018) Spermidine delays aging in humans. Aging (Albany NY). 10, 2209–2211.

  13. Marek K.W., Ng N., Fetter R., Smolik S., Goodman C.S., Davis G.W. (2000) A genetic analysis of synaptic development: pre- and postsynaptic dCBP control transmitter release at the Drosophila NMJ. Neuron. 25, 537–547.

  14. Smolik S., Jones K. (2007) Drosophila dCBP is involved in establishing the DNA replication checkpoint. Mol. Cell. Biol. 27, 135–146.

  15. Taylor J.P., Taye A.A., Campbell C., Kazemi-Esfarjani P., Fischbeck K.H., Min K.T. (2003) Aberrant histone acetylation, altered transcription, and retinal degeneration in a Drosophila model of polyglutamine disease are rescued by CREB-binding protein. Genes Dev. 17, 1463–1468.

  16. Tseng A.S., Hariharan I.K. (2002) An overexpression screen in Drosophila for genes that restrict growth or cell-cycle progression in the developing eye. Genetics. 162, 229–243.

  17. Osterwalder T., Yoon K.S., White B.H., Keshishian H. (2001) A conditional tissue-specific transgene expression system using inducible GAL4. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 12596–12601.

  18. Duffy J.B. (2002) GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist’s Swiss army knife. Genesis. 34, 1–15.

  19. Landis G.N., Salomon M.P., Keroles D., Brookes N., Sekimura T., Tower J. (2015) The progesterone antagonist mifepristone/RU486 blocks the negative effect on life span caused by mating in female Drosophila. Aging (Albany NY). 7, 53–69.

  20. Xia B., de Belle J.S. (2016) Transgenerational programming of longevity and reproduction by post-eclosion dietary manipulation in Drosophila. Aging (Albany NY). 8, 1115–1134.

  21. Fleming T.R., O’Fallon J.R., O’Brien P.C., Harrington D.P. (1980) Modified Kolmogorov–Smirnov test procedures with application to arbitrarily right-censored data. Biometrics. 36, 607–625.

  22. Mantel N. (1966) Evaluation of survival data and two new rank order statistics arising in its consideration. Cancer Chemother. Rep. 50, 163–170.

  23. Martinez R.L.M.C., Naranjo J.D. (2012) A pretest for choosing between logrank and wilcoxon tests in the two-sample problem. Metron. 68, 111–125.

  24. Wang C., Li Q., Redden D.T., Weindruch R., Allison D.B. (2004) Statistical methods for testing effects on “maximum lifespan”. Mech. Ageing Dev. 125, 629–632.

  25. Han S.K., Lee D., Lee H., Kim D., Son H.G., Yang J.S., Lee S.V., Kim S. (2016) OASIS 2: online application for survival analysis 2 with features for the analysis of maximal lifespan and healthspan in aging research. Oncotarget. 7, 56147–56152.

  26. Kruskal W.H., Wallis W.A. (1952) Use of ranks in one-criterion variance analysis. J. Am. Stat. Assoc. 47, 583–621.

  27. Ganner A., Gerber J., Ziegler A.K., Li Y., Kandzia J., Matulenski T., Kreis S., Breves G., Klein M., Walz G., Neumann-Haefelin E. (2019) CBP-1/p300 acetyltransferase regulates SKN-1/Nrf cellular levels, nuclear localization, and activity in C. elegans. Exp. Gerontol. 126, 110690.

  28. Wang D., Kon N., Lasso G., Jiang L., Leng W., Zhu W.G., Qin J., Honig B., Gu W. (2016) Acetylation-regulated interaction between p53 and SET reveals a widespread regulatory mode. Nature. 538, 118–122.

  29. Boija A., Mahat D.B., Zare A., Holmqvist P.H., Philip P., Meyers D.J., Cole P.A., Lis J.T., Stenberg P., Mannervik M. (2017) CBP regulates recruitment and release of promoter-proximal RNA polymerase II. Mol. Cell. 68, 491–503.e495.

  30. Li Y., Zhong H., Wu M., Tan B., Zhao L., Yi Q., Xu X., Pan H., Bi Y., Yang K. (2019) Decline of p300 contributes to cell senescence and growth inhibition of hUC-MSCs through p53/p21 signaling pathway. Biochem. Biophys. Res. Commun. 515, 24–30.

  31. Ghosh R., Kaypee S., Shasmal M., Kundu T.K., Roy S., Sengupta J. (2019) Tumor suppressor p53-mediated structural reorganization of the transcriptional coactivator p300. Biochemistry. 58, 3434–3443.

  32. Xu X., Zhang C., Xu H., Wu L., Hu M., Song L. (2020) Autophagic feedback-mediated degradation of IKKα requires CHK1- and p300/CBP-dependent acetylation of p53. J. Cell Sci. 133, jcs246868.

  33. Wondisford A.R., Xiong L., Chang E., Meng S., Meyers D.J., Li M., Cole P.A., He L. (2014) Control of Foxo1 gene expression by co-activator P300. J. Biol. Chem. 289, 4326–4333.

  34. Wu J., Jiang Z., Zhang H., Liang W., Huang W., Zhang H., Li Y., Wang Z., Wang J., Jia Y., Liu B., Wu H. (2018) Sodium butyrate attenuates diabetes-induced aortic endothelial dysfunction via P300-mediated transcriptional activation of Nrf2. Free Radic. Biol. Med. 124, 454–465.

  35. Xu D., Zalmas L.P., La Thangue N.B. (2008) A transcription cofactor required for the heat-shock response. EMBO Rep. 9, 662–669.

  36. Ruas J.L., Berchner-Pfannschmidt U., Malik S., Gradin K., Fandrey J., Roeder R.G., Pereira T., Poellinger L. (2010) Complex regulation of the transactivation function of hypoxia-inducible factor-1 alpha by direct interaction with two distinct domains of the CREB-binding protein/p300. J. Biol. Chem. 285, 2601–2609.

  37. Barrett L.N., Westerheide S.D. (2022) The CBP-1/p300 lysine acetyltransferase regulates the heat shock response in C. elegans. Front. Aging. 3, 861761.

  38. Hunt G., Boija A., Mannervik M. (2022) p300/CBP sustains Polycomb silencing by non-enzymatic functions. Mol. Cell. 82, 3580–3597 e3589.

  39. Siebold A.P., Banerjee R., Tie F., Kiss D.L., Moskowitz J., Harte P.J. (2010) Polycomb repressive complex 2 and Trithorax modulate Drosophila longevity and stress resistance. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 169–174.

  40. Dasari V., Srivastava S., Khan S., Mishra R.K. (2018) Epigenetic factors Polycomb (Pc) and Suppressor of zeste (Su(z)2) negatively regulate longevity in Drosophila melanogaster. Biogerontology. 19, 33–45.

  41. Sharma S., Poetz F., Bruer M., Ly-Hartig T.B., Schott J., Séraphin B., Stoecklin G. (2016) Acetylation-dependent control of global Poly(A) RNA degradation by CBP/p300 and HDAC1/2. Mol. Cell. 63, 927–938.

  42. Ansari M.S.Z., Stagni V., Iuzzolino A., Rotili D., Mai A., Del Bufalo D., Lavia P., Degrassi F., Trisciuoglio D. (2023) Pharmacological targeting of CBP/p300 drives a redox/autophagy axis leading to senescence-induced growth arrest in non-small cell lung cancer cells. Cancer Gene Ther. 30, 124–136.

  43. Solovev I., Shaposhnikov M., Kudryavtseva A., Moskalev A. (2018) Drosophila melanogaster as a model for studying the epigenetic basis of aging. In: Epigenetics of Aging and Longevity. 4. Eds Moskalev A., Vaiserman A.M. Boston: Acad. Press, pp. 293–307.

  44. Lee I.H., Finkel T. (2009) Regulation of autophagy by the p300 acetyltransferase. J. Biol. Chem. 284, 6322–6328.

  45. Wan W., You Z., Xu Y., Zhou L., Guan Z., Peng C., Wong C.C.L., Su H., Zhou T., Xia H., Liu W. (2017) mTORC1 phosphorylates acetyltransferase p300 to regulate autophagy and lipogenesis. Mol. Cell. 68, 323–335.e326.

  46. Hao Y., Ren Z., Yu L., Zhu G., Zhang P., Zhu J., Cao S. (2022) p300 arrests intervertebral disc degeneration by regulating the FOXO3/Sirt1/Wnt/β-catenin axis. Aging Cell. 21, e13677.

  47. Chen X., Li Y., Wang C., Tang Y., Mok S.A., Tsai R.M., Rojas J.C., Karydas A., Miller B.L., Boxer A.L., Gestwicki J.E., Arkin M., Cuervo A.M., Gan L. (2020) Promoting tau secretion and propagation by hyperactive p300/CBP via autophagy-lysosomal pathway in tauopathy. Mol. Neurodegener. 15, 2.

  48. Auwerx J., Li T.Y. (2020) A conserved role of CBP/p300 in mitochondrial stress response and longevity. FASEB J. 34, 1.https://doi.org/10.1096/fasebj.2020.34.s1.00128

  49. Hung H.C., Maurer C., Kay S.A., Weber F. (2007) Circadian transcription depends on limiting amounts of the transcription co-activator nejire/CBP. J. Biol. Chem. 282, 31349–31357.

  50. Lakshmanan M.D., Shaheer K. (2020) Endocrine disrupting chemicals may deregulate DNA repair through estrogen receptor mediated seizing of CBP/p300 acetylase. J. Endocrinol. Invest. 43, 1189–1196.

  51. Tezil T., Chamoli M., Ng C.P., Simon R.P., Butler V.J., Jung M., Andersen J., Kao A.W., Verdin E. (2019) Lifespan-increasing drug nordihydroguaiaretic acid inhibits p300 and activates autophagy. NPJ Aging Mech. Dis. 5, 7.

  52. Rao X., Tang P., Li Y., Fu G., Chen S., Xu X., Zhou Y., Li X., Zhang L., Mo S., Cai S., Peng J., Zhang Z., Gao J., Hua G. (2021) CBP/P300 Inhibitors mitigate radiation-induced GI syndrome by promoting intestinal stem cell-mediated crypt regeneration. Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 110, 1210–1221.

  53. McCarroll S.A., Murphy C.T., Zou S., Pletcher S.D., Chin C.S., Jan Y.N., Kenyon C., Bargmann C.I., Li H. (2004) Comparing genomic expression patterns across species identifies shared transcriptional profile in aging. Nat. Genet. 36, 197–204.

  54. Landis G.N., Hilsabeck T.A.U., Bell H.S., Ronnen-Oron T., Wang L., Doherty D.V., Tejawinata F.I., Erickson K., Vu W., Promislow D.E.L., Kapahi P., Tower J. (2021) Mifepristone increases life span of virgin female Drosophila on regular and high-fat diet without reducing food intake. Front. Genet. 12, 751647.

  55. Kirfel P., Vilcinskas A., Skaljac M. (2020) Lysine acetyltransferase p300/CBP plays an important role in reproduction, embryogenesis and longevity of the pea aphid Acyrthosiphon pisum. Insects. 11, 265.

  56. Cai H., Dhondt I., Vandemeulebroucke L., Vlaeminck C., Rasulova M., Braeckman B.P. (2019) CBP-1 acts in GABAergic neurons to double life span in axenically cultured Caenorhabditis elegans. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 74, 1198–1205.

  57. Bedford D.C., Kasper L.H., Wang R., Chang Y., Green D.R., Brindle P.K. (2011) Disrupting the CH1 domain structure in the acetyltransferases CBP and p300 results in lean mice with increased metabolic control. Cell Metab. 14, 219–230.

  58. Yao W., Wang T., Huang F. (2018) p300/CBP as a key nutritional sensor for hepatic energy homeostasis and liver fibrosis. Biomed. Res. Int. 2018, 8168791.

  59. Lai K.K.Y., Hu X., Chosa K., Nguyen C., Lin D.P., Lai K.K., Kato N., Higuchi Y., Highlander S.K., Melendez E., Eriguchi Y., Fueger P.T., Ouellette A.J., Chimge N.O., Ono M., Kahn M. (2021) P300 serine 89: a critical signaling integrator and its effects on intestinal homeostasis and repair. Cancers (Basel). 13(6), 1288.

  60. Lipinski M., Del Blanco B., Barco A. (2019) CBP/p300 in brain development and plasticity: disentangling the KAT’s cradle. Curr. Opin. Neurobiol. 59, 1–8.

  61. Lin W.H., Baines R.A. (2019) Myocyte enhancer factor-2 and p300 interact to regulate the expression of homeostatic regulator Pumilio in Drosophila. Eur. J. Neurosci. 50, 1727–1740.

  62. Caccamo A., Maldonado M.A., Bokov A.F., Majumder S., Oddo S. (2010) CBP gene transfer increases BDNF levels and ameliorates learning and memory deficits in a mouse model of Alzheimer’s disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 22687–22692.

  63. Song H., Moon M., Choe H.K., Han D.H., Jang C., Kim A., Cho S., Kim K., Mook-Jung I. (2015) Aβ-Induced degradation of BMAL1 and CBP leads to circadian rhythm disruption in Alzheimer’s disease. Mol. Neurodegener. 10, 13.

  64. Iyer N.G., Özdag H., Caldas C. (2004) p300/CBP and cancer. Oncogene. 23, 4225–4231.

  65. Wang F., Marshall C.B., Ikura M. (2013) Transcriptional/epigenetic regulator CBP/p300 in tumorigenesis: structural and functional versatility in target recognition. Cell. Mol. Life Sci. 70, 3989–4008.

  66. Waddell A.R., Huang H., Liao D. (2021) CBP/p300: critical co-activators for nuclear steroid hormone receptors and emerging therapeutic targets in prostate and breast cancers. Cancers (Basel). 13(12), 2872.

  67. Chen Q., Yang B., Liu X., Zhang X.D., Zhang L., Liu T. (2022) Histone acetyltransferases CBP/p300 in tumorigenesis and CBP/p300 inhibitors as promising novel anticancer agents. Theranostics. 12, 4935–4948.

  68. Ghosh A.K. (2020) p300 in cardiac development and accelerated cardiac aging. Aging Dis. 11, 916–926.

  69. Lazar A.G., Vlad M.L., Manea A., Simionescu M., Manea S.A. (2021) Activated histone acetyltransferase p300/CBP-related signalling pathways mediate up-regulation of NADPH oxidase, inflammation, and fibrosis in diabetic kidney. Antioxidants (Basel). 10, 1356.

  70. Xiong Y., Zhang M., Li Y. (2020) Recent advances in the development of CBP/p300 bromodomain inhibitors. Curr. Med. Chem. 27, 5583–5598.

  71. He Z.X., Wei B.F., Zhang X., Gong Y.P., Ma L.Y., Zhao W. (2021) Current development of CBP/p300 inhibitors in the last decade. Eur. J. Med. Chem. 209, 112861.

  72. Valor L.M., Viosca J., Lopez-Atalaya J.P., Barco A. (2013) Lysine acetyltransferases CBP and p300 as therapeutic targets in cognitive and neurodegenerative disorders. Curr. Pharm. Des. 19, 5051–5064.

  73. Singh A.K., Neo S.H., Liwang C., Pang K.K.L., Leng J.C.K., Sinha S.H., Shetty M.S., Vasudevan M., Rao V.J., Joshi I., Eswaramoorthy M., Pavon M.V., Sheila A.R., Navakkode S., Kundu T.K., Sajikumar S. (2022) Glucose derived carbon nanosphere (CSP) conjugated TTK21, an activator of the histone acetyltransferases CBP/p300, ameliorates amyloid-beta 1–42 induced deficits in plasticity and associativity in hippocampal CA1 pyramidal neurons. Aging Cell. 21, e13675.

Дополнительные материалы

скачать ESM.zip
Приложение 1.
Таблица S1. Влияние сверхэкспрессии гена nej в различных тканях на выживаемость дрозофил в неблагоприятных условиях

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Молекулярная биология

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал