Молекулярная биология, 2023, T. 57, № 6, стр. 1098-1129

Регуляция синаптической пластичности

Синаптическая пластичность представляет собой изменение силы и чувствительности синапса в ответ на определенную последовательность стимулов и обеспечивается его морфологической и функциональной перестройкой. Эти явления играют ключевую роль при формировании нейронных связей в ходе роста и развития организма, а также в рамках механизмов обучения и памяти. К основным типам синаптической пластичности относятся следующие: кратковременная потенциация (short-term potentiation, STP), кратковременная депрессия (short-term depression, STD), долговременная потенциация (long-term potentiation, LTP) и долговременная депрессия (long-term depression, LTD) (для обзора см. [44]). NCS-1 вовлечен сразу в несколько этих процессов. Хотя этот белок присутствует в головном мозге повсеместно, наиболее богаты им нейроны различных отделов гиппокампа. Особенно много NCS-1 в мшистых волокнах – пучках немиелинизированных аксонов, которые передают информацию из зубчатой извилины в отдел гиппокампа CA3 [45]. Зубчатая извилина гиппокампа – одна из немногих структур мозга, где возможен нейрогенез во взрослом организме. Благодаря этому свойству, зубчатая извилина является основной зоной пластичности во взрослом мозге [46]. При LTP, индуцированной N-метил-D-аспартатом (N-methyl-D-aspartate, NMDA), в гиппокампе крысы экспрессия NCS-1 в нейронах зубчатой извилины заметно повышается [47]. В свою очередь, избыток NCS-1 снижает пороговое значение стимуляции, необходимое для запуска LTP, которое лежит в основе механизмов обработки информации в гиппокампе, позволяющих мозгу распознавать элементы окружения и отличать “новое” от “знакомого” [48, 49]. В гиппокампальных нейронах CA1‒CA3, отвечающих в том числе за пространственную память, NCS-1 индуцирует STP [50]. За счет этой регуляции NCS-1 может способствовать “пробуждению” синапсов, которые прежде находились в неактивном состоянии [51]. Кроме того, NCS‑1 непосредственно задействован в регуляции глутаматзависимой LTD, которая развивается в ответ на активацию метаботропных рецепторов глутамата, регулирующих в этом числе экспрессию NCS-1 [52, 53]. Показано, что для развития глутаматзависимой LTD в нейронах гиппокампа необходимо взаимодействие NCS-1 с Ca²⁺-связывающим белком PICK1 (protein interacting with C kinase-1). Предполагается, что активация глутаматных рецепторов приводит к локальному высвобождению Ca²⁺ из внутриклеточных депо, что позволяет NCS‑1 Ca²⁺-зависимым образом связывать PICK1. В свою очередь, PICK1 индуцирует фосфорилирование и интернализацию ионотропных рецепторов глутаматного типа, AMPA (α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid), и таким образом способствует развитию LTD [54]. Примечательно, что альтернативный, или NMDA-зависимый, путь развития LTD не требует наличия NCS-1 [52]. Наконец, NCS-1 может принимать участие в регуляции LTD и в нейронах мозжечка. Кора мозжечка разделена на продольные компартменты (кластеры), и механизмы двигательного обучения связаны в том числе с Ca²⁺-зависимой индукцией LTD между нейронами, принадлежащими к разным кластерам [55]. NCS-1 входит в число белков, уровень экспрессии которых значительно отличается между соседними кластерами, и, таким образом, рассматривается как возможный участник этих механизмов [56].

Благодаря способности выступать в роли регулятора синаптической пластичности, NCS-1 принимает непосредственное участие в механизмах обучения и памяти. Так, у мышей селективное увеличение экспрессии NCS-1 в зубчатой извилине гиппокампа повышает склонность к исследованию и способствует улучшению краткосрочной и долгосрочной пространственной памяти [48]. У животных дикого типа исследование новой среды и регулярная физическая активность стимулируют увеличение уровня NCS-1 в гиппокампе [42, 57]. Недостаток NCS-1, напротив, подавляет интерес к исследованию, мотивированность, ухудшает пространственную память, провоцирует тревожность и депрессивное состояние [41‒43, 58].

Регуляция нейрогенеза

В связи с тем, что экспрессия NCS-1 значительно выше в развивающемся мозге, чем в зрелом, было сделано предположение о его особой роли в процессах роста и дифференцировки нейронов [59]. Действительно, у млекопитающих NCS-1 считается одним из самых ранних маркеров нервных клеток [30]. Паттерн экспрессии NCS-1 в нервно-мышечных окончаниях, спинном мозге, сердце, а также слуховой, обонятельной и зрительной системах значительно меняется в ходе их развития и часто коррелирует с такими процессами, как рост аксонов и синаптогенез [30‒33, 59‒61]. Примечательно, что в зрелом организме NCS-1, напротив, подавляет рост и ветвление нейритов [62]. Вероятно, это связано с тем, что после созревания нейронов запускаются механизмы, ограничивающие их рост и регенерацию, и NCS-1 может быть в них задействован. В нейроэндокринных клетках, которые способны приобретать черты нейронов под действием фактора роста нервов (nerve growth factor, NGF), подавление активности NCS-1 повышает эффективность роста нейритов [63]. Однако при полной инактивации NCS-1 в нервных окончаниях спинальных ганглиев рост нейритов полностью прекращается [63]. По-видимому, NCS-1 оказывает комплексное воздействие на морфологию нейрональных отростков за счет регуляции гомеостаза Ca²⁺, в результате чего и избыток, и критический недостаток этого белка приводят к серьезным нарушениям структуры и функции нейронов.

Регуляция секреции

Одним из первых открытых свойств NCS-1 была его способность заметно ускорять время отклика моторных нейронов на стимул [12]. Было высказано предположение, что NCS-1 является регулятором экзоцитоза и, таким образом, напрямую воздействует на скорость выброса нейромедиатора. Действительно, в нейроэндокринных клетках надпочечников, где механизмы секреции во многом аналогичны нейрональным, NCS-1 колокализуется с секреторными гранулами и стимулирует выброс их содержимого в ответ на возбуждение пуринергических и гистаминовых рецепторов [64‒66]. NCS-1 также стимулирует секрецию адренокортикотропного гормона клетками таламуса, повышая число образуемых клеткой секреторных пузырьков [67]. В спинном мозге NCS-1 преимущественно локализуется в клетках, секретирующих нейропептид CGRP, и, возможно, участвует в регуляции этого процесса [36].

Примечательно, что в интактных нейроэндокринных клетках избыточная экспрессия NCS‑1 влияет только на агонистзависимую секрецию [68]. По-видимому, воздействие NCS-1 на механизм секреции происходит не напрямую, а при участии белков-посредников. Непосредственно запуск экзоцитоза под действием NCS-1 может происходить за счет высвобождения Ca²⁺ из внутриклеточных резервуаров [65]; при этом сам белок может выступать в роли активатора секреции за счет Ca²⁺-зависимой регуляции фосфатидилинозитол-4-киназы-β (PI4Kβ), катализирующей синтез фосфатидилинозитол-4,5-бифосфата (phosphatidyl inositol-4,5-bisphosphate, PI(4,5)P₂) [13, 65, 69, 70]. Действительно, NCS-1 колокализуется и взаимодействует с PI4Kβ в ряде клеточных линий [65, 69‒73]. Более того, наличие функционально активной формы PI4Kβ необходимо для формирования гранулярных структур в приядерной области, на поверхности которых накапливается NCS-1 [72]. В нейроэндокринных клетках Ca²⁺-связанный NCS-1 способствует мембранной ассоциации PI4Kβ в ответ на возбуждение пуринергических рецепторов клетки [37, 74]. Именно на примере нейроэндокринных клеток наиболее подробно изучена регуляция экзоцитоза под действием NCS-1/PI4Kβ и предложена модель (рис. 2), которая подтверждена многочисленными экспериментальными данными [37, 64, 74‒76]. Согласно этой модели, NCS-1 способствует более эффективному высвобождению внутриклеточного Ca²⁺ при стимуляции клеток молекулами агониста (например, АТФ или брадикинина). Это происходит за счет активации PI4Kβ и повышения уровня фосфоинозитидов PI4P (phosphatidyl inositol-4-phosphate) и PI(4,5)P₂. Последний относится к субстратам фосфолипазы С (PLC) и основным источникам сигнальной молекулы инозитолтрифосфата (IP₃). Связываясь с рецепторами на поверхности ЭПР, IP₃ запускает высвобождение внутриклеточных запасов Ca²⁺, что, в свою очередь, стимулирует секрецию. В клетках с избыточной экспрессией NCS-1 увеличен запас субстрата для PLC и, следовательно, повышен уровень сигнала при воздействии агониста.

Рис. 2.

Примеры внутриклеточной регуляторной активности NCS-1. NCS-1 выполняет регуляцию секреции, Ca²⁺-зависимым образом стимулируя фосфорилирование фосфатидилинозитола (PI) и накопление в мембранах фосфатидилинозитол-4,5-бифосфата (PIP₂). При связывании АТФ с пуринергическими рецепторами (P2Y) происходит активация фосфолипазы С (PLC), которая способствует образованию из PIP₂ сигнальной молекулы инозитолтрифосфата (IP₃). Связываясь с рецепторами (inositol triphospate receptors, InsP₃R) на поверхности ЭПР, IP₃ запускает высвобождение Ca²⁺ из внутриклеточных резервуаров. При повышении внутриклеточного Ca²⁺ возрастает мобильность секреторных везикул и их склонность к слиянию с плазматической мембраной и выбросу содержимого. Одновременно NCS-1 выступает в роли регулятора сигнальных каскадов GPCR (G-protein-coupled receptor). В присутствии Ca²⁺ NCS-1 образует тройной комплекс с рецептором дофамина (D2R) и сопряженной с ним протеинкиназой GRK2, предотвращая фосфорилирование рецептора, его связывание с аррестином, инактивацию и впоследствии интернализацию. В свою очередь, D2R ингибирует аденилатциклазу и тем самым блокирует ряд цАМФ-зависимых сигнальных путей в нейронах.

Взаимодействие NCS-1 с PI4Kβ в нервных клетках менее изучено, хотя качественно образование комплекса между этими белками показано методом коиммунопреципитации [37]. У крыс NCS-1 и PI4Kβ совместно локализуются в дендритах нейронов спинального ганглия, а также в телах и дендритах нейронов гиппокампа [37, 77]. Кроме того, NCS-1 при посредничестве PI4Kβ стимулирует синтез PI4P и регулирует выброс нейромедиаторов норэпинефрина и глутамата из нервных окончаний [78]. В отсутствие NCS-1 в нейронах гиппокампа мышей снижается уровень фактора роста BDNF и число секреторных гранул, содержащих BDNF и дофамин [58]. Добавим, что регуляция секреции под действием NCS-1 может опосредоваться не только PI4Kβ. В синаптических окончаниях нейронов воздействие антител против NCS-1 нарушает Ca²⁺-зависимую секрецию норэпинефрина, но не глутамата [78]. Это может быть связано с различным строением и белковым составом регулируемых NCS-1 секреторных комплексов, содержащих эти нейромедиаторы. Например, в состав норэпинефриновых секреторных гранул входит еще один Ca²⁺-чувствительный белок – CAPS, который также может быть задействован в NCS‑1-зависимой сигнализации. Так, в β-клетках поджелудочной железы антитела против CAPS полностью блокируют эффект NCS-1 на секрецию инсулина [69]. Помимо CAPS выявлен ряд других потенциальных участников NCS-1/PI4Kβ-зависимой регуляции секреции: кальневрон-1, белки-адаптеры клатрина AP1 и AP2, синаптобревин-2, белки группы ARF и APOL3 [79‒83]. Кальневрон-1 конкурирует с NCS‑1 за связывание с PI4Kβ при снижении уровня кальция до <400 нМ и ингибирует активность фермента, тем самым предотвращая спонтанную активацию комплекса NCS‑1/PI4Kβ [80]. Аполипопротеин APOL3 связывается с Ca²⁺-заполненным NCS-1 и способствует образованию комплекса NCS-1/PI4Kβ [79]. NCS-1 колокализуется со всеми белками ARF и Ca²⁺-зависимым образом связывает ARF1 – доказанный сигнальный партнер PI4Kβ [84]. По отдельности и NCS-1, и ARF1 стимулируют активность PI4Kβ, однако в присутствии NCS-1 эффективность ARF1 как активатора фермента значительно снижается. Более того, при совместной экспрессии в нейроэндокринных клетках ARF1 препятствует активации секреции под действием NCS-1. По-видимому, NCS-1 и PI4Kβ могут конкурировать за связывание с ARF1. Таким образом, становится невозможной одновременная активация фермента обоими регуляторными белками и может достигаться дифференцировка сигнальных путей, запускаемых различными стимулами.

Регуляция рецепторов, сопряженных с G-белками

Белок NCS-1 был идентифицирован в качестве регулятора дофаминовой сигнализации [85]. Дофаминовый путь играет ключевую роль в управлении памятью, вниманием и системой вознаграждения, а его нарушения связаны с рядом психоневрологических расстройств, таких как шизофрения, биполярное расстройство и болезнь Паркинсона. Семейство дофаминовых рецепторов относится к сопряженным с G-белками (G-protein coupled receptor, GPCR) и включает пять трансмембранных рецепторов (D1‒D5). В сигнальные комплексы с этими рецепторами входят белки из группы DRIP (dopamine receptor-interacting proteins), среди которых идентифицировано несколько регуляторных Ca²⁺-связывающих белков [86]. В ранних работах методом дрожжевого скрининга было выявлено взаимодействие NCS1-1 с C-концевым участком рецепторов D2, D3 и D5 [85]. Способность NCS-1 связываться с рецептором D2 (D2R) подтвердили и методом аффинного соосаждения. Затем на клеточной модели было продемонстрировано, что избыток NCS-1 препятствует агонистзависимой интернализации D2R. NCS-1 также нивелирует эффект избыточной экспрессии протеинкиназ GRK2 и GRK3, которые фосфорилируют D2R и D3R, на интернализацию этих рецепторов (рис. 2). В присутствии ионов Ca²⁺ NCS-1 коиммунопреципитирует с D2R и GRK2 из клеточных лизатов, что предполагает образование этими белками тройного комплекса. Замечено, что NCS-1 взаимодействует с киназой GRK2 и в отсутствие рецептора и теоретически может регулировать ее активность в отношении как D2R, так и других рецепторов – субстратов этого фермента [87]. В некоторых отделах мозга D2R образует гетеродимеры с аденозиновыми рецепторами A_2AR [88]. Такой гетеродимер может функционировать как агонистзависимый активатор или ингибитор аденилатциклазы ‒ в зависимости от сочетания доступных агонистов или присутствия дополнительных регуляторных белков. Показано, что в нейронах полосатого тела NCS-1 и еще один Ca²⁺-связывающий белок – кальневрон-1 – конкурируют за связывание с гетеродимером D2R/A_2AR при разных концентрациях внутриклеточного Ca²⁺. В этом случае Ca²⁺-NCS-1 предотвращает аллостерическое ингибирование D2R на фоне активации A_2AR и способствует снижению уровня цАМФ, в то время как кальневрон-1 связывается с гетеродимером при большом избытке Ca²⁺ и блокирует оба рецептора [89].

Белок NCS-1 также колокализуется с D2R в синаптических окончаниях нейронов префронтальной коры головного мозга – области высокой пластичности, тесно связанной с когнитивной функцией, – поэтому их взаимодействие может играть важнейшую роль в процессах высшей нервной деятельности [90]. Действительно, влияние NCS-1 на механизмы обучения и памяти связано с его участием в дофаминергической сигнализации [48]. Ингибирование взаимодействия между NCS-1 и D2R в нейронах зубчатой извилины гиппокампа при помощи минимального пептида D2R, способного связываться с NCS-1, приводит к снижению уровня экспрессии дофаминового рецептора в мембранах гиппокампальных нейронов, подавлению NCS-1-индуцированной синаптической пластичности и снижению когнитивной функции у экспериментальных животных. В отсутствие NCS-1 также снижен уровень дофаминергической активности в нейронах прилежащего ядра головного мозга, участвующих в системе вознаграждения и мотивации [41].

Семейство белков GPCR характеризуется сходством структуры и некоторыми общими механизмами активации/десенситизации. В связи с эти логично ожидать, что, помимо дофаминовых рецепторов фреквенин/NCS-1 может связывать и другие мишени среди белков этого семейства. Например, в нейроэндокринных клетках, содержащих избыток NCS-1, усилен ответ на стимуляцию мускариновых рецепторов [91]. NCS-1 и кальневрон-1 конкурируют за связывание с рецептором каннабиоидов CB₁R в нейронах полосатого тела [92]. Кроме гетеродимеров с D2R NCS-1 связывает гомодимеры A_2AR и участвует в Ca²⁺-зависимой регуляции связанных с ним процессов: фосфорилировании протеинкиназ ERK1/ERK2 и AKT [93].

Как уже упоминалось, NCS-1 обладает способностью регулировать протеинкиназы из семейства GRK [87]. Известно, что на 7 генов, кодирующих белки семейства GRK в геноме человека, приходится более 800 генов GPCR, поэтому каждый белок GRK участвует во множестве сигнальных путей, причем не только за счет ферментативной активности [94]. Следовательно, через регуляцию протеинкиназ GRK NCS-1 может не только регулировать десенситизацию самых разных GPCR, но и участвовать в других сигнальных процессах. Необходимо добавить, что NCS‑1 стимулирует синтез PI(4,5)P₂ ‒ фактора мембранной ассоциации и непосредственного активатора ряда GRK [75, 95]. Таким образом, образование комплекса NCS-1 с указанными ферментами совсем не обязательное условие для их регуляции под действием этого Cа²⁺-сенсорного белка, которая может осуществляться им опосредовано [95].

Регуляция ионных каналов

В мозге позвоночных NCS-1 колокализуется с калиевыми каналами А-типа, которыми богаты тела и дендриты нейронов гиппокампа и гранулярных клеток мозжечка [96]. В присутствии Ca²⁺ NCS-1 способствует активации K⁺-каналов, содержащих субъединицы Kv4.2 и Kv4.3, усиливая ток ионов и замедляя их инактивацию [97]. В клеточной модели NCS-1 активирует K⁺-каналы несколько менее эффективно, чем их доказанный регулятор KChIP2 – гомологичный белок из подсемейства НКС, члены которого взаимодействуют с K⁺-каналами (K⁺-channel interacting proteins, KChIPs) [98]. Предполагается, что NCS-1 регулирует внутриклеточный транспорт K⁺-каналов из приядерной области на плазматическую мембрану нейронов. В нейронах симпатической нервной системы NCS-1 снижает эффективность брадикининзависимого закрытия K⁺-каналов M-типа [99, 100]. Вероятно, это происходит за счет активации синтеза PI(4,5)P₂, который необходим для поддержания этих каналов в открытой конформации. NCS-1 участвует в регуляции K⁺-каналов не только в нейронах, но и в клетках в сердечной мышцы. В эмбриональных кардиомиоцитах обнаружена колокализация NCS-1 с Kv4.2, в то время как экспрессия белков KChIP достигает максимума только после рождения [59]. NCS-1 также коиммунопреципитирует с Kv4.3 из лизата миокарда мыши [98]. Хотя в кардиомиоцитах Kv4.3 регулируется KChIP2, последний практически отсутствует в волокнах Пуркинье, которые образуют в сердце специализированную проводящую систему и значительно отличаются по субъединичному составу K⁺-каналов и механизмам регуляции K⁺-тока от других клеток сердечной мышцы. Заметим, что при этом экспрессия NCS-1 в волокнах Пуркинье значительно превышает экспрессию KChIP2 [101]. В условиях in vitro NCS-1 и белок волокон Пуркинье DPP6 проявляют синергический эффект в отношении Kv4.3 и активируют его не менее эффективно, чем KChIP2. Таким образом, NCS-1 и белки KChIP обладают общими мишенями в сердце, но регулируют их в разных типах клеток либо на разных этапах развития сердечной мышцы.

Установлено, что NCS-1 может выступать в роли регулятора потенциалзависимых кальциевых каналов. Например, в хромаффинных клетках он активирует Ca²⁺-каналы N- и P/Q-типов, функция которых в норме регулируется под действием АТФ и опиоидов. Так, введение мутации, препятствующей связыванию Ca²⁺ и, как следствие, активации NCS-1, способствует значительному усилению тока Ca²⁺, что предполагает конститутивную стимуляцию указанных каналов [102]. Этот процесс управляется тирозинкиназами из семейства Src, которые фосфорилируют одну из субъединиц Ca²⁺-канала P/Q-типа [103]. Примечательно, что в другой клеточной модели, на основе нейроэндокринных клеток, рекомбинантный NCS-1 наоборот подавлял ток Ca²⁺ через потенциалзависимые каналы L-, P/Q- и N-типа: Ca²⁺-связанный NCS-1 одновременно снижал чувствительность Ca²⁺-каналов к деполяризации мембраны и способствовал их инактивации после прохождения сигнала [104]. Оказалось, что восприимчивость каналов типа P/Q к действию NCS-1 определяется изоформой регуляторной β-субъединицы, входящей в их состав. Так, каналы, содержащие изоформу β₂, в наибольшей степени подвержены NCS-1-зависимой регуляции. Предполагается, что белок может связывать β-субъединицу и мешать ее включению в состав канала, таким образом препятствуя активации последнего [104]. В нейронах NCS-1, как правило, выступает в роли активатора Ca²⁺-каналов. Это может быть связано с тем, что в нервных клетках, в отличие от нейроэндокринных клеток, преобладают Ca²⁺-каналы, содержащие субъединицу β₃, устойчивую к ингибиторному действию NCS-1 [105]. Так, в чашечках Хельда NCS-1 стимулирует ток Ca²⁺ через каналы P/Q-типа, а в моторных нейронах NCS-1 активирует Ca²⁺-каналы N-типа совместно с фактором роста GDNF [106, 107]. В нейронах верхнего шейного ганглия NCS-1 связывает C-концевой домен α-субъединицы каналов P/Q-типа и замедляет Ca²⁺-зависимую инактивацию этих каналов, опосредуя развитие STP [108, 109]. Таким образом, регуляторная активность NCS-1 в отношении потенциалзависимых Ca²⁺-каналов определяется их субъединичным составом, который, в свою очередь, может зависеть от типа клетки или даже от внутриклеточной локализации канала.

Кроме потенциалзависимых Ca²⁺-каналов NCS-1 взаимодействует и с другими типами каналов для этого катиона. В синаптических окончаниях NCS-1 образует прочный комплекс с Ca²⁺/Na⁺-каналами TRPC5, которые участвуют в регуляции роста нейритов, и Ca²⁺-зависимым образом стимулирует активность этих каналов [63]. NCS-1 также коиммунопреципитирует с рецептором-1 IP₃ (InsP₃R1), который функционирует как Ca²⁺-канал на поверхности ЭПР, и активирует этот рецептор, тем самым запуская всплеск концентрации внутриклеточного Ca²⁺ [110]. Показано, что уровень InsP₃R1 в цитоплазме нейроэндокринных клеток повышается в присутствии избытка NCS-1 и InsP₃R1 обеспечивает локализацию NCS-1 в конусах роста нейронов [91, 111]. NCS-1 также регулирует активность другого IP₃‑рецептора – InsP₃R2 – в сердце эмбриона [39].

Регуляция рецепции

На основании некоторых данных NCS-1 отводится роль Ca²⁺-зависимого модулятора рецепторных систем организма. Например, более 10% от суммарной экспрессии белка приходится на сетчатку глаза [25], где NCS-1 экспрессируется в том числе в фоторецепторных клетках – палочках и колбочках, отвечающих за прием и передачу светового сигнала. Методами иммуногистохимии установлено, что основная часть NCS-1 локализуется во внутренних сегментах и синаптических окончаниях фоторецепторов [112], а по результатам биохимических исследований он присутствует и в наружных сегментах этих клеток, содержащих родоспин и другие компоненты зрительного каскада [113, 114]. Снижение концентрации кальция в этом компартменте после прохождения светового сигнала запускает фосфорилирование (десенситизацию) фотовозбужденного родопсина родопсинкиназой (GRK1), контролируемое при участии НКС рековерина, и активацию фоторецепторных гуанилатциклаз под действием белков GCAP (guanylate cyclase activating proteins), также относящихся к семейству НКС. Все эти события способствуют восстановлению уровня цГМФ и Ca²⁺ и возвращению фоторецепторов к темновому состоянию [115]. В ранних работах показано, что в присутствии Са²⁺ NCS-1 ингибирует фосфорилирование родопсина под действием GRK1 in vitro [5], хотя физиологическая релевантность этого эффекта до сих пор остается недоказанной. Впоследствии была установлена колокализация NCS1 и GRK1 в наружных сегментах палочек сетчатки, а также продемонстрирована способность этих белков образовывать комплекс и даже разрешена кристаллическая структура последнего [113, 114, 116]. Показано также, что при добавлении к препаратам наружных сегментов палочек быка рекомбинантный ортолог NCS-1 – фреквенин – при низких концентрациях кальция (<150 нМ) стимулировал гуанилатциклазную активность [3]. В другом эксперименте NCS-1 также связывал и активировал фоторецепторную гуанилатциклазу ONE-GC, правда, уже при высоких концентрациях Ca²⁺ [117]. В целом, несмотря на имеющиеся данные, регуляторная активность NCS-1 в отношении компонентов зрительного каскада в наружных сегментах фоторецепторов все же требует дальнейших исследований. Добавим, что некоторые сигнальные партнеры NCS-1: InsP₃R1 и GRK2 – присутствуют и во внутренних сегментах фоторецепторов [118, 119]. Так, Ca²⁺-зависимая регуляция IP₃-рецепторов поверхности ЭПР (к ним относится InsP₃R1), в которой NCS-1 задействован в других типах клеток, обеспечивает выживание фоторецепторов в условиях стресса [120]. Функция GRK2 в фоторецепторах точно не выяснена, так как в них отсутствуют ее основные субстраты. Тем не менее недавно показано, что GRK2 может обладать широким интерактомом, который не ограничивается GPCR [87]. Кроме того, потенциальной мишенью NCS-1 могут быть Ca²⁺-каналы L-типа и аденозиновые рецепторы A_2AR, экспрессирующиеся в ленточных синапсах фоторецепторов [121, 122].

Нейропротекторная активность NCS-1

Белок NCS-1 не только вовлечен в процессы роста и созревания нейронов, но и принимает участие в механизмах, обеспечивающих их выживание и восстановление после повреждений. Так, экспрессия NCS-1 в спинальных мотонейронах значительно возрастает после механических или химических повреждений [123]. NCS-1 проявляет нейропротекторную функцию в модели ишемии мозга, уменьшая область повреждения [22]. Нейропротекторные свойства NCS-1, по-видимому, объясняются его участием в PI3K/Akt сигнальном пути. Так, показано, что NCS-1 способствует увеличению содержания фосфатидилинозитол-3,4,5-трифосфата (PI(3,4,5)P₃) в плазматической мембране. С этим фосфоинозитидом связывается протеинкиназа Akt, что увеличивает ее локальную концентрацию на мембране и тем самым стимулирует ее фосфорилирование и активацию. Активированная Akt перемещается в ядро, где фосфорилирует ряд факторов транскрипции, обеспечивающих выживание нейронов [124]. Действительно, экспрессия рекомбинантного NCS-1 в нейронах способствует повышению уровня фосфо-Akt, ускоренному аксональному росту и восстановлению двигательной функции после травмы пирамидного тракта у экспериментальных животных [125].

В ряде исследований выявлена способность NCS-1 нивелировать цитотоксические эффекты ионов кальция. Например, избыточная экспрессия NCS-1 способствует восстановлению нормальной митохондриальной функции и гомеостаза Ca²⁺ в клетках, делеционных по WFS1 ‒ трансмембранному белку, который играет важную роль в транспорте ионов кальция между ЭПР и митохондриями [126]. WFS1 связывает NCS-1 и в комплексе с ним принимает участие в регуляции IP₃-рецепторов на поверхности ЭПР [127]. Таким образом, NCS-1 можно рассматривать в качестве перспективной мишени для терапии синдрома Вольфрама ‒ нейродегенеративного заболевания, ассоциированного с мутациями в гене WFS1. В клетках слуховых ядер ствола мозга в ответ на стресс (абляцию афферентных слуховых нейронов) не только значительно повышается экспрессия NCS-1, но и происходит перераспределение этого белка между синаптическими окончаниями и телом клетки [128]. В связи с тем, что слуховые нейроны отличаются очень высокой активностью, они нуждаются в эффективной регуляции присущей им Ca²⁺-буферной системы [129]. NCS-1 может быстро детектировать локальные повышения концентрации Ca²⁺ и защищать эти нейроны от гибели, ассоциированной с избытком этого катиона. В целом, NCS-1 присутствует во множестве сенсорных систем и может защищать от Ca²⁺-токсичности высокоактивные нейроны, к которым относятся также фоторецепторные клетки [30, 31, 130‒132]. Как уже говорилось, NCS-1 задействован в PI3K/Akt-зависимом сигнальном пути, который запускает механизмы выживания и роста клеток в стрессовых условиях [93, 125, 133]. Именно активация этого пути необходима для сохранения фоторецепторов при светоиндуцированных повреждениях сетчатки и других дегенеративных заболеваниях, таких как пигментный ретинит [134, 135].

Наконец, появляется все больше данных, из которых можно сделать вывод о том, что NCS-1 вовлечен в процессы внутриклеточной антиоксидантной защиты. Например, действуя совместно с фактором роста GDNF, NCS-1 защищает клетки PC12 от апоптоза при воздействии высоких (до 300 мкМ) концентраций H₂O₂ [123]. В кардиомиоцитах в отсутствие NCS-1 развивается уязвимость к окислительному стрессу на фоне присутствия 100 мкМ H₂O₂: повышается доля гибнущих клеток, падает выработка АТФ, снижается уровень митохондриального дыхания и концентрация компонентов дыхательной цепи, происходит деполяризация митохондриальной мембраны [133].

Психические расстройства

Участие NCS-1 в регуляции дофаминергической сигнализации привлекло внимание к этому белку в контексте изучения когнитивных расстройств. У пациентов с шизофренией и биполярным расстройством примерно вдвое повышена экспрессия NCS-1 в префронтальной коре головного мозга [139]. Повышение уровня NCS-1 также коррелирует с возрастной деменцией [140]. В клеточной модели NCS-1 подавляет синтез и протеинкиназа А (protein kinase A, PKA)-зависимое фосфорилирование белка DARPP-32, низкий уровень которого в префронтальной коре ассоциирован с шизофренией [141, 142]. Результатом избыточной активности NCS-1 может быть нарушение регуляции “тормозящих” рецепторов D2 и, как следствие, снижение уровня вторичного мессенджера цАМФ в клетке либо снижение возбудимости нейронов за счет увеличения K⁺-тока [86]. Перечисленные факторы могут способствовать снижению активности префронтальной коры, что характерно для этого заболевания.

Для биполярного расстройства характерны нарушения цикла сна и бодрствования, связанные с дисфункцией пейсмекерных нейронов в среднем мозге, вклад которых в общую электрическую активность мозга проявляется в виде γ-волновых колебаний [143]. Показано, что NCS-1 регулирует кальциевые токи, лежащие в основе γ-волн в нейронах педункулопонтийного ядра. Белок оказывает двухфазный эффект на активность γ-волн: при концентрации 1 мкМ значительно усиливает колебания, а при большом избытке (>10 мкМ), напротив, провоцирует их полное затухание [144]. Предполагается, что активность NCS‑1 опосредована дисрегуляцией двух альтернативных сигнальных путей, в которых задействованы потенциалзависимые Ca²⁺-каналы P/Q-типа, запускающие пробуждение, либо каналы N-типа, поддерживающие фазу быстрого сна [145]. Связываясь с IP₃-рецепторами в ЭПР, NCS-1 может индуцировать повышение внутриклеточного Ca²⁺ и активацию CAMKII-киназ, непосредственно регулирующих активность Ca²⁺-каналов [146]. Ионы лития, которые входят в препараты для лечения биполярного расстройства, препятствуют активации рецептора InsP₃R1 под действием NCS-1, а также нивелируют аномальную активность Ca²⁺-каналов в педункулопонтийных нейронах [110, 147, 148].

Лечение антипсихотическими препаратами не оказывает воздействия на уровень NCS-1 [140, 149‒151]. В то же время нейролептик хлорпромазин, который применяют для лечения шизофрении, связывается с NCS-1 в присутствии Ca²⁺ [152]. В свою очередь, противоэпилептическое средство вальпроат, применяемое для лечения биполярного расстройства, стимулирует экспрессию NCS-1 в передней доле мозга экспериментальных животных [19]. В связи с тем, что взаимодействие между D2R и NCS-1 рассматривается как мишень для антипсихотической терапии, был выполнен скрининг потенциальных ингибиторов этого связывания и выявлен ряд соединений, подавляющих взаимодействие NCS-1 с пептидом D2R. Такая активность выявлена в частности для алкалоидов метерголина, тетрандрина и резерпина [153].

Наркотическая зависимость

В ряде работ показано возможное участие NCS-1 в механизмах, обусловливающих наркотическую зависимость, развитие которой связано с нарушениями дофаминергической сигнализации и проницаемости K⁺-каналов в некоторых отделах мозга [154‒156]. Так, повышенная экспрессия NCS-1 в префронтальной коре у лабораторных животных ассоциирована с большей склонностью к героиновой зависимости [157]. В модели зависимости от морфина экспрессия NCS-1 в миндалевидном теле мозга крысы значительно повышена при абстиненции [158]. Полиморфизм rs1054879 в некодирующей 3'-области гена NCS1 значительно улучшал прогноз лечения от никотиновой зависимости у пациентов с определенным аллелем рецептора D2R [159]. Полиморфизмы rs1342043 и rs7849345 в интроне-1 гена NCS1 ассоциированы с кокаиновой зависимостью [160]. Заметим, что вышеперечисленные мутации не ассоциированы с аминокислотными заменами в белке NCS-1 и не затрагивают известные сайты связывания транскрипционных факторов в регуляторных областях гена NCS1 или в регуляторных микроРНК, так что механизм их действия пока остается неизвестным.

Умственная отсталость, ассоциированная с X-хромосомой

Белок NCS-1 связывается с внутриклеточным доменом белка IL1RAPL1, мутации в котором ассоциированы с наследственной формой умственной отсталости [161]. IL1RAPL1 представляет собой трансмембранный нейрональный белок, гомологичный рецептору интерлейкина-1 и Toll-подобным рецепторам. IL1RAPL1 локализуется в синаптических окончаниях нейронов, где он связывается с гуанилаткиназой PSD-95 и принимает участие в регуляции механизмов синаптогенеза и синаптической пластичности [162]. Мутации в гене IL1RAPL1 ассоциированы с серьезными когнитивными нарушениями при отсутствии видимых дефектов развития мозга [163]. Показано, что IL1RAPL1 совместно с NCS-1 участвует в регуляции потенциалзависимых Ca²⁺-каналов N-типа [164], однако прямых указаний на участие NCS-1 в патологическом механизме, связанном с активностью мутантного IL1RAPL1, пока не выявлено.

Расстройства аутистического спектра

Расстройства аутистического спектра (РАС) – группа заболеваний, связанных с нарушениями развития нервной системы, которые выражаются в повторяющемся поведении и сниженной способности к коммуникации. Интересно, что у экспериментальных животных с фенотипом Ncs1^‒/‒ регистрируют нарушения социального поведения и когнитивной функции, сходные с теми, которые наблюдаются у пациентов с РАС [165]. NCS-1 также входит в число белков, мутации в генах которых ассоциированы с аутизмом [166]. Например, у одного из таких пациентов обнаружена замена R102Q в составе Ca²⁺-связывающего центра белка [167]. Наличие этой мутации приводит к общей дестабилизации NCS-1 и значительным структурным перестройкам в его C-концевой области, а также к изменению динамики связывания белка с клеточными мембранами. Указанные факторы могут приводить к нарушению функции NCS-1 в клетке и лежать в основе дефектов Ca²⁺-сигнализации при РАС [168].

Болезнь Паркинсона

Уровень экспрессии NCS-1 существенно снижен у пациентов с болезнью Паркинсона – нейродегенеративным заболеванием, связанным с нарушением функции дофаминовых рецепторов и утратой синаптической пластичности в черной субстанции, а также гибелью пейсмекерных нейронов в этом отделе головного мозга [130]. Дофаминергические нейроны черной субстанции характеризуются интенсивным метаболизмом и высоким содержанием Ca²⁺, что делает их особенно уязвимыми к окислительному стрессу и токсичности, вызванной избытком Ca²⁺ [169]. Показано, что в пресинаптических окончаниях нейронов черной субстанции NCS-1 Ca²⁺-зависимым образом регулирует D2A-ауторецепторы дофамина, активность которых нарушена при болезни Паркинсона [170]. Эта регуляция контролируется током Ca²⁺ через потенциалзависимые каналы L-типа Cav1.3, которые рассматривают в качестве мишеней для лечения болезни Паркинсона [130, 171]. NCS-1 также связывается с митохондриальным белком PINK1 (PTEN-induced putative kinase 1), мутации в гене которого у людей ассоциированы с наследственными формами болезни Паркинсона, однако физиологическая роль этого взаимодействия до сих пор не выяснена [81]. В выживших нейронах черной субстанции наблюдается, напротив, компенсаторное повышение экспрессии NCS-1, что, по-видимому, способствует их адаптации к избыточным уровням дофамина и/или ионов Ca²⁺ и выживанию при этом заболевании, то есть выполняет нейропротекторную функцию [172]. Действительно, в модели болезни Паркинсона подавление экспрессии NCS1 значительно снижает выживаемость клеток [130]. Фенотип Ncs1^‒/‒ также характеризуется снижением экспрессии ряда белков: компонента комплекса I дыхательной цепи митохондрий ND1, митохондриальных белков-разобщителей UCP4 и UCP5, гликолитической енолазы ENO2, редоксчувствительного шаперона и фактора транскрипции DJ-1 и Ca²⁺-каналов Cav2.3 [173]. Эти изменения могут быть частью механизма адаптации, направленного на защиту нейронов от источников стресса, который выражается в снижении внутриклеточной концентрации Ca²⁺ и интенсивности митохондриальной функции.

Болезнь Альцгеймера

Экспрессия NCS-1 в мозге значительно повышена при болезни Альцгеймера – нейродегенеративном заболевании со сложной этиологией, связанной в том числе с утратой связей между нейронами в результате формирования в нервной ткани бляшек из неправильно свернутого β‑амилоида [174]. На животной модели (дрозофила) показано, что восстановление моторной функции и числа синаптических окончаний, которые были утрачены в ходе патологических процессов, вызванных токсичным амилоидным пептидом Aβ42, может быть достигнуто за счет стабилизация комплекса ортолога NCS-1 – фреквенина – с белком Ric8a [175]. Этот белок колокализуется с фреквенином и связывается с ним при низком уровне Ca²⁺. Будучи регулятором GPCR, Ric8a стимулирует нейротрансмиссию и регулирует развитие нейрональных отростков. Предполагается, что фреквенин может играть роль Ca²⁺-зависимого регулятора Ric8a, ингибируя его активность в состоянии покоя и высвобождая его в ответ на сигнал Ca²⁺ [176]. Кроме регуляции нейротрансмиссии (через регуляцию аналогов Ric8a или другие пути), потенциальная роль NCS-1 при болезни Альцгеймера может быть связана с его нейропротекторной активностью. Таким образом, повышение экспрессии белка NCS-1 при этом заболевании может быть важным компенсаторным механизмом.

Молекулярные свойства NCS-1

Как и другие белки НКС, NCS-1 представляет собой α-спиральный белок, содержащий четыре Ca²⁺-связывающих мотива типа EF-hand (EF1–EF4). EF1 и EF2 вместе составляют N-концевой, а EF3 и EF4 – C-концевой домены белка. Указанные домены соединены линкером, содержащим консервативный остаток глицина, что обусловливает их конформационное вращение друг относительно друга. Каждый мотив EF-hand состоит из двух α-спиралей и расположенной между ними петли. Ион кальция координируется атомами кислорода основной и боковой цепи остатков аспартата и/или глутамата в 1(x), 3(y), 5(z), и 12(‒z) положениях петли, карбонильным кислородом пептидной связи в 7(‒y) позиции петли, а также кислородом молекулы воды, ассоциированной с остатком в 9(‒x) положении петли за счет водородных связей [178]. В центре петли находится короткий β-тяж из трех аминокислотных остатков (это единственная β-структура в белках НКС). При связывании иона кальция происходит смещение α-спиралей мотива EF-hand вокруг остатка глицина в позиции 6 петли, что переводит его в открытую конформацию. Во всех НКС, включая NCS-1, EF1 не способен связывать Ca²⁺ из-за присутствия не координирующих этот металл остатков лизина и цистеина в позициях 1 и 3 соответственно, а также Pro в позиции 4 [179]. Для NCS-1 позвоночных животных были получены кристаллические структуры Ca²⁺-связанных форм немиристоилированного белка человека и крысы (PDB 1G8I и 5AEQ соответственно) [18, 116]. Кроме того, трехмерная структура немиристоилированного Са²⁺-заполненного NCS-1 человека разрешена методом ЯМР-спектроскопии (PDB 2LCP) [180]. Согласно последней, белок содержит 9 α‑спиралей, 4 коротких β-тяжа (в составе Ca²⁺‑связывающих сайтов EF-hand) и 3 неструктурированные петли (между EF1 и EF2, между EF3 и EF4 и после EF4).

N-конец NCS-1 подвергается котрансляционному миристоилированию под действием N-миристоилтрансферазы-1, причем белок присутствует в клетке исключительно в такой форме, что подтверждено данными масс-спектрометрического анализа [181]. Как и в большинстве НКС, миристоильная группа NCS-1, во-первых, отвечает за его связывание с клеточными мембранами и, во-вторых, необходима для поддержания структуры конформеров белка. В отсутствие Ca²⁺ она погружена внутрь молекулы белка, образуя многочисленные контакты с гидрофобной сердцевиной глобулы [182‒184]. В общем случае миристоильная группа играет роль своего рода шаперона для белков НКС: набор взаимодействующих с ней остатков и соответствующая структура апоформы белка уникальны для каждого представителя семейства. При связывании кальция у части НКС (GCAPs) миристоильная группа остается внутри структуры белка, в то время как у другой части (рековерин, VILIP-1, нейрокальцин-δ и гиппокальцин) участвует в механизме, называемом Ca²⁺-миристоильным переключателем. В последнем случае конформационные перестройки в ответ на координацию кальция EF-hand-мотивами приводят к экспонированию в раствор как миристоильной группы (чтобы впоследствии обеспечить связывание белка с мембранами), так и остатков, исходно формирующих для нее гидрофобный карман в структуре белка. Экспонированные остатки гидрофобного кармана образуют контакты с мишенями белков НКС. NCS-1, по-видимому, не имеет функционального Ca²⁺-миристоильного переключателя. Некоторые уникальные элементы структуры этого белка обеспечивают необычный, Ca²⁺-независимый, характер его взаимодействия с мембранами, в котором однако принимает участие миристоильная группа (см. раздел “Связывание с мембранами”); при этом наличие последней в значительной степени определяет структуру не только бескальциевой, но и Ca²⁺-связанной формы белка [185]. Играя ключевую роль в мембранной ассоциации NCS-1, миристоильная группа обеспечивает правильную внутриклеточную локализацию белка, а также его функциональную активность. Так, в отсутствие миристата NCS-1 утрачивает способность активировать PI4Kβ и ингибировать потенциалзависимые Ca²⁺-каналы N-типа, хотя сохраняет некоторые другие функции: например, способность индуцировать STP в нейронах гиппокампа [50, 72, 104, 186].

Главное отличие структуры NCS-1 от других НКС заключается в наличии протяженного гидрофобного кармана, сформированного остатками как из N-концевого, так и из C-концевого доменов белка. Доступность этого кармана и, как следствие, уникальное строение мультифункционального сайта связывания мишеней NCS-1 в значительной степени обеспечивается структурой его так называемого “C-концевого сегмента” – участка P177‒V190 полипептидной цепи (рис. 4а) [114, 187]. В кристалле это последняя, десятая, α‑спираль белка (рис. 4б), в то время как в ЯМР-структуре эта область неструктурирована и образует множественные контакты с поверхностью открытого гидрофобного кармана на всем его протяжении (рис. 4в) [180]. За счет этого взаимодействия C-концевой сегмент значительно стабилизирует Ca²⁺-связанную форму NCS-1: при его удалении белок приобретает менее компактную и более динамичную структуру, а также склонность к образованию димеров [116, 188]. Согласно молекулярно-динамическим моделям, удаление C-концевого сегмента модифицирует структуру белка примерно так же, как повышение температуры на 6°С [189]. Важно, что в отсутствие мишени С-концевой сегмент Са²⁺-заполненного NCS-1 прикрывает остатки гидрофобного кармана, одновременно поддерживая конформационную стабильность молекулы [180]. В присутствии мишени (например, D2R) C-концевой сегмент NCS-1 смещается, открывая доступ к соответствующему ей сайту [190] (см. раздел “Взаимодействие с белками-мишенями”).

Рис. 4.

Молекулярная структура NCS-1. а ‒ Схема доменной структуры NCS-1. б ‒ Кристаллическая структура Ca²⁺-связанной формы NCS-1 (PDB 5AEQ). в ‒ ЯМР-структура Ca²⁺-связанного NCS-1 (PDB 2LCP). Цветом выделены нефункциональный (голубой) и функциональные (синий) EF-hand-мотивы и C-концевой сегмент (розовый). Ионы кальция представлены желтыми сферами.

Связывание кальция и магния

Белок NCS-1 характеризуется относительно высоким сродством к ионам кальция [191]. Миристоилирование NCS-1 приводит к повышению его Ca²⁺-чувствительности, а также обусловливает кооперативность связывания ионов этого металла [68, 192, 193]. Миристоилированный NCS-1 последовательно связывает три иона Ca²⁺ с константами диссоциации, равными 60 мкМ, 53 нМ и 377 нМ, причем для первых двух сайтов характерна кооперативность связывания [193]. Установлен следующий порядок заполнения сайтов в миристоилированном NCS-1: EF2 → EF3 → EF4, где EF2 обладает наименьшим, а EF3 наибольшим сродством к Ca²⁺ [192]. Координация Ca²⁺ вызывает последовательные конформационные изменения в NCS-1, в результате которых возрастает α‑спиральность и гидрофобность поверхности белка, что свидетельствует об экспонировании остатков гидрофобного кармана, по всей видимости, участвующих в связывании мишеней [191, 193, 194]. Помимо кальция NCS-1 обладает сравнительно высоким сродством к Mg²⁺: миристоилированный белок некооперативно связывает два таких иона со средней константой 17 мкМ [191]. В присутствии физиологических концентраций Mg²⁺ (порядка 0.9 мМ) сродство белка к Ca²⁺ снижается: соответствующая усредненная константа диссоциации возрастает с 90 до 440 нМ [195]. Магний связывается в EF2 и EF3, из которых вытесняется кальцием, при этом EF4 остается исключительно Ca²⁺-связывающим сайтом [191]. В то время как координация кальция значительно стабилизирует NCS-1, обеспечивает восстановление его структуры после воздействия денатурирующих агентов и защищает белок от трипсинового протеолиза, связывание магния лишь частично стабилизирует апоформу и снижает ее поверхностную гидрофобность [185, 191, 194]. Величина сродства NCS-1 к кальцию в присутствии магния (300‒400 нМ) согласуется с предполагаемой регуляторной функцией NCS-1 в синаптических окончаниях нейронов, для которых характерны изменения уровня внутриклеточного Ca²⁺ как раз в субмикромолярном диапазоне. Таким образом, в синапсах NCS-1, по-видимому, быстро реагирует на небольшие локальные изменения концентрации кальция в условиях, когда другие Ca²⁺-сенсоры (кальмодулин, рековерин, VILIP-1) еще неактивны.

Связывание с мембранами

Практически во всех типах тканей, где был обнаружен NCS-1, он локализуется в примембранном слое [27, 73]. Связывание с клеточными мембранами играет важнейшую роль в функциональной активности всех белков НКС, поскольку позволяет им компартментализоваться с белками-мишенями. NCS-1 отличается тем, что обладает высоким сродством к мембранам не только в присутствии, но и в отсутствие ионов Ca²⁺. Так, при фракционировании мозгового вещества надпочечников в присутствии хелатора Ca²⁺ NCS-1 обнаружен как в цитоплазматической, так и в микросомальной фракциях [66]. Сведения о Ca²⁺-чувствительности связывания NCS-1 с очищенными клеточными мембранами противоречивы: в одной работе [68] для него не обнаружено Ca²⁺-зависимости при связывании с мембранами из мозга крысы, в другой [117] он Ca²⁺-зависимо связывался с мембранами гиппокампа быка. Однако в условиях клетки мембранная локализация NCS-1 все же обладает слабой, но достоверной чувствительностью к изменениям концентрации внутриклеточного Ca²⁺. Например, в нейроэндокринных клетках открытие Ca²⁺-каналов в ответ на стимуляцию пуринергических рецепторов способствует повышению доли мембранной формы NCS-1 с 75 до 90% [37]. Наиболее вероятно, что в отсутствие Ca²⁺ мембранная и растворимая формы NCS-1 находятся в динамическом равновесии, а в присутствии Ca²⁺ это равновесие смещается в сторону мембранной формы, то есть связывание NCS-1 с мембранами все же Ca²⁺-зависимый процесс [167]. Примечательно, что эта Ca²⁺-зависимость нарушается при внесении замены R102Q, ассоциированной с аутизмом: наличие мутации приводит к “замораживанию” бескальциевой формы белка на мембране [167].

Отсутствие функционального Са²⁺-миристоильного переключателя у NCS-1 и, как следствие, лишь частичная обратимость его взаимодействия с клеточными мембранами, по всей видимости, обеспечивается уникальными элементами его структуры, отсутствующими у других НКС. Например, такую роль может играть N-концевая α-спираль белка между сигналом миристоилирования и EF1-мотивом. Так, если внести эту последовательность в НКС с функционирующим Ca²⁺-миристоильным переключателем – в гиппокальцин, ‒ то он приобретает способность связываться с мембранами в отсутствие Ca²⁺, подобно NCS-1. Высказано предположение, что жесткая структура этой α-спирали, стабилизированная водородными связями между боковыми группами остатков E14‒R18 и E15‒K19, фиксирует N-конец и миристоильную группу белка в экспонированном положении [196]. В связывании NCS-1 с мембранами могут быть задействованы и другие элементы его структуры, такие как С-концевой сегмент. Например, пересадка этого участка из рековерина (НКС с функционирующим Ca²⁺-миристоильным переключателем) в NCS-1 придает последнему способность взаимодействовать с фоторецепторными мембранами с более низким сродством, однако полностью обратимым Ca²⁺-зависимым образом. Эти данные позволяют предположить, что С-концевой сегмент регулирует обратный захват миристоильной группы бескальциевой формой NCS-1 [114].

Сродство белков НКС к различным клеточным мембранам существенно различается, что может определяться их чувствительностью к липидному составу, регулируемой с помощью специальных аминокислотных остатков, расположенных на N-конце этих белков вблизи миристоильной группы [197‒199]. Например, NCS-1 проявляет повышенное Ca²⁺-зависимое сродство к PI4P и фосфатидилсерину (PS) (K_d = 12 мкМ), однако связывается с различающимися по фосфолипидному составу гиппокампальными и фоторецепторными мембранами Са²⁺-независимым образом [193, 200, 201]. В последнем случае связывание в меньшей степени зависит от миристоилирования и более чувствительно к замене N-концевых остатков: K3, K7 и/или K9, ‒ что отражает сродство белка к отрицательно заряженным фосфолипидам. Среди мажорных фосфолипидов мембраны NCS-1 действительно предпочитает PS и PI, причем взаимодействие с первым ингибируется в результате замен указанных N-концевых лизинов белка. Интересно, что NCS-1 также связывается с фосфоинозитидами, преимущественно PI3P, причем для этого сигнального фосфолипида предусмотрен специальный сайт в N-концевом домене, что говорит о важности указанного взаимодействия для сигнальной функции белка [201].

Многие белки-участники синаптической передачи, включая белки комплекса SNARE и Ca²⁺-каналы Cav2.1, входят в состав устойчивых к действию детергентов мембранных микродоменов или “рафт-структур” (detergent-resistant membranes, DRM), обогащенных холестерином [202]. Подобная организация обеспечивает колокализацию регуляторных белков и их мишеней и быстрый ответ на локальные сигналы Ca²⁺. Показано, что при стимуляции брадикинином нейроэндокринных клеток NCS-1 в них переходит в DRM, которые обогащены не только холестерином, но и PI(4,5)P₂ [203]. Интересно, что NCS-1 и белки SNARE присутствуют в разных микродоменах и NCS-1, судя по всему, не является прямым регулятором компонентов экзоцитоза, а управляет этим процессом опосредованно ‒ за счет модуляции гомеостаза Ca²⁺ в синаптических окончаниях [68]. Основной белковый компонент DRM ‒ кавеолин-1. Это трансмембранный каркасный белок, обладающий регуляторной активностью в отношении различных сигнальных белков. Оказалось, что в фоторецепторных клетках сетчатки NCS‑1, как и некоторые другие НКС, может взаимодействовать с кавеолином-1 в составе мембран. Образование комплекса происходит за счет взаимодействия с каркасным доменом 1‒101 белка. Примечательно, что с кавеолином-1 связывается только бескальциевая форма NCS-1. Таким образом, посредством связывания с кавеолином-1 NCS-1 может удерживаться на мембранах (в DRM) при низком уровне кальция, что, по-видимому, усиливает его активность или обеспечивает более быстрые ответы на Ca²⁺-сигналы, в том числе в рамках каскада фототрансдукции [113].

Взаимодействие с белками-мишенями

На основании структурного анализа комплексов NCS-1 с большинством сигнальных партнеров можно заключить, что в этих взаимодействиях участвует протяженный сайт в молекуле Са²⁺-сенсора, который состоит из консервативных остатков гидрофобного кармана и доступ к которому регулируется при участии C-концевой области белка. Например, дрожжевой фреквенин Ca²⁺-независимым образом связывает N-концевой участок Pik1 – ортолога PI4K позвоночных – в соотношении 1 : 1 с константой диссоциации порядка 140 нМ [181]. При этом взаимодействии C-концевой сегмент фреквенина смещается, высвобождая остатки гидрофобного кармана, которые, в свою очередь, образуют контакты с двумя гидрофобными α-спиралями Pik1 (125‒136 и 156‒169 а.о.), соединенными неупорядоченным U-подобным участком. Указанные спирали связываются в антипараллельной ориентации: N-концевой участок фрагмента Pik1 в C-концевом домене фреквенина, а C‑концевой участок Pik1 в N-концевом. Подобный характер связывания может служить объяснением механизму активации Pik1: при взаимодействии с фреквенином полипептидная цепь киназы изгибается таким образом, чтобы регуляторный домен LKU на N-конце молекулы сближался с киназным доменом на ее C-конце и активировал последний [204]. NCS-1 взаимодействует с Pik1 по такому же механизму и с таким же сродством (150 нМ) [17].

Аналогичная конфигурация взаимодействия наблюдается и в случае D2R. В присутствии Ca²⁺ NCS-1 связывает C-концевой участок рецептора D2 (430‒444 а.о.) в соотношении 1 : 2 с константой диссоциации, равной 14 мкМ (по другим данным 40 мкМ) [116, 190]. Оба участка образуют α‑спирали, причем одна из них связывается в N-концевом домене NCS-1, а вторая – в C-концевом домене, ориентируясь C-концами навстречу друг другу (рис. 5а) [116, 190]. Наиболее выраженные перестройки в молекуле NCS-1 при связывании D2R происходят в области петли между EF3 и EF4, которая, как и C-концевой сегмент, отличается вариабельностью среди белков семейства и, таким образом, может отвечать за формирование уникальных сайтов связывания белков-партнеров. Однако С-концевой сегмент белка также участвует в общем структурировании комплекса, принимая конформацию, состоящую из двух коротких α-спиралей (177‒180 и 184‒188 а.о.), соединенных петлей. Одновременное связывание двух молекул D2R может иметь важное физиологическое значение с учетом того, что этот рецептор функционирует в виде димера.

Рис. 5.

Структуры комплексов NCS-1 с белками-мишенями. а ‒ Комплекс NCS-1 с двумя фрагментами (430‒444 а.о.) рецептора дофамина D2R (PDB 5AER). б ‒ Комплекс NCS-1 с фрагментом (1‒25 а.о.) GRK1 (PDB 5AFP). Цветом выделены остатки гидрофобного кармана, образующие интерфейс связывания мишени (оранжевый), С-концевой сегмент (розовый), фрагменты D2R (зеленый) и GRK1 (бирюзовый).

В случае еще одной потенциальной мишени NCS-1 – GRK1 (родопсинкиназы) ‒ в связывание с NCS-1 вовлекается тот же ее N-концевой участок (1‒25 а.о.), что и при связывании с другим НКС – рековерином, доказанным модулятором активности фермента в сетчатке [205]. В то же время положение пептида GRK1 в молекуле NCS-1 заметно отличается от такового в рековерине: он располагается в глубине гидрофобного кармана белка между N- и C-концевыми доменами (рис. 5б). Подобное положение также регулируется C-концевым сегментом NCS-1, который в присутствии мишени смещается, утрачивая значительную часть контактов с остальной молекулой белка [114, 116, 206]. Роль C-концевого сегмента NCS-1 в организации GRK1-связывающего сайта подтверждается тем фактом, что замена этого участка на соответствующую последовательность рековерина существенно сказывается на эффективности ингибирования ферментативной активности GRK1 [114].

Структуры комплексов NCS-1 с другими мишенями пока не разрешены, однако и здесь косвенные данные указывают на гидрофобный карман и С-концевой сегмент как основные элементы структуры, опосредующие взаимодействие. Например, комплекс NCS-1/фреквенина с белком Ric8a эффективно разрушается при добавлении антипсихотических препаратов фенотиазинов, которые образуют контакты одновременно с остатками гидрофобного кармана и C-концевого сегмента NCS-1 и таким образом, вероятно, заякоривают последний в гидрофобном кармане, препятствуя связыванию мишени [207, 208]. Связывание Ric8a в гидрофобном кармане NCS-1 происходит даже в отсутствие кальция [176]. Это подтверждается тем фактом, что низкомолекулярные соединения, которые вытесняют C-концевой сегмент из гидрофобного кармана, стабилизируют соответствующий комплекс [175]. Ca²⁺-зависимое связывание NCS-1 с супрессорным доменом рецептора InsP₃R1 (66‒110 а.о.) также происходит с участием гидрофобного кармана, поскольку ключевую роль в нем играет остаток L89, входящий в состав этой структуры и принимающий участие в связывании других мишеней, включая D2R и GRK1 [206, 209]. В механизме Ca²⁺-независимого взаимодействия NCS-1 с IL1RAPL1 остатки гидрофобного кармана не задействованы, однако внутриклеточный домен IL1RAPL1 (549‒644 а.о.) связывается непосредственно с C-концевым сегментом NCS-1 [161]. Установлено, что мутация R102Q, ассоциированная с аутизмом, не сказывается на этом взаимодействии, однако затрудняет погружение С-концевого сегмента в гидрофобный карман и стабилизирует последний в открытом положении, потенциально снижая специфичность регуляторной активности NCS-1. Действительно, в структуре NCS-1 присутствует сеть ионных взаимодействий между остатками C-концевого сегмента и белковой глобулой, в то время как мутация R102Q приводит к перестройке этой сети и утрате C-концевым сегментом характерной для него гибкости [167, 210, 211]. Это приводит, например, к повышению эффективности связывания NCS-1 с D2R, что может также играть роль в патогенезе аутизма, ассоциированного с мутацией R102Q [190, 212].

В целом, гибкий и подвижный C-концевой сегмент NCS-1 регулирует доступ к гидрофобному карману белка, формируя специфический сайт связывания для каждой из его мишеней. В отличие от остатков гидрофобного кармана, С-концевой сегмент NCS-1 уникален среди белков НКС и вследствие этого представляет собой удобную мишень для перспективных лекарственных препаратов, направленных на селективное подавление аберрантной функции NCS-1 без воздействия на другие белки НКС. Роль C-концевого сегмента в качестве внутреннего ингибитора NCS-1 подтверждена в ряде исследований. В общем случае добавление к белку пептида, имитирующего C-концевой сегмент, в высокой концентрации блокирует функциональную активность NCS-1, конкурируя за взаимодействие с его мишенями. Например, введение избытка C-концевого пептида в синапсы экспериментальных животных полностью нейтрализует способность NCS-1 активировать синаптическую передачу [106]. Кроме того, как упоминалось выше, одним из вариантов таргетной терапии в отношении активности NCS-1 может быть использование низкомолекулярных соединений, регулирующих подвижность его C-концевого сегмента. Подобные подходы имеют терапевтический потенциал при таких патологиях как синдром хрупкой X-хромосомы, болезнь Альцгеймера и др. [175, 208].

Связывание ионов цинка

Недавно продемонстрировано, что помимо кальция и магния NCS-1 связывает ионы цинка, причем апоформа белка связывает три Zn²⁺ в два высокоаффинных (106 нМ) и один низкоаффинный (4 мкМ) сайт, в то время как магниевая и кальциевая формы, доминирующие в физиологических условиях, связывают по два иона цинка с субмикромолярным сродством. Цинксвязывающие сайты, по-видимому, перекрываются с EF-hand-мотивами: высокие концентрации цинка вытесняют магний из этих мотивов и снижают стехиометрию связывания кальция с белком. При насыщении цинком NCS-1 проявляет в 14 раз большее сродство к кальцию в одном из сайтов, что повышает общую чувствительность белка к ионам этого металла. Важно, что заполнение Zn²⁺-связывающих сайтов оказывает выраженные, но разнонаправленные эффекты на вторичную структуру, конформационное состояние и, как следствие, функциональные свойства NCS-1. Так, высокоаффинное связывание цинка повышает термостабильность бескальциевой формы NCS-1 и способствует взаимодействию его Са²⁺-связанной формы с белками-мишенями, такими как D2R и GRK1. Напротив, низкоаффинное связывание цинка способствует агрегации NCS-1, сопровождающейся образованием патологических скрученных макроструктур белка. Таким образом, результатом сложных взаимозависимых взаимодействий NCS-1 с магнием, кальцием и цинком является появление разнообразных конформаций белка, что, в свою очередь, модулирует его функциональный статус [213].

В целом, способность воспринимать колебания концентраций внутриклеточного цинка, по-видимому, относится к общим свойствам белков НКС, которые могут быть условно разделены на три категории: устойчивые к цинку Ca²⁺-сенсорные белки; физиологические сенсоры Ca²⁺ и Zn²⁺, способные координировать мобильный цинк; а также патологические сенсоры Ca²⁺ и Zn²⁺, связывающие цинк в только аномально высоких концентрациях, что приводит к их денатурации и агрегации [214]. NCS-1 занимает промежуточное положение в этой классификации и в определенных условиях может выступать в роли как физиологического, так и патологического сенсора цинка. Содержание цинка в нервной ткани чрезвычайно высокое, однако его свободная концентрация строго регулируется за счет работы системы цинковых транспортеров и высокоаффинных Zn²⁺-буферных белков, а также менее аффинных Zn²⁺-регуляторных белков, обеспечивающих перенос и передачу мишеням мобильного цинка [215]. В этом случае аберрантное повышение концентрации полностью высвободившегося цинка вызывает мощный нейротоксический эффект, ассоциированный с рядом нейродегенративных и нейроофтальмологических заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера, возрастная макулярная дегенерация и глаукома [216‒218]. Можно предположить, что NCS-1 не только осуществляет взаимосвязь между Ca²⁺-зависимыми и Zn²⁺-зависимыми сигнальными путями в здоровых нейронах, но и служит одним из триггеров, которые опосредуют инициацию патологических механизмов, ассоциированных с нейротоксичностью цинка.

Редокс-регуляция

Примечательно, что повышение концентрации как мобильного (находящегося в составе сравнительно лабильных комплексов с сигнальными белками), так и свободного цинка в клетке часто связано с окислительным стрессом [216]. В этих условиях цинк может высвобождаться из буферных белков (преимущественно металлотионеинов) в ответ на окисление остатков цистеина, входящих в состав высокоаффинных сайтов связывания этого металла (“цинковых пальцев”) [219]. Как уже говорилось, NCS-1 может обеспечивать выживаемость клеток в условиях окислительного стресса. Таким образом, помимо опосредованных эффектов можно предположить наличие у него собственной редоксчувствительности, то есть способности изменять конформацию и сигнальную активность в ответ на изменение окислительно-восстановительного (редокс) потенциала клеточной среды. Действительно, некоторые НКС, такие как VILIP-1 и рековерин, ‒ это редоксзависимые белки [220‒222]. В случае рековерина это свойство обеспечивается за счет единственного в его структуре, консервативного среди НКС, остатка цистеина (в структуре нефункционального EF1-мотива), окисление которого приводит к образованию дисульфидного димера (dRec) и/или окисленного мономера (с образованием остатка сульфеновой или сульфиновой кислот) белка ‒ с измененной функциональной активностью [223, 224]. Важно отметить, что накопление dRec удалось зафиксировать непосредственно в клетках сетчатки, которая среди всех тканей организма наиболее уязвима для окислительного стресса [220‒224]. Так, фоторецепторы обладают высокой метаболической активностью, характеризуются высоким уровнем потребления кислорода и уровнем внутриклеточного Ca²⁺, а также постоянно подвергаются световому облучению и содержат значительное количество фоточувствительных молекул, которые генерируют активные формы кислорода в ответ на облучение светом. Кроме того, фоторецепторные мембраны обогащены полиненасыщенными жирными кислотами, которые особенно восприимчивы к окислительным повреждениям [225‒227]. NCS-1 находится в аналогичных условиях, поскольку интенсивно экспрессируется в нейронах сетчатки (включая фоторецепторы) и содержит единственный остаток цистеина в том же положении, что и рековерин. Более того, в ранних работах, посвященных исследованию структурно-функциональных свойств рекомбинантного немиристоилированного NCS-1, показано, что поверхностная доступность сульфгидрильной группы этого остатка цистеина может изменяться при связывании физиологических катионов (Mg²⁺ или Ca²⁺), а значит не исключено ее участие в механизмах редокс-регуляции [194].

Недавно с использованием клеточной модели показано, что NCS-1 действительно является редоксчувствительным белком, реагируя на окисляющие условия образованием дисульфидного димера (dNCS-1), который накапливается в клетке в виде точечных скоплений в перинуклеарной области [228]. Формирование dNCS-1 представляет собой структурно детерминированный процесс, который не зависит от уровня внутриклеточного кальция, однако стимулируется при повышении концентрации свободного цинка, то есть в условиях, свойственных окислительному стрессу. Важно отметить, что окисленный белок обладает измененной чувствительностью к кальцию и функциональной активностью: связывает только один Ca²⁺ на мономер и имеет характерную структуру со сниженной α-спиральностью и термостабильностью и увеличенной гидрофобностью поверхности. Также как усиление конформационной гибкости С-концевого сегмента в мутанте NCS-1 R102Q приводит к повышению эффективности его связывания с D2R [192, 213], повышенная конформационная гибкость субчастиц в dNSC-1 проявляется в 20-кратном росте его сродства к GRK1 и значительном усилении ингибиторной активности в отношении фермента [228].

В цитоплазме клеток dNCS-1 может восстанавливаться при участии тиоредоксиновой системы. Таким образом, окисление NCS-1 ‒ обратимый процесс, что открывает возможность для участия белка в механизмах редокс-регуляции. В то же время накопление dNCS-1 приводит к возникновению агрегатов белка, что, по всей видимости, дополнительно стимулируется цинком [213]. До определенного предела агрегаты окисленного NCS-1 могут утилизироваться протеасомой [228], однако образование избытка подобных окисленных форм обычно запускает реакцию несвернутых белков и вызывает апоптоз клетки [229]. Интересно, что в клетках ретинобластомы Y79, которые имеют общих предшественников с фоторецепторами сетчатки и продуцируют все основные зрительные белки [230], подавление экспрессии NCS-1 снижает их восприимчивость к апоптозу, вызванному окислительным стрессом. Более того, величина редокс-потенциала среды, при котором окисление NCS-1 максимально, приближается к уровню, характерному для апоптоза [228]. Учитывая эти данные, мы суммировали опосредованные NCS-1 редоксзависимые пути, регулирующие выживание или гибель клеток в ответ на окисляющие условия (рис. 6). В результате NCS-1 может выступать и как антиоксидантный нейропротекторный белок [123, 133], и, будучи окисленным до dNCS-1, проявлять аберрантную активность, которая может привести к гибели клеток и развитию нейродегенеративных процессов, связанных с заболеваниями нервной системы.

Рис. 6.

Предполагаемый механизм редокс/Zn²⁺-зависимой регуляции NCS-1. При низких значениях редокс-потенциала среды NCS-1 (отмечен синим цветом), закрепленный на мембране за счет миристоильной группы, ингибирует протеинкиназу GRK (например, GRK1; отмечена голубым цветом) при высоком уровне кальция (отмечен желтым цветом) и высвобождает фермент при низком уровне кальция, тем самым инициируя фосфорилирование (десенситизацию) соответствующего GPCR (например, родопсина; отмечен сиреневым цветом). Умеренное повышение редокс-потенциала среды, сопровождаемое увеличением уровня мобильного цинка (отмечен розовым цветом), стимулирует дисульфидную димеризацию NCS-1 и индуцирует конститутивное ингибирование им протеинкиназы GRK. Этот процесс можно рассматривать как элемент редокс-регуляции, поскольку образование dNCS-1 обратимо за счет действия тиоредоксиновой системы. В условиях выраженного окислительного стресса и роста концентрации мобильного цинка происходит агрегация dNCS-1, что может вызывать апоптоз за счет перегрузки протеасомы и запуска ответа несвернутых белков.