Молекулярная биология. T. 57, Номер 5, 2023

  1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Молекулярная биология
  4. T. 57, № 5, 2023

Молекулярная биология, 2023, T. 57, № 5, стр. 863-872

Неструктурный белок 3 вируса гепатита С повышает секрецию интерлейкина-1бета в клетках HEK293T c реконструированной инфламмасомой NLRP3

А. А. Латанова a, *, К. К. Тучинская b, Е. С. Стародубова a, В. Л. Карпов a

a Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук
119991 Москва, Россия

b Федеральный научный центр исследований и разработки иммунобиологических препаратов им. М.П. Чумакова Российской академии наук (Институт полиомиелита), пос. Института полиомиелита, поселение Московский
108811 Москва, Россия

* E-mail: aalatanova@gmail.com

Поступила в редакцию 02.03.2023
После доработки 30.03.2023
Принята к публикации 31.03.2023

Полный текст (PDF)

Аннотация

Патология заболеваний, вызываемых вирусами семейства Flaviviridae, во многом определяется развитием системного воспаления. Ключевую роль в запуске воспаления играют цитокины интерлейкин-1бета и интерлейкин-18. Секреция этих цитокинов из клеток в свою очередь индуцируется при активации инфламмасом. В клетках, инфицированных вирусами Flaviviridae, обнаружена активация инфламмасом типа NLRP3 (NLR family pyrin domain-containing 3). Некоторые неструктурные белки этих вирусов способны активировать или ингибировать инфламмасому NLRP3, в том числе, за счет взаимодействия с ее компонентами. В данном исследовании в клетках человека HEK293T реконструирована функциональная инфламмасома NLRP3 и изучено воздействие на нее ряда неструктурных белков отдельных представителей семейства Flaviviridae. В этой модели не обнаружено влияния неструктурных белков NS1 вируса Западного Нила, NS3 вируса гепатита С, NS5 вируса клещевого энцефалита на содержание компонентов инфламмасомы. При этом уровень секреции интерлейкина-1бета в присутствии белков NS1 вируса Западного Нила и NS5 вируса клещевого энцефалита не изменялся, повышаясь в 1.5 раза в присутствии белка NS3 вируса гепатита С. Таким образом, NS3 можно рассматривать как один из факторов активации инфламмасомы NLRP3 и воспалительного патогенеза при хронической инфекции вирусом гепатита С.

Ключевые слова: инфламмасома, NLRP3, интерлейкин-1бета, вирус клещевого энцефалита, вирус гепатита С, вирус Западного Нила, неструктурные белки, Flaviviridae

ВВЕДЕНИЕ

Инфламмасома – это мультибелковый комплекс, активируемый различными факторами, в том числе вирусными инфекциями. Активация инфламмасомы ведет к секреции провоспалительных цитокинов интерлейкинов (ИЛ)-1бета и ИЛ-18, индуцирующих воспалительные реакции. Инфламмасомы локализуются в цитоплазме клеток иммунной системы, некоторых немиелоидных клеток и нейронов [1]. Инфламмасома типа NLRP3 (NLR family pyrin domain-containing 3), изучению которой посвящено большинство работ в этой области, активируется при многих вирусных инфекциях и включает в себя три компонента: сенсор, адаптор ASC (an apoptosis associated speck-like protein containing a CARD) и эффектор – прокаспазу-1 [2, 3]. Сенсор NLRP3 – цитоплазматический белок, состоящий из трех доменов: N-концевого пиринового (PYD), центрального нуклеотидсвязывающего и олигомеризующего (NACHT) и С-концевого лейцин-богатого домена (LRR) [4, 5]. Адаптор ASC состоит из PYD- и CARD-доменов, а эффекторная прокаспаза-1 – из каталитического домена и CARD [3]. Сборка инфламмасомы происходит после распознавания сенсором NLRP3 активирующих сигналов за счет взаимодействия однотипных доменов ее компонентов (PYD-PYD и CARD-CARD) [6, 7]. Сборка активирует инфламмасому, происходит автокаталитическое расщепление прокаспазы-1 до ее активной формы, которая процессирует неактивные предшественники ИЛ-1бета (про-ИЛ-1бета) и ИЛ-18 (про-ИЛ-18) до активных форм [8–10]. Кроме того, каспаза-1 разрезает предшественник белка гасдермина D с образованием его активной формы, которая встраивается в мембрану клетки и образует в ней поры. Это способствует выбросу образовавшихся активных ИЛ-1бета и ИЛ-18 из клетки, а также пироптозу – одной из форм программируемой клеточной смерти [11, 12]. Секретированные ИЛ-1бета и ИЛ-18 запускают каскад воспалительных реакций, в частности, привлекают нейтрофилы к сайту инфекции, изменяют проницаемость сосудов и пр. [13, 14].

Для запуска работы инфламмасомы необходимы два сигнала – праймирующий и активирующий [15, 16]. Праймирующим сигналом являются различные PAMP/DAMP (Pathogen-associated molecular pattern/Damage-associated molecular pattern), которые узнаются Toll-подобными рецепторами (TLR) и рецепторами цитокинов. Праймирование активирует NF-kappaB-зависимые каскады реакций, запуская экспрессию компонентов инфламмасомы – NLRP3, прокаспазы-1, а также про-ИЛ-1бета и про-ИЛ-18 [17]. PAMP/DAMP, разрушение лизосом, митохондриальный стресс и стресс эндоплазматического ретикулума служат активирующими сигналами, которые индуцируют сборку инфламмасомы в комплекс и образование активной каспазы-1 [18, 19].

Активация инфламмасом выявлена при инфекциях, вызываемых вирусами семейства Flaviviridae, включая вирусы японского энцефалита, денге, Зика, Западного Нила (ВЗН) и гепатита С (ВГС) [20]. При этом вирусные белки могут напрямую участвовать в активации инфламмасом. Так, белок NS5 вируса Зика может усиливать сборку инфламмасомы NLRP3, взаимодействуя с NLRP3 посредством РНК-зависимого РНК-полимеразного домена [21, 22], а также, возможно, за счет индукции окислительного стресса [21]. Сборку инфламмасомы NLRP3 может усиливать белок NS1 вируса Зика, который стабилизирует каспазу-1, подавляя ее деградацию [23]. Показано также, что вирус Зика, напротив, ингибирует инфламмасому NLRP3 за счет действия его протеазы NS3, индуцирующей деградацию сенсора NLRP3, возможно, посредством его разрезания [24]. Белки NS2A и NS2B вируса денге также способны усиливать активацию NLRP3, действуя как виропорины [25].

Нами изучено влияние отдельных неструктурных белков трех вирусов – ВЗН, ВГС и вируса клещевого энцефалита (ВКЭ) – на активацию инфламмасомы NLRP3. К настоящему моменту известно, что инфекция ВЗН активирует инфламмасому NLRP3, что совместно с ответом интерферона типа I (ИФН I) способствует супрессии репликации ВЗН в нейронах [26]. Инфекция ВГС также индуцирует NLRP3-зависимую секрецию ИЛ-1бета/ИЛ-18 в макрофагах печени [27–29]. Об активации инфламмасомы при инфекции ВКЭ косвенно свидетельствует обнаружение ИЛ-1бета в сыворотках пациентов [30], однако факторы активации неизвестны. Мы выбрали неструктурные белки NS1 ВЗН, NS3 ВГС, NS5 ВКЭ, поскольку эти белки других флавивирусов участвуют в активации/ингибировании инфламмасомы NLRP3 [21–24]. В модели с реконструированной инфламмасомой NLRP3 клетки HEK293T были котрансфицированы плазмидами, кодирующими выбранные вирусные белки. Обнаружено, что только экспрессия NS3 ВГС повышала уровень секреции ИЛ-1бета клетками HEK293T, т.е., по всей видимости, приводила к усилению активации инфламмасомы NLRP3. Таким образом, протеазу NS3 можно рассматривать как один из факторов воспаления при инфекции ВГС. Эти данные позволят лучше понять механизмы хронического воспаления при ВГС и могут использоваться в целенаправленной разработке противовирусных препаратов.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Получение плазмид, кодирующих неструктурные белки вирусов семейства Flaviviridae. На первом этапе работы получены плазмиды, кодирующие 3×Flag-метку. Нуклеотидная последовательность 3×Flag собрана путем отжига длинных праймеров при прогреве (95°С, 5 с) с последующей инкубацией при постепенном снижении температуры в диапазоне 95–37°С. Праймеры содержали нуклеотидную последовательность 3×Flag (Addgene #101178), а также, в зависимости от N- или С-концевого положения 3×Flag, последовательность Козак (GGC-АСС-ATG-G) или стоп-кодон, соответственно, и нуклеотидные последовательности сайтов рестрикции BamHI/ApaI, KpnI/NotI, PstI/ApaI. После отжига достраивали выступающие липкие 5'-концы c помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I (“Сибэнзим”, Россия) при 37°С в течение 1 ч. Полученные 3×Flag-фрагменты клонировали в плазмиду pVax (“Invitrogen”, США) по соответствующим сайтам и получили плазмиды pVax-3×Flag, кодирующие N- и С-концевые 3×Flag-метки.

Нуклеотидные последовательности, кодирующие NS1 ВЗН (штамм HP-94, линия 1) и NS5 ВКЭ (штамм ЭК-328, сибирский подтип), получены на основе кДНК этих вирусов. Вирусную РНК выделяли с помощью Trireagent LS (“Sigma-Aldrich”, США) с последующей экстракцией хлороформом. Обратную транскрипцию проводили с использованием специфических праймеров: ВЗН – 5'-TTCTCCTGGTTGGTCCATCTCG-3'; ВКЭ – 5'-AGCGGGTGTTTTTCCGAGTC-3' и набора Superscript III Reverse Transcriptase (“Invitrogen”). Плазмиду pCMV, несущую ген NS3 ВГС (изолят 1b линия 274933RU), использовали для амплификации последовательности, кодирующей белок NS3 ВГС [31]. ПЦР со специфическими праймерами проводили на кДНК ВКЭ и ВЗН, а также на плазмиде pCMV, кодирующей NS3 ВГС. Полученные фрагменты клонировали в сконструированные на первом этапе плазмиды pVax-3×Flag: NS1 ВЗН – по сайтам NheI/BamHI и NS5 – по сайтам NheI/PstI в плазмиды, кодирующие С-концевой 3×Flag, NS3 – по сайтам N-otI/XbaI в плазмиду, кодирующую N-концевой 3×Flag. Присутствие соответствующих вставок подтверждали секвенированием со специфическими праймерами. Полученные плазмиды выделяли с помощью набора QIAprep Spin Miniprep kit (“QIAGEN”, Нидерланды).

Реконструкция инфламмасомы NLRP3 в клетках HEK293T. Клетки HEK293T (CRL-2539™, ATCC) культивировали в среде DMEM (“Панэко”, Россия) c добавлением 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (“Hyclone Cytiva”, CША) и пенициллином/стрептомицином (100 мкг/мл) при 37°C в атмосфере 5% CO2. Для реконструкции функциональной инфламмасомы NLRP3 клетки рассевали в 6/12-луночные планшеты (2 × 105 клеток/мл) и на следующий день проводили котрансфекцию липосомным реагентом Lipofectamine™ LTX (“ThermoFisherScientific”, США) и смесью плазмид, кодирующих компоненты инфламмасомы NLRP3 человека: EGFP-NLRP3 (Addgene #73955), ASC-HA (Addgene #41553), прокаспазу-1-myc (Addgene #41552), а также про-ИЛ-1бета (Addgene #166783) в соотношении (по массе) 2 : 1 : 1 : 6, соответственно, выбранном на основании методик, описанных в [32–35], и равным (по массе) количеством контрольной плазмиды pVax-3×Flag. В экспериментах по оценке влияния неструктурных вирусных белков на функционирование инфламмасомы вместо контрольной плазмиды использовали pVax-3×Flag, кодирующие NS1 ВЗН, NS3 ВГС, NS5 ВКЭ. Через 24 ч проводили смену культуральной жидкости и в часть контрольных образцов, котрансфицированных только плазмидами, кодирующими компоненты инфламмасомы и про-ИЛ-1бета, добавляли активатор инфламмасомы нигерицин (10 мкМ, “Sigma-Aldrich”). Через 1–6 ч после добавления нигерицина собирали культуральную жидкость и получали клеточные лизаты.

Вестерн-блотинг. Клетки HEK293T лизировали в буфере Лэммли (50 мМ трис-HCl рН 6.8, 2% SDS, 10% глицерин, 2% β-меркаптоэтанол, 0.025% бромфеноловый синий). Полученные образцы анализировали электрофорезом в 8–10%-ном ПААГ, белки из геля переносили на мембрану PVDF (“Hybond-P”, США). NLRP3, ASC, активную форму ИЛ-1бета и его предшественника, прокаспазу-1-myc выявляли с использованием специфических антител: моноклональных антител кролика к NLRP3 (1 : 5000, “Abcam”, Великобритания), ASC (1 : 5000, “Abcam”), ИЛ-1бета (1 : 10 000, “Abcam”), поликлональных антител кролика к myc-метке (“Affinity”, Китай), а для детекции неструктурных вирусных белков, конъюгированных с Flag-меткой, использовали моноклональные антитела мыши к Flag (1 : 2500, “Transgen”, Китай). В качестве вторичных антител использовали конъюгированные с пероксидазой хрена антитела козы к иммуноглобулинам кролика и мыши (“Jackson”, США). Иммунные комплексы на мембране выявляли с помощью хемилюминесцентного реагента ECL (“Bio-Rad”) и рентгеновской пленки (“FujiFilm”, Япония), плeнку сканировали, данные обрабатывали в программе ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij). Для контроля равномерности нанесения образцов мембрану окрашивали моноклональными антителами мыши к β-актину (клон AC-74, “Sigma”, США), а затем вторичными конъюгированными с пероксидазой хрена антителами козы к иммуноглобулинам мыши (“Jackson”).

Иммуноферментный анализ. Пробы для проведения иммуноферментного анализа (ИФА) получали, осветляя культуральную жидкость, собранную с котрансфицированных клеток, центрифугированием при 10 000 g в течение 10 мин. Концентрацию ИЛ-1бета в культуральной жидкости измеряли с помощью набора Интерлейкин-1бета-ИФА-БЕСТ (“Вектор-Бест”, Новосибирск) в соответствии с рекомендациями производителя.

Статистический анализ. Уровни синтеза белков и концентраций ИЛ-1бета сравнивали с помощью программы GraphPad Prism 8.4.3 (GraphPad Software, Inc., США). Для сравнения в группах использовали непараметрический тест Краскела–Уоллиса, для попарных сравнений – тест Манна–Уитни. Относительное содержание ИЛ‑1бе-та анализировали с использованием критерия Вилкоксона для одной выборки. Различия считали статистически значимыми при p < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Инфламмасому NLRP3 изучают преимущественно на миелоидных клетках, конститутивно экспрессирующих отдельные компоненты этой инфламмасомы, при этом в ряде случаев используют и немиелоидные клетки [36]. Так, удобной моделью для изучения молекулярных механизмов функционирования инфламмасом in vitro считаются клетки HEK293T [32, 37–39]. Следует отметить, что эффекты, обнаруженные при изучении инфламмасом в миелоидных клетках, воспроизводятся в клетках HEK293T [22, 40]. HEK293T не экспрессируют компоненты инфламмасомы [36], поэтому реконструировать инфламмасому в этих клетках можно путем введения плазмид, кодирующих все ее компоненты. В нашей работе мы использовали эту модель, поскольку она позволяет экспрессировать в клетках вместе с компонентами инфламмасомы и исследуемые вирусные белки. На первом этапе для реконструкции функциональной инфламмасомы NLRP3 клетки котрансфицировали плазмидами, кодирующими три компонента инфламмасомы NLRP3 человека – NLRP3, ASC, прокаспазу-1, а также субстрат каспазы-1 – про-ИЛ-1бета. Среду культивирования клеток заменяли через 24 ч после котрансфекции и к части проб добавляли нигерицин – K+/H+-ионофор [41]. Нигерицин индуцирует выброс ионов калия из клетки [42], что активирует инфламмасому, аутопротеолиз прокаспазы-1 и секрецию ИЛ-1бета. Через 1–6 ч после смены среды собирали культуральные жидкости, осветляли их центрифугированием и получали клеточные лизаты, которые анализировали методом вестерн-блотинга (рис. 1). В культуральных жидкостях измеряли концентрацию активного ИЛ-1бета с помощью набора для ИФА (рис. 2). Вестерн-блотинг клеточных лизатов с коммерческими антителами к компонентам инфламмасомы показал, что в клетках синтезируются все компоненты инфламмасомы, а также про-ИЛ-1бета (рис. 1, панели NLRP3, ASC, прокаспаза-1, про-ИЛ-1бета, 2, 3). Активный ИЛ-1бета (рис. 1, панель ИЛ-1бета) выявлен как в необработанных (2), так и в обработанных нигерицином клетках (3), причем обработанные клетки содержали меньше ИЛ-1бета (3). Методом ИФА показано, что концентрация активного ИЛ-1бета в культуральных жидкостях котрансфицированных клеток, обработанных нигерицином, была в 5–7 раз выше, чем в необработанных (рис. 2, p < 0.05). Детекция активной формы ИЛ-1бета в клеточных лизатах и культуральных жидкостях свидетельствует о его секреции клетками, что указывает на активацию инфламмасомы NLRP3 в данной системе. Снижение количества активного ИЛ-1бета в лизатах клеток, обработанных нигерицином (активатор инфламмасомы), и значительное повышение количества этого цитокина в культуральной жидкости клеток свидетельствует об усилении секреции ИЛ-1бета под действием нигерицина.

Рис. 1.

Экспрессия компонентов инфламмасомы NLRP3, реконструированной при котрансфекции клеток HEK293T, в присутствии неструктурных белков флавивирусов. Клетки HEK293T были трансфицированы контрольной плазмидой pVax-3×Flag (1) или котрансфицированы плазмидами, кодирующими NLRP3, ASC, прокаспазу-1, про-ИЛ-1бета, а также либо контрольной плазмидой pVax-3×Flag (2, 3), либо плазмидами pVax-3×Flag, кодирующими NS1 ВЗН (4), NS3 ВГС (5) и NS5 ВКЭ (6). Через 24 ч проводили смену культуральной среды, к образцам добавляли активатор инфламмасомы NLRP3 нигерицин (10 мкМ) (3). Содержание компонентов инфламмасомы, про-ИЛ-1бета, активного ИЛ-1бета, вирусных белков и актина оценивали с помощью вестерн-блотинга клеточных лизатов, полученных через 25–30 ч после котрансфекции, с использованием коммерческих антител, специфических к NLRP3, ASC, myc-метке (прокаспаза-1), ИЛ-1бета, Flag-метке, актину. На панели “Flag” стрелки указывают полосы, соответствующие детектированным вирусным белкам, приведены их молекулярные массы. Эксперимент воспроизведен в трех повторах.

Рис. 2.

Концентрация ИЛ-1бета в культуральных жидкостях клеток HEK293T с реконструированной инфламмасомой NLRP3. Культуральные жидкости клеток, котрансфицированных плазмидами, кодирующими NLRP3, ASC, прокаспазу-1, про-ИЛ-1бета, и контрольной плазмидой pVax-3×Flag, не обработанных (Контроль) и обработанных нигерицином (+Нигерицин), анализировали методом ИФА. n = 4, медиана +95% ДИ, *p < 0.05 (тест Манна–Уитни).

Стоит отметить, что ИЛ-1бета выявлен в лизатах и культуральных жидкостях необработанных нигерицином клеток, что свидетельствует об активации инфламмасомы в данной модели в отсутствие активатора. Полученные результаты согласуются с данными, согласно которым котрансфекция клеток HEK293T генами, кодирующими NLRP3, ASC, прокаспазу-1 и про-ИЛ-1бета, в отсутствие специальных активирующих сигналов приводит к образованию и секреции активной формы ИЛ-1бета [22, 23, 32, 40]. По всей видимости, этот эффект может быть обусловлен действием трансфекционного реагента липофектамина. Этот реагент создан на основе катионных липосом, способных индуцировать апоптоз, аутофагию и окислительный стресс [43–45], что, в свою очередь, может служить сигналом, активирующим инфламмасому. Более того, ряд исследований прямо указывает на активацию инфламмасом катионными липосомами [46–48]. При этом на модели котрансфицированных клеток HEK293T показано усиление секреции ИЛ-1бета при действии различных активаторов инфламмасомы, включая АТР и вирусные белки [22, 23, 32, 40]. В нашей работе мы наблюдали такой же эффект: в присутствии нигерицина уровень секреции ИЛ-1бета повысился в 6 раз по сравнению с образцами без активатора. Таким образом, эта модель, несмотря на фоновую активацию инфламмасомы за счет самого процесса трансфекции, позволяет детектировать активацию специфическими факторами, такими как вирусные белки.

Далее на этой модели оценили влияние отдельных неструктурных белков вирусов семейства Flaviviridae на секрецию ИЛ-1бета. Неструктурные белки этих вирусов являются патогенными факторами, влияющими на реакции врожденного иммунитета [20, 49]. Некоторые из этих белков входят в состав вакцин, а также используются в качестве мишеней для антивирусной терапии. Расширение знаний о способности неструктурных белков флавивирусов вызывать воспаление позволит ускорить разработку эффективных безопасных вакцин и противовирусных препаратов. В данной работе исследованы неструктурные белки ВЗН, ВГС, ВКЭ, так как при инфекциях, вызываемых этими вирусами, наблюдается активация инфламмасомы и/или секреция ИЛ-1бета [26–30]. Учитывая эффекты неструктурных белков NS1, NS3, NS5 других представителей Flaviviridae [21–24], мы проанализировали NS1 ВЗН, NS3 (протеаза) ВГС и NS5 (РНК-полимераза) ВКЭ. Для изучения влияния экспрессии неструктурных белков флавивирусов на инфламмасомы NLRP3 клетки HEK293T котрансфицировали плазмидами, кодирующими компоненты системы инфламмасомы, как указано выше, а также дополнительно плазмидами, кодирующими белки NS1 ВЗН, NS3 ВГС, NS5 ВКЭ c 3×Flag-меткой. Анализировали клеточные лизаты и культуральные жидкости клеток. Проведенный нами вестерн-блотинг лизатов клеток, котрансфицированных плазмидами, кодирующими вирусные белки, не выявил существенных изменений в уровне синтеза компонентов системы инфламмасомы NLRP3 по сравнению с контрольными образцами (рис. 2, дорожки 4–6, p > 0.1). Таким образом, экспрессия неструктурных вирусных белков не повлияла на содержание компонентов инфламмасомы в клетках HEK293T. Чтобы понять, влияют ли вирусные белки на уровень секреции ИЛ-1бета, оценили концентрацию этого цитокина в культуральных жидкостях клеток методом ИФА. На рис. 3 эти результаты представлены как отношение концентрации ИЛ-1бета в образцах, где синтезировались вирусные белки, к концентрации ИЛ-1бета в контрольных образцах (без вирусных белков). Показано, что в присутствии белков NS1 ВЗН и NS5 ВКЭ уровень секреции ИЛ-1бета не изменялся (рис. 3, p > 0.1), однако синтез белка NS3 ВГС повышал секрецию ИЛ-1бета в 1.5 раза (рис. 3, p = 0.0029). Таким образом, в использованной нами модели HEK293T с реконструированной инфламмасомой NLRP3 только NS3 ВГС усиливал активацию инфламмасомы. Два других белка – NS1 ВЗН и NS5 ВКЭ – подобного эффекта не оказывали. Это указывает на необходимость дальнейшего поиска факторов, участвующих в активации инфламмасомы при инфекциях, вызванных этими вирусами.

Рис. 3.

Влияние белков NS1 ВЗН, NS3 ВГС, NS5 ВКЭ на секрецию ИЛ-1бета клетками HEK293T с реконструированной инфламмасомой NLRP3. Клетки HEK293T котрансфицированы плазмидами, кодирующими компоненты инфламмасомы, а также либо контрольной плазмидой pVax-3×Flag (Контроль), либо плазмидами, кодирующими NS1 ВЗН, NS3 ВГС или NS5 ВКЭ. На следующий день после котрансфекции в культуральных жидкостях измеряли концентрацию ИЛ-1бета (нг/мл) методом ИФА. Результаты представлены как соотношение концентрации ИЛ-1бета в опытных образцах и в контроле. n = 4–12, медиана + IQR, **p < 0.01 (критерий Вилкоксона для одной выборки).

РНК ВГС является праймирующим сигналом для инфламмасомы, запускающим TLR7-зависимую экспрессию мРНК ИЛ-1бета [27, 28]. Кроме того, известны белки ВГС, способные активировать сборку инфламмасомы – виропорин p7 [29] и коровый белок [50], действие которого, по всей видимости, обусловлено активацией внутриклеточных кальциевых сигнальных путей [50]. Данные о способности белка NS3 ВГС активировать инфламмасому NLRP3 к настоящему времени отсутствуют. При этом в ряде in vitro исследований отмечена роль NS3 в индукции секреции провоспалительных и противовоспалительных цитокинов разными типами клеток: ФНО-альфа и ИЛ-10 моноцитами/макрофагами [51, 52], ИЛ-6, ИЛ-8, ФНО-альфа, ИЛ-1бета клетками микроглии [53], ИЛ-8, ИЛ-6 и ФНО-альфа эпителиальными клетками роговицы [54]. ИЛ-1бета (наряду с ИЛ-18) детектируется в сыворотках пациентов на ранних стадиях инфекции ВГС [28, 55] и считается одним из ключевых факторов, определяющих развитие хронического воспаления печени при гепатите С [28, 56, 57]. При этом тяжесть поражения печени прямо коррелирует с уровнем ИЛ-1бета [28]. Основными продуцентами ИЛ-1бета при инфекции ВГС являются макрофаги печени, в том числе клетки Купфера. Они способны к захвату вирионов ВГС, что провоцирует активацию инфламмасомы NLRP3 [28, 29, 58]. Некоторые исследования указывают на активацию инфламмасомы NLRP3 и в гепатоцитах [59] – основных сайтах репликации ВГС [60], но эти данные противоречивы [28]. Помимо этого, опубликованы данные, согласно которым NS3 способен активировать окислительный стресс в моноцитах и гепатоцитах [61, 62]. Способность к индукции секреции провоспалительных цитокинов, в том числе ИЛ-1бета, и окислительного стресса, показывает, что NS3 может быть активатором инфламмасомы. Эффект усиления активации инфламмасомы белком NS3 ВГС зарегистрирован нами в клетках HEK293T с реконструированной инфламмасомой. Дальнейшие эксперименты в клеточных линиях, являющихся сайтами репликации ВГС и/или участвующих в противовирусном ответе, позволят более детально понять роль NS3 в патогенезе NLRP3-/ИЛ-1бета-зависимого воспаления при ВГС.

Следует отметить, что ВГС обладает высоким уровнем генетической изменчивости: на данный момент известно восемь генотипов ВГС и до 90 подтипов [63], среди которых генотипы 1a и 1b вызывают большую часть ВГС инфекций в мире [64]. Заболевания, индуцируемые ВГС разных генотипов, характеризуются особенностями патогенеза [65], а также эффективностью ответа на противовирусную терапию [66, 67]. Так, в ряде работ отмечено, что инфекция ВГС генотипа 1b, белок NS3 которого изучен в нашей работе, может быть ассоциирована с большей тяжестью поражения печени, а также с развитием цирроза и гепатоцеллюлярной карциномы, хотя эти особенности патогенеза могут быть обусловлены факторами, не связанными с генотипом вируса [65, 68–70]. Наблюдаются также различия в патогенезе и профиле цитокинов, индуцируемых при инфекции, вызываемой вирусом Зика, еще одним представителем семейства Flaviviridae, в частности, между африканской и азиатской линиями вируса [71–73]. При этом обнаружены различия и в активации инфламмасомы NLRP3: инфекция “азиатским” вирусом, а также его белок NS5 активировали инфламмасому [21, 22], в то время как “африканский” вирус ослаблял активацию NLRP3. При этом не наблюдали активации инфламмасомы белком NS5 [24]. Изученный нами белок NS3 ВГС содержит полиморфные аминокислотные остатки [74, 75]; как сказано выше, заболевания, вызываемые ВГС разных генотипов, могут иметь патогенетические отличия. В связи с этим можно предположить, что, как и в случае вируса Зика и его белка NS5, влияние NS3 на инфламмасому будет зависеть от генотипа ВГС, что представляет интерес для дальнейших исследований. Необходимо подчеркнуть, что NS3 ВГС является одной из мишеней противовирусных препаратов прямого действия, эффективных при гепатите С [76], однако не лишенных при этом некоторых недостатков, таких как возможность появления лекарственно-устойчивых форм вируса [77, 78], а также снижение эффективности, обусловленное влиянием полиморфизмов в NS3 [74, 75, 79]. Терапия может быть неэффективной для отдельных вариантов вируса [80], при этом препараты прямого действия не излечивают последствия воспалительного поражения печени при хронической инфекции ВГС и не предотвращают развитие цирроза и рака печени [81, 82].

Таким образом, нами получены данные, важные для понимания механизмов вирусного патогенеза, в частности, индукции воспаления при активации инфламмасом и выявления мишеней для противовирусной терапии. Расширение знаний о факторах воспаления при ВГС важно для разработки препаратов, эффективно предотвращающих воспалительные поражения при инфекции, вызванной этим вирусом.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РНФ № 21-74-00124.

Статья не содержит экспериментов с привлечением животных или людей.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Список литературы

  1. Franchi L., Warner N., Viani K., Nunez G. (2009) Function of Nod-like receptors in microbial recognition and host defense. Immunol. Rev. 227, 106‒128.

  2. Yang Y., Wang H., Kouadir M., Song H., Shi F. (2019) Recent advances in the mechanisms of NLRP3 inflammasome activation and its inhibitors. Cell Death Disease. 10, 128.

  3. Lu A., Li Y., Schmidt F.I., Yin Q., Chen S., Fu T.M., Tong A.B., Ploegh H.L., Mao Y., Wu H. (2016) Molecular basis of caspase-1 polymerization and its inhibition by a new capping mechanism. Nat. Struct. Mol. Biol. 23, 416‒425.

  4. Malik A., Kanneganti T.D. (2017) Inflammasome activation and assembly at a glance. J. Cell Sci. 130, 3955‒3963.

  5. Swanson K.V., Deng M., Ting J.P. (2019) The NLRP3 inflammasome: molecular activation and regulation to therapeutics. Nat. Rev. Immunol. 19, 477‒489.

  6. Gram A.M., Frenkel J., Ressing M.E. (2012) Inflammasomes and viruses: cellular defence versus viral offence. J. General Virol. 93, 2063‒2075.

  7. Cai X., Chen J., Xu H., Liu S., Jiang Q.X., Halfmann R., Chen Z.J. (2014) Prion-like polymerization underlies signal transduction in antiviral immune defense and inflammasome activation. Cell. 156, 1207‒1222.

  8. Broz P., Dixit V.M. (2016) Inflammasomes: mechanism of assembly, regulation and signalling. Nat. Rev. Immunol. 16, 407‒420.

  9. Mangan M.S.J., Olhava E.J., Roush W.R., Seidel H.M., Glick G.D., Latz E. (2018) Targeting the NLRP3 inflammasome in inflammatory diseases. Nat. Rev. Drug Discovery. 17, 688.

  10. Rathinam V.A., Fitzgerald K.A. (2016) Inflammasome complexes: emerging mechanisms and effector functions. Cell. 165, 792‒800.

  11. He W.T., Wan H., Hu L., Chen P., Wang X., Huang Z., Yang Z.H., Zhong C.Q., Han J. (2015) Gasdermin D is an executor of pyroptosis and required for interleukin-1beta secretion. Cell. Res. 25, 1285‒1298.

  12. Shi J., Zhao Y., Wang K., Shi X., Wang Y., Huang H., Zhuang Y., Cai T., Wang F., Shao F. (2015) Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death. Nature. 526, 660‒665.

  13. Dinarello C.A., Novick D., Kim S., Kaplanski G. (2013) Interleukin-18 and IL-18 binding protein. Front. Immunol. 4, 289.

  14. Joosten L.A., Netea M.G., Dinarello C.A. (2013) Interleukin-1beta in innate inflammation, autophagy and immunity. Semin. Immunol. 25, 416‒424.

  15. Bauernfeind F.G., Horvath G., Stutz A., Alnemri E.S., MacDonald K., Speert D., Fernandes-Alnemri T., Wu J., Monks B.G., Fitzgerald K.A., Hornung V., Latz E. (2009) Cutting edge: NF-kappaB activating pattern recognition and cytokine receptors license NLRP3 inflammasome activation by regulating NLRP3 expression. J. Immunol. 183, 787‒791.

  16. Christgen S., Kanneganti T.D. (2020) Inflammasomes and the fine line between defense and disease. Curr. Opin. Immunol. 62, 39‒44.

  17. Afonina I.S., Zhong Z., Karin M., Beyaert R. (2017) Limiting inflammation-the negative regulation of NF-kappaB and the NLRP3 inflammasome. Nat. Immunol. 18, 861‒869.

  18. Lamkanfi M., Dixit V.M. (2014) Mechanisms and functions of inflammasomes. Cell. 157, 1013‒1022.

  19. Zhao C., Zhao W. (2020) NLRP3 inflammasome-A key player in antiviral responses. Front. Immunol. 11, 211.

  20. Latanova A., Starodubova E., Karpov V. (2022) Flaviviridae nonstructural proteins: the role in molecular mechanisms of triggering inflammation. Viruses. 14, 1808.

  21. He Z., Chen J., Zhu X., An S., Dong X., Yu J., Zhang S., Wu Y., Li G., Zhang Y., Wu J., Li M. (2018) NLRP3 Inflammasome activation mediates Zika virus-associated inflammation. J. Infect. Dis. 217, 1942‒1951.

  22. Wang W., Li G., De W., Luo Z., Pan P., Tian M., Wang Y., Xiao F., Li A., Wu K., Liu X., Rao L., Liu F., Liu Y., Wu J. (2018) Zika virus infection induces host inflammatory responses by facilitating NLRP3 inflammasome assembly and interleukin-1beta secretion. Nat. Commun. 9, 106.

  23. Zheng Y., Liu Q., Wu Y., Ma L., Zhang Z., Liu T., Jin S., She Y., Li Y.P., Cui J. (2018) Zika virus elicits inflammation to evade antiviral response by cleaving cGAS via NS1-caspase-1 axis. EMBO J. 37, e99347.

  24. Gim E., Shim D.W., Hwang I., Shin O.S., Yu J.W. (2019) Zika virus impairs host NLRP3-mediated inflammasome activation in an NS3-dependent manner. Immune Network. 19, e40.

  25. Shrivastava G., Visoso-Carvajal G., Garcia-Cordero J., Leon-Juarez M., Chavez-Munguia B., Lopez T., Nava P., Villegas-Sepulveda N., Cedillo-Barron L. (2020) Dengue virus serotype 2 and its non-structural proteins 2A and 2B activate NLRP3 inflammasome. Front. Immunol. 11, 352.

  26. Ramos H.J., Lanteri M.C., Blahnik G., Negash A., Suthar M.S., Brassil M.M., Sodhi K., Treuting P.M., Busch M.P., Norris P.J., Gale M., Jr. (2012) IL-1beta signaling promotes CNS-intrinsic immune control of West Nile virus infection. PLoS Pathogens. 8, e1003039.

  27. Chen W., Xu Y., Li H., Tao W., Xiang Y., Huang B., Niu J., Zhong J., Meng G. (2014) HCV genomic RNA activates the NLRP3 inflammasome in human myeloid cells. PLoS One. 9, e84953.

  28. Negash A.A., Ramos H.J., Crochet N., Lau D.T., Doehle B., Papic N., Delker D.A., Jo J., Bertoletti A., Hagedorn C.H., Gale M., Jr. (2013) IL-1beta production through the NLRP3 inflammasome by hepatic macrophages links hepatitis C virus infection with liver inflammation and disease. PLoS Pathogens. 9, e1003330.

  29. Shrivastava S., Mukherjee A., Ray R., Ray R.B. (2013) Hepatitis C virus induces interleukin-1beta (IL-1beta)/IL-18 in circulatory and resident liver macrophages. J. Virol. 87, 12284‒12290.

  30. Atrasheuskaya A.V., Fredeking T.M., Ignatyev G.M. (2003) Changes in immune parameters and their correction in human cases of tick-borne encephalitis. Clin. Exp. Immunol. 131, 148‒154.

  31. Isaguliants M.G., Petrakova N.V., Mokhonov V.V., Pokrovskaya K., Suzdaltzeva Y.G., Krivonos A.V., Zaberezhny A.D., Garaev M.M., Smirnov V.D., Nordenfelt E. (2003) DNA immunization efficiently targets conserved functional domains of protease and ATPase/helicase of nonstructural 3 protein (NS3) of human hepatitis C virus. Immunol. Lett. 88, 1‒13.

  32. Shi C.S., Nabar N.R., Huang N.N., Kehrl J.H. (2019) SARS-coronavirus open reading frame-8b triggers intracellular stress pathways and activates NLRP3 inflammasomes. Cell Death Discov. 5, 101.

  33. Chuang Y.T., Lin Y.C., Lin K.H., Chou T.F., Kuo W.C., Yang K.T., Wu P.R., Chen R.H., Kimchi A., Lai M.Z. (2011) Tumor suppressor death-associated protein kinase is required for full IL-1beta production. Blood. 117, 960‒970.

  34. Ito S., Hara Y., Kubota T. (2014) CARD8 is a negative regulator for NLRP3 inflammasome, but mutant NLRP3 in cryopyrin-associated periodic syndromes escapes the restriction. Arthritis Res. Therapy. 16, R52.

  35. Mao L., Kitani A., Hiejima E., Montgomery-Recht K., Zhou W., Fuss I., Wiestner A., Strober W. (2020) Bruton tyrosine kinase deficiency augments NLRP3 inflammasome activation and causes IL-1beta-mediated colitis. J. Clin. Investigation. 130, 1793‒1807.

  36. Zito G., Buscetta M., Cimino M., Dino P., Bucchieri F., Cipollina C. (2020) Cellular models and assays to study NLRP3 inflammasome biology. Int. J. Mol. Sci. 21, 4294.

  37. Coll R.C., Hill J.R., Day C.J., Zamoshnikova A., Boucher D., Massey N.L., Chitty J.L., Fraser J.A., Jennings M.P., Robertson A.A.B., Schroder K. (2019) MCC950 directly targets the NLRP3 ATP-hydrolysis motif for inflammasome inhibition. Nat. Chem. Biol. 15, 556‒559.

  38. Hafner-Bratkovic I., Susjan P., Lainscek D., Tapia-Abellan A., Cerovic K., Kadunc L., Angosto-Bazarra D., Pelegrin P., Jerala R. (2018) NLRP3 lacking the leucine-rich repeat domain can be fully activated via the canonical inflammasome pathway. Nat. Commun. 9, 5182.

  39. Vande Walle L., Stowe I.B., Sacha P., Lee B.L., D-emon D., Fossoul A., Van Hauwermeiren F., Saavedra P.H.V., Simon P., Subrt V., Kostka L., Stivala C.E., Pham V.C., Staben S.T., Yamazoe S., Konvalinka J., Kayagaki N., Lamkanfi M. (2019) MCC950/CRID3 potently targets the NACHT domain of wild-type NLRP3 but not disease-associated mutants for inflammasome inhibition. PLoS Biol. 17, e3000354.

  40. Wang W., Xiao F., Wan P., Pan P., Zhang Y., Liu F., Wu K., Liu Y., Wu J. (2017) EV71 3D protein binds with NLRP3 and enhances the assembly of inflammasome complex. PLoS Pathogens. 13, e1006123.

  41. Guffanti A.A., Davidson L.F., Mann T.M., Krulwich T.A. (1979) Nigericin-induced death of an acidophilic bacterium. J. Gen. Microbiol. 114, 201–206.

  42. Eytan G.D., Carlenor E., Rydstrom J. (1990) Energy-linked transhydrogenase. Effects of valinomycin and nigericin on the ATP-driven transhydrogenase reaction catalyzed by reconstituted transhydrogenase-ATPase vesicles. J. Biol. Chem. 265, 12949‒12954.

  43. Kongkaneramit L., Sarisuta N., Azad N., Lu Y., Iyer A.K., Wang L., Rojanasakul Y. (2008) Dependence of reactive oxygen species and FLICE inhibitory protein on lipofectamine-induced apoptosis in human lung epithelial cells. J. Pharmacol. Exp. Therapeutics. 325, 969‒977.

  44. Mo R.H., Zaro J.L., Ou J.H., Shen W.C. (2012) Effects of lipofectamine 2000/siRNA complexes on autophagy in hepatoma cells. Mol. Biotechnol. 51, 1‒8.

  45. Napoli E., Liu S., Marsilio I., Zarbalis K., Giulivi C. (2017) Lipid-based DNA/siRNA transfection agents disrupt neuronal bioenergetics and mitophagy. Biochem. J. 474, 3887‒3902.

  46. He J., Li T., Prochnicki T., Horvath G., Latz E., Takeoka S. (2019) Membrane fusogenic lysine type lipid assemblies possess enhanced NLRP3 inflammasome activation potency. Biochem. Biophys. Rep. 18, 100623.

  47. Li T., He J., Horvath G., Prochnicki T., Latz E., Takeoka S. (2018) Lysine-containing cationic liposomes activate the NLRP3 inflammasome: effect of a spacer between the head group and the hydrophobic moieties of the lipids. Nanomedicine: Nanotechnol. Biol. Med. 14, 279‒288.

  48. Zhong Z., Zhai Y., Liang S., Mori Y., Han R., Sutterwala F.S., Qiao L. (2013) TRPM2 links oxidative stress to NLRP3 inflammasome activation. Nat. Commun. 4, 1611.

  49. Elrefaey A.M.E., Hollinghurst P., Reitmayer C.M., Alphey L., Maringer K. (2021) Innate immune antagonism of mosquito-borne flaviviruses in humans and mosquitoes. Viruses. 13, 2116.

  50. Negash A.A., Olson R.M., Griffin S., Gale M., Jr. (2019) Modulation of calcium signaling pathway by hepatitis C virus core protein stimulates NLRP3 inflammasome activation. PLoS Pathogens. 15, e1007593.

  51. Chang S., Dolganiuc A., Szabo G. (2007) Toll-like receptors 1 and 6 are involved in TLR2-mediated macrophage activation by hepatitis C virus core and NS3 proteins. J. Leukocyte Biol. 82, 479‒487.

  52. Dolganiuc A., Kodys K., Kopasz A., Marshall C., Do T., Romics L., Jr., Mandrekar P., Zapp M., Szabo G. (2003) Hepatitis C virus core and nonstructural protein 3 proteins induce pro- and anti-inflammatory cytokines and inhibit dendritic cell differentiation. J. Immunol. 170, 5615‒5624.

  53. Rajalakshmy A.R., Malathi J., Madhavan H.N. (2015) Hepatitis C virus NS3 mediated microglial inflammation via TLR2/TLR6 MyD88/NF-kappaB pathway and Toll like receptor ligand treatment furnished immune tolerance. PLoS One. 10, e0125419.

  54. Rajalakshmy A.R., Malathi J., Madhavan H.N. (2014) HCV core and NS3 proteins mediate toll like receptor induced innate immune response in corneal epithelium. Exp. Eye Res. 128, 117–128.

  55. Martinez-Esparza M., Tristan-Manzano M., Ruiz-Alcaraz A.J., Garcia-Penarrubia P. (2015) Inflammatory status in human hepatic cirrhosis. World J. Gastroenterol. 21, 11522‒11541.

  56. Chattergoon M.A., Levine J.S., Latanich R., Osburn W.O., Thomas D.L., Cox A.L. (2011) High plasma interleukin-18 levels mark the acute phase of hepatitis C virus infection. J. Infectious Diseases. 204, 1730‒1740.

  57. Vecchiet J., Falasca K., Cacciatore P., Zingariello P., Dalessandro M., Marinopiccoli M., D’Amico E., Palazzi C., Petrarca C., Conti P., Pizzigallo E., Guagnano M.T. (2005) Association between plasma interleukin-18 levels and liver injury in chronic hepatitis C virus infection and non-alcoholic fatty liver disease. Ann. Clin. Lab. Sci. 35, 415‒422.

  58. Chattergoon M.A., Latanich R., Quinn J., Winter M.E., Buckheit R.W., 3rd, Blankson J.N., Pardoll D., Cox A.L. (2014) HIV and HCV activate the inflammasome in monocytes and macrophages via endosomal Toll-like receptors without induction of type 1 interferon. PLoS Pathogens. 10, e1004082.

  59. Ramachandran A., Kumar B., Waris G., Everly D. (2021) Deubiquitination and activation of the NLRP3 inflammasome by UCHL5 in HCV-infected cells. Microbiol. Spectrum. 9, e0075521.

  60. Farquhar M.J., McKeating J.A. (2008) Primary hepatocytes as targets for hepatitis C virus replication. J. Viral. Hepatitis. 15, 849‒854.

  61. Bureau C., Bernad J., Chaouche N., Orfila C., Beraud M., Gonindard C., Alric L., Vinel J.P., Pipy B. (2001) Nonstructural 3 protein of hepatitis C virus triggers an oxidative burst in human monocytes via activation of NADPH oxidase. J. Biol. Chem. 276, 23077‒23083.

  62. Pal S., Polyak S.J., Bano N., Qiu W.C., Carithers R.L., Shuhart M., Gretch D.R., Das A. (2010) Hepatitis C virus induces oxidative stress, DNA damage and modulates the DNA repair enzyme NEIL1. J. Gastroenterol. Hepatol. 25, 627‒634.

  63. Shah R., Ahovegbe L., Niebel M., Shepherd J., Thomson E.C. (2021) Non-epidemic HCV genotypes in low- and middle-income countries and the risk of resistance to current direct-acting antiviral regimens. J. Hepatol. 75, 462‒473.

  64. Polaris Observatory H.C.V.C. (2017) Global prevalence and genotype distribution of hepatitis C virus infection in 2015: a modelling study. Lancet. Gastroenterol. Hepatol. 2, 161‒176.

  65. Webster G., Barnes E., Brown D., Dusheiko G. (2000) HCV genotypes‒role in pathogenesis of disease and response to therapy. Baillieres Best Pract. Res. Clin. Gastroenterol. 14, 229‒240.

  66. Liu G., Cai Q., Li Z., Shao X., Luo Q., Zhang X., Zhao Z. (2016) Effect of drug resistance mutations on antiviral agents in HCV patients. Antiviral. Therapy. 21, 369‒375.

  67. Petruzziello A., Marigliano S., Loquercio G., Cozzolino A., Cacciapuoti C. (2016) Global epidemiology of hepatitis C virus infection: an up-date of the distribution and circulation of hepatitis C virus genotypes. World J. Gastroenterol. 22, 7824‒7840.

  68. Irshad M., Mankotia D.S., Irshad K. (2013) An insight into the diagnosis and pathogenesis of hepatitis C virus infection. World J. Gastroenterol. 19, 7896‒7909.

  69. Yamane D., McGivern D.R., Masaki T., Lemon S.M. (2013) Liver injury and disease pathogenesis in chronic hepatitis C. Curr. Topics Microbiol. Immunol. 369, 263‒288.

  70. Mondelli M.U., Silini E. (1999) Clinical significance of hepatitis C virus genotypes. J. Hepatol. 31(Suppl 1), 65‒70.

  71. Lanciotti R.S., Lambert A.J., Holodniy M., Saavedra S., Signor Ldel C. (2016) Phylogeny of Zika virus in Western Hemisphere, (2015) Emerging Infect. Dis. 22, 933‒935.

  72. Shao Q., Herrlinger S., Zhu Y.N., Yang M., Goodfellow F., Stice S.L., Qi X.P., Brindley M.A., Chen J.F. (2017) The African Zika virus MR-766 is more virulent and causes more severe brain damage than current Asian lineage and dengue virus. Development. 144, 4114‒4124.

  73. Dowall S.D., Graham V.A., Hewson R. (2020) Lineage-dependent differences of Zika virus infection in a susceptible mouse model are associated with different profiles of cytokines, chemokines, growth factors and acute phase proteins. Cytokine. 125, 154864.

  74. Mundim A., de Castro F.O.F., Albuquerque M.B.B., Vilanova-Costa C., Pfrimer I.A.H., Silva A. (2020) Major mutations in the NS3 gene region of hepatitis C virus related to the resistance to direct acting antiviral drugs: a systematic review. Virus. Dis. 31, 220‒228.

  75. Sagnelli E., Starace M., Minichini C., Pisaturo M., Macera M., Sagnelli C., Coppola N. (2018) Resistance detection and re-treatment options in hepatitis C virus-related chronic liver diseases after DAA-treatment failure. Infection. 46, 761‒783.

  76. Lanini S., Scognamiglio P., Mecozzi A., Lombardozzi L., Vullo V., Angelico M., Gasbarrini A., Taliani G., Attili A.F., Perno C.F., De Santis A., Puro V., Cerqua F., D’Offizi G., Pellicelli A., Armignacco O., Mennini F.S., Siciliano M., Girardi E., Panella V., Ippolito G., members of the Lazio Region H.C.V.t.g. (2018) Impact of new DAA therapy on real clinical practice: a multicenter region-wide cohort study. BMC Infect. Dis. 18, 223.

  77. Bradshaw D., Mbisa J.L., Geretti A.M., Healy B.J., Cooke G.S., Foster G.R., Thomson E.C., McLauchlan J., Agarwal K., Sabin C., Mutimer D., Moss P., Irving W.L., Barnes E., Hepatitis C Trust U.K. (2019) Consensus recommendations for resistance testing in the management of chronic hepatitis C virus infection: Public Health England HCV Resistance Group. J. Infection. 79, 503‒512.

  78. Costa V.D., Pellegrini P., Rotman V., Pittella A.M., Nunes E.P., Lago B.V., Lampe E., Mello F.C.A. (2019) Resistance mutations A30K and Y93N associated with treatment failure with sofosbuvir and daclatasvir for hepatitis C virus infection non-responder patients: case reports. Viruses. 11, 1004.

  79. Sarrazin C. (2021) Treatment failure with DAA therapy: importance of resistance. J. Hepatol. 74, 1472‒1482.

  80. Paolucci S., Novazzi F., Piralla A., Maserati R., Gulminetti R., Novati S., Barbarini G., Sacchi P., Fratini A., Bellotti L., Baldanti F. (2019) Viral dynamics among HCV infected patients with different genotypes treated with genotypic specific or pan-genotypic direct-acting antiviral agent combinations. Infect. Drug Resist. 12, 1975‒1984.

  81. Schwerk J., Negash A., Savan R., Gale M., Jr. (2021) Innate immunity in hepatitis C virus infection. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 11, a036988.

  82. Welsch C., Efinger M., von Wagner M., Herrmann E., Zeuzem S., Welzel T.M., Lange C.M. (2017) Ongoing liver inflammation in patients with chronic hepatitis C and sustained virological response. PLoS One. 12, e0171755.

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Молекулярная биология

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал