Молекулярная биология, 2023, T. 57, № 5, стр. 797-806

ВВЕДЕНИЕ

Хризантема (Chrysanthemum spp., семейство Asteraceae) – одно из самых популярных цветочно-декоративных растений во всем мире. Вирусные и вироидные болезни существенно снижают декоративные свойства растений и качество вегетативно размножаемого материала [1–3]. Из примерно трех десятков вирусов и вироидов, обнаруженных в растениях хризантемы, вирус аспермии томата является одним из самых распространенных и вредоносных, вызывая деформацию, измельчание и обесцвечивание соцветий [4, 5].

Вирус аспермии томата (tomato aspermy virus, TAV) принадлежит к роду Cucumovirus из семейства Bromoviridae. Род Cucumovirus включает четыре вида: собственно TAV, а также вирус огуречной мозаики (cucumber mosaic virus, CMV), вирус карликовости арахиса (peanut stunt virus, PSV) и вирус мягкой крапчатости лиатриса (gayfeather mild mottle virus, GfMMV) [6]. Как у всех представителей этого рода, геном TAV сегментирован и состоит из трех молекул одноцепочечной линейной РНК положительной полярности, каждая из которых упакована в отдельные вирусные частицы диаметром 28 нм. 5'-концы РНК кепированы, а 3'-концевые последовательности организованы в тРНК-подобную структуру. Пять открытых рамок считывания (open reading frame, ORF) кодируют репликазу (ORF1), РНК-зависимую РНК-полимеразу (ORF2a), полифункциональный белок 2b (OFR2b), транспортный белок (ТБ) (OFR3a) и белок оболочки (БО) вируса (ORF3b) (рис. 1). Репликаза и РНК-зависимая РНК-полимераза обеспечивают репликацию вирусного генома. Белок 2b является репрессором сайленсинга, а также играет важную роль в системном транспорте вируса, индукции симптомов и патогенезе вирусной инфекции. ТБ обеспечивает межклеточный транспорт вируса, а БО – инкапсидацию вирусного генома, перенос вируса тлями и его распространение по растению. OFR1, ORF2a и ORF3a транслируются с геномной РНК, а ORF3b и ORF2b – с субгеномных РНК4 и РНК4А соответственно [7].

Рис. 1.

Схема генома вируса аспермии томата. Прямоугольниками показаны открытые рамки считывания 1a, 2a, 2b, 3a и 3b, а тонкой линией – нетранслируемые участки генома. ТБ − транспортный белок. БО − белок оболочки. сгРНК − субгеномная РНК. − тРНК-подобная структура, − кеп.

TAV распространен повсеместно. Основными природными хозяевами являются растения хризантемы и томата. Вирус встречается также в растениях петунии, гладиолуса, настурции, циннии, канны, лилии и перца [8, 9]. Круг экспериментальных хозяев этого вируса значительно шире, он включает более 100 видов двудольных и однодольных растений из 27 семейств. TAV распространяется при вегетативном размножении зараженных растений и неперсистентным образом тлями [10].

В России TAV впервые был обнаружен на хризантеме Ch. indicum в Приморском крае [11]. Геном дальневосточного изолята вируса не изучен. Несколько новых российских изолятов TAV выявлены в Никитском ботаническом саду (НБС) на трех сортах хризантемы местной селекции [12]. Гены БО TAV из сортов Симфония, Юность и гибрида 7-15 оказались полностью идентичными между собой, а также БО венгерского изолята P‑TAV (L15335) из перца [9] и австралийского изолята V-TAV (AJ277268) из хризантемы [13].

Кроме того, при метатранскриптомном анализе растений интродуцированных сортов Ribonette и Golden Standard хризантемы из коллекции НБС получены прочтения, родственные карлавирусам хризантемному вирусу B (chrysanthemum virus B) и хризантемному вирусу R (chrysanthemum virus R), а также TAV. Полноразмерные геномы обоих карлавирусов собраны и охарактеризованы ранее [14]. Целью данной работы была сборка и анализ полных геномов двух изолятов TAV.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Объект исследования. Листья хризантемы (Ch. morifolium Ramat.) сортов Ribonette и Golden Standard с симптомами предполагаемой вирусной инфекции собирали в генофондовой коллекции хризантемы Никитского ботанического сада – Национального научного центра РАН (НБС), Ялта, Республика Крым, в 2018–2019 годах.

ОТ-ПЦР. Cуммарную РНК выделяли с помощью набора RNeasy Plant Mini Kit (“Qiagen”, Германия). Первую нить кДНК синтезировали с использованием обратной транскриптазы MMLV и рассеянной затравки в виде случайных гексамеров (“Евроген”, Россия). Для выявления TAV в растительном материале использовали ОТ-ПЦР. Ген БО TAV амплифицировали с помощью прямого и обратного вирусспецифических праймеров (5'-ATGGCCCAAAACGGTACGGGAGGAG-3' и 5'-TCACACCGGGAGCGTTGAAGCGGAA-3' соответственно) [15], используя ДНК-полимеразу Encyclo (“Евроген”) и 35 циклов ПЦР (денатурация – 94°С, 30 с; отжиг – 52°С, 30 с; элонгация – 72°С, 1 мин) с окончательной достройкой при 72°С в течение 10 мин. В качестве положительного контроля использовали изолят TAV из растений хризантемы сорта Юность. Отрицательным контролем служил образец хризантемы сорта Сказка, не зараженный этим вирусом [12]. Ампликоны разделяли электрофорезом в 1× TAE-буфере (“Thermo Scientific”, США) в присутствии бромистого этидия и фотографировали в ультрафиолетовом свете с помощью гель-документирующей системы Multi-Doc-It (UVP, Великобритания). В качестве маркера размера продуктов ПЦР использовали препарат 100+ bp DNA ladder (“Евроген”). Продукты ПЦР секвенировали с прямого и обратного праймеров в фирме “Евроген”.

Высокопроизводительное секвенирование (HTS). Библиотеки кДНК для секвенирования геномов TAV получали на матрице полиаденилированной РНК, выделенной из листьев хризантемы сортов Ribonette и Golden Standard с помощью набора К0600 (“Силекс”, Россия) в соответствии с инструкцией производителя. Библиотеки синтезировали с помощью набора TruSeq Stranded mRNA Library Prep Kit (“Illumina”, США) и секвенировали на платформе Illumina MiSeq в Центре коллективного пользования “Геном” Института молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардта РАН. Полученные парноконцевые прочтения длиной 150 нуклеотидов обрезали и фильтровали с помощью Trimmomatic v.0.39 [16]. Контиги собирали de novo с помощью программы Trinity 2.11, используя настройки по умолчанию [17]. Вирусные контиги идентифицировали путем картирования всех собранных контигов на базу полноразмерных вирусных геномов из GenBank (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/genbank/viral/assembly_summary.txt, всего около 50000 геномов) при помощи локальной версии BLASTn 2.13. Полученные прочтения картировали на контиги TAV, собранные в образце Rib, с помощью программы BWA [18]. Поиск точечных замен и коротких инделей в прочтениях осуществляли при помощи программы freeBayes [19]. Прочтения ряда близкородственных изолятов TAV, доступных в GenBank, моделировали путем многократной случайной “нарезки” их геномов на фрагменты длиной 150 нуклеотидов с помощью программы wgsim [20]. C этой целью были выбраны изоляты PV-0220 и SKO20ST2, которые имели высокую гомологию с российскими изолятами Rib и GS по всем геномным РНК (99.5–99.8% идентичности), и PV-0068, идентичный на 99.5–99.8% по РНК1 и РНК3 и на 95.6% по РНК2.

Анализ последовательностей. Последовательности, наиболее близкие к собранным геномам TAV, выявляли с помощью веб-версии BLASTn (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) на нуклеотидной коллекции NCBI. Множественные выравнивания нуклеотидных и аминокислотных (аа) последовательностей, определение степени их идентичности и филогенетический анализ выполняли в MEGA7 [21]. Филогенетические деревья реконструировали методом присоединения соседей (neighbor joining). ORF в вирусных геномах идентифицировали с помощью программы ORF finder (https://ncbi.nlm.nih.gov/orffinder). Консервативные домены в вирусных белках локализовали посредством поиска по базе Conserved Domain Database (CDD, https://ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi). Для поиска событий рекомбинации использовали программу RDP4.46 [22] c настройками по умолчанию, за тем исключением, что была выбрана опция “sequences are linear”.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Филогенетический анализ полных геномов TAV

В филогенетическом анализе (рис. 2) были использованы все изоляты TAV, полногеномные последовательности которых депонированы в GenBank и определены в данной работе (табл. 1). Показано, что РНК1 Rib и GS входит в гетерогенную группу изолятов, найденных в растениях томата и хризантемы в Японии, Южной Корее, Болгарии, Германии, США, Канаде и Австралии (рис. 2а). РНК2 изолятов Rib и GS четко кластеризуется с томатными изолятами SKO20ST2 из Словении и PV-0220 из Болгарии и, в меньшей степени, с иранским изолятом Ker.Mah.P из петунии и китайским изолятом Henan из хризантемы (рис. 2б). Подобно РНК1, РНК3 российских изолятов TAV также входит в состав обширной группы изолятов этого вируса, обнаруженных на различных видах растений в разных регионах мира (рис. 2в).

Рис. 2.

Филогенетический анализ полногеномных последовательностей изолятов вируса аспермии томата (TAV). a – РНК1, б – РНК2, в – РНК3. Дерево реконструировано методом присоединения соседей, встроенным в MEGA7. Приведены значения бутстрэпа >70%. Названия изолятов указаны на концах ветвей. Российские изоляты Rib и GS выделены черным кружком ($ \bullet $).

Очевидно, что три дерева, реконструированные по последовательностям РНК1, РНК2 и РНК3, имеют разную топологию. Российские изоляты Rib и GS кластеризуются по-разному в зависимости от анализируемого сегмента генома. Различный порядок ветвления филогенетических деревьев, построенных по разным участкам вирусного генома, может указывать как на факт реассортации сегментов генома, так и на наличие рекомбинации внутри сегментов [25]. Однако анализ выравниваний РНК1, РНК2 и РНК3 изолятов TAV с помощью программы RDP4 не выявил рекомбинации в изолятах Rib и GS (данные не представлены). Не обнаружено рекомбинации и при анализе более широкого набора последовательностей, включающего, помимо TAV, полные геномы ряда изолятов других кукумовирусов: CMV, PSV и GfMMV.

Следует отметить, что деревья, построенные по РНК2 и отдельно по ORF2a и ORF2b, практически не различались между собой и были полностью идентичными по набору изолятов TAV в том кластере, в который входят Rib и GS (данные не представлены). Полученные результаты можно, вероятно, объяснить тем, что российские изоляты TAV являются псевдорекомбинантами (реассортантами), в которых РНК2, с одной стороны, и РНК1 и РНК3, с другой, происходят от разных изолятов вируса.

Таким образом, в российских изолятах TAV выявлены признаки реассортации без признаков внутрисегментной рекомбинации. Кластеризации изолятов TAV по географическому принципу или по виду растения-хозяина не обнаружено.

Другое возможное объяснение могло состоять в том, что растения хризантемы были заражены двумя разными изолятами TAV, для одного из которых собраны РНК1 и РНК3, а для другого – РНК2. Для проверки этого предположения прочтения, полученные при HTS обоих образцов, картировали на собранный геном Rib, а затем проводили в них поиск точечных замен и коротких инделей. В анализ также были включены парноконцевые прочтения аналогичной длины (150 нуклеотидов), смоделированные для изолятов PV-0068, PV-0220 и SKO20ST2.

Показано, что полученные в результате HTS прочтения изолятов GS и Rib и смоделированные прочтения изолятов PV-0068, PV-0220 и SKO20ST2 одинаково успешно картировались на референсный геном Rib. Таким образом, при наличии в образцах GS и Rib контаминирующего изолята TAV cо сравнимой идентичностью, его прочтения также должны были картироваться на референсный геном.

Установлено, что подавляющее число замен в прочтениях изолята GS, картирующихся на три геномных РНК Rib, имели аллельную частоту 100%, т.е. не выявлено гетерогенности ни по одной нуклеотидной позиции. Практически не было замен в прочтениях изолята Rib, картируемых на геном Rib. При смешанной инфекции двумя изолятами число замен с невысокой аллельной частотой было бы больше

Следует отметить, что в случае более значительных различий между изолятами GS и Rib и контаминирующим вирусом при сборке de novo собрались бы два контига, по одному для каждого из изолятов. Однако в обоих образцах для каждой из трех РНК TAV собрался только один контиг, соответствующий геномной РНК вируса.

Таким образом, смешанная инфекция образцов GS и Rib двумя разными изолятами TAV не выявлена.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

С помощью метатранскриптомного анализа и ОТ-ПЦР TAV впервые обнаружен на растениях хризантемы сортов Golden Standard и Ribonette, интродуцированных в НБС в 1976 и в 2013 гг., соответственно, из цветоводческих хозяйств, расположенных в Симферопольском районе Республики Крым. До этого TAV выявляли только на местных сортах и гибридах хризантемы [11, 12]. Обнаружение вируса на интродуцированных сортах позволяет предположить, что вирус мог проникнуть в НБС с зараженным посадочным материалом хризантемы упомянутых сортов. Однако на сегодняшний день происхождение ТAV в насаждениях НБС не установлено.

К началу нашей работы в GenBank было депонировано 16 полногеномных последовательностей изолятов TAV, обнаруженных в растениях томата, хризантемы и петунии в различных регионах мира (табл. 1). В данной работе впервые секвенированы полные геномы двух российских изолятов TAV. Установлено, что по организации генома и размерам ORF российские изоляты TAV из хризантемы близки к большинству изолятов вируса независимо от их географической локализации и вида растения-хозяина.

Анализ полногеномных последовательностей российских изолятов TAV выявил признаки реассортации. Поскольку представители рода Cucumovirus и, в частности, TAV имеют сегментированный геном, и каждая из трех геномных РНК инкапсидирована в отдельную вирусную частицу, совместное заражение растения разными изолятами вируса или разными кукумовирусами может приводить к обмену сегментами генома между ними и возникновению реассортантов в потомстве [7]. Возможность образования жизнеспособных реассортантов у кукумовирусов подтверждена экспериментально. Так, получены реассортанты между изолятами CMV, которые относятся к дивергентным подгруппам IA и II. Некоторые из них накапливались в зараженных растениях в большем количестве, чем родительские штаммы, и в силу этого могли успешно закрепляться в популяции [26]. Также получены псевдорекомбинанты, у которых РНК1 и РНК2 происходят от CMV, а РНК3 от TAV (или состоящие из РНК1 и РНК2 TAV и РНК3 CMV) [27]. Помимо экспериментальных реассортантов, выявлено и несколько природных реассортантов кукумовирусов. В Китае на растениях томата обнаружен изолят CMV, который представлял собой реассортант между подгруппами IA (РНК2) и II (РНК1 и РНК3) [28]. Известны природные реассортанты между двумя подгруппами PSV [29], а также между CMV и PSV [30]. Таким образом, разные сегменты генома кукумовирусов потенциально могут иметь разную эволюционную историю. Однако в природных условиях реассортация у кукумовирусов является, по-видимому, достаточно редким событием в силу нежизнеспособности большинства геномных комбинаций, возникающих при смешанных инфекциях [26, 31, 32].

В нашей работе впервые показана возможность внутривидовой реассортации в природных изолятах TAV. Согласно результатам филогенетического анализа, РНК2 изолятов Rib и GS происходит от другого изолята, чем РНК1 и РНК3. Поскольку РНК2 Rib и GS группируется с томатными изолятами TAV, возможно, реассортация у предка (предков) российских изолятов произошла в растениях томата. Известно, что хризантема может быть резерватом TAV, откуда он с высокой эффективностью распространяется тлями на овощные и бахчевые культуры и наоборот [33].

Наряду с мутационной изменчивостью и рекомбинацией, реассортация может играть важную роль в эволюции вирусов с сегментированным геномом, повышая их приспособленность к новому хозяину и приводя к появлению новых видов вирусов [26, 32]. Например, анализ филогенетических деревьев, реконструированных по разным сегментам генома TAV (рис. 2), показывает, что иранский изолят Ker.Mah.P из петунии [8] также, по-видимому, является реассортантом, и именно генетический сдвиг мог способствовать успешной адаптации TAV к новому виду растения-хозяина.

Авторы благодарят Н.В. Смыкову и И.В. Митрофанову за помощь в обследовании коллекции хризантемы Никитского ботанического сада – Национального научного центра РАН.

Работа поддержана грантом Министерства науки и высшего образования РФ № 075-15-2019-1670. Высокопроизводительное секвенирование выполнено с использованием оборудования ЦКП “Геном” ИМБ РАН (http://www.eimb.ru/ru1/ckp/ccu_genome_c.php).

Настоящая статья не содержит исследований с привлечением людей или животных.

Авторы сообщают об отсутствии конфликта интересов.