Молекулярная биология. T. 57, Номер 6, 2023

  1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Молекулярная биология
  4. T. 57, № 6, 2023

Молекулярная биология, 2023, T. 57, № 6, стр. 1085-1097

Характеристика дегидратазы δ-аминолевуленовой кислоты холодноводной губки Halisarca dujardinii

О. И. Кравчук a, *, А. Д. Финошин a, К. В. Михайлов b, c, Р. Х. Зиганшин d, К. И. Адамейко a, Н. Г. Горностаев a, А. И. Жураковская a, В. С. Михайлов a, Е. И. Шагимарданова e, Ю. В. Люпина a

a Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова Российской академии наук
119334 Москва, Россия

b Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова
119992 Москва, Россия

c Институт проблем передачи информации им. А.А. Харкевича Российской академии наук
127051 Москва, Россия

d Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук
117997 Москва, Россия

e Научный центр “Регуляторная геномика”, Институт фундаментальной медицины и биологии, Казанский (Приволжский) федеральный университет
420012 Казань, Россия

* E-mail: kravchuk444@mail.ru

Поступила в редакцию 11.04.2023
После доработки 02.06.2023
Принята к публикации 20.06.2023

Полный текст (PDF)

Аннотация

Дегидратаза δ-аминолевуленовой кислоты (ALAD) ‒ ключевой фермент цитоплазматического пути биосинтеза гема. В работе представлены структура гена ALAD холодноводной морской губки Halisarca dujardinii, мультимерная организация ALAD/hemB, а также особенности экспрессии ALAD губки в разные периоды ее репродуктивного годичного цикла. В регуляции экспрессии гена ALAD губок может участвовать транскрипционный фактор GATA-1 и метилирование ДНК. Реагрегация клеток губок сопровождается снижением экспрессии ALAD и изменением содержания активной формы ALAD/hemB в клетках. Изучение процессов биосинтеза гема и роли ALAD/hemB в морфогенетических процессах у базальных животных позволит открыть новые возможности для коррекции патологий у высших животных.

Ключевые слова: биосинтез гема, дегидратаза δ-аминолевуленовой кислоты, базальные животные, пластичность

Тетрапирролы, в том числе и железокоординированный протопорфирин IX и гем, необходимы для жизнедеятельности всех организмов на Земле. Метаболический путь биосинтеза различных тетрапирролов (порфирин, хлорофилл, витамин B12, билины и гем цитохромов) у всех организмов ‒ от бактерий до млекопитающих ‒ включает образование фотореактивных промежуточных продуктов из 5-δ-аминолевуленовой кислоты (delta-aminolevulinic acid, 5-ALA). Этот эволюционно древний путь обеспечивает метаногенез, фотосинтез и дыхание [1]. Белки, участвующие в биосинтезе гема, вовлечены в морфогенетический процесс ‒ реагрегацию клеток губок [2]. Избыток свободного гема токсичен из-за его способности индуцировать окислительный стресс и перекисное окисление липидов, что приводит к повреждению мембран и гибели клеток по механизму ферроптоза [3]. Концентрация внутриклеточного гема контролируется на этапах его синтеза, связывания гемопротеинами, внутриклеточного и межклеточного транспорта и деградации. Фермент дегидратаза δ-аминолевуленовой кислоты (delta-aminolevulinic acid dehydratase, ALAD/hemB) катализирует конденсацию двух молекул 5-ALA с образованием порфобилиногена. У животных ALAD/hemB находится в цитозоле, у растений, водорослей и простейших из группы Apicomplexa белки ALAD/hemB имеют пластидное происхождение и локализуются в пластидах. Контроль биосинтеза тетрапирролов обеспечивается регуляторными механизмами, чувствительными к изменению концентрации кислорода и железа в клетках, а также аллостерическим механизмом регуляции активности ALAD/hemB. ALAD/hemB существует в виде функционально различных мультимеров (активная форма ‒ октамер, неактивная форма ‒ гексамер). У животных октамерная форма стабилизируется нейтральным значением рН и наличием 5-ALA, а у растений ‒ ионами магния. Активация ALAD/hemB в хлоропластах растений происходит при воздействии света, сопровождающимся резким изменением концентрации ионов магния [1]. Стабилизаторы гексамерной формы – аллостерические регуляторы класса малых молекул, получившие название морфлоки, или “морфологические замки” (morphlock), приводят к метаболическим нарушениям в клетках [4]. Предполагают, что филогенетически изменчивая аллостерическая регуляция ALAD/hemB возникла из-за значительной разницы в условиях среды, в которой обитают организмы, и филогенетических особенностей внутриклеточной локализации.

Структура, мутации, а также особенности экспрессии гена ALAD изучают у высших животных в связи с важной ролью эритроидной изоформы ALAD/hemB, нарушения в функционировании которой у человека приводят к проявлениям порфиринемии. Кроме того, ALAD/hemB рассматривают в качестве мишени для таргетной терапии разных форм рака, поскольку установлено, что снижение экспрессии ALAD в опухолевых клетках, активирующее фактор роста опухоли (TGF-β), индуцирует эпителиально-мезенхимальную трансформацию и рост опухоли [5, 6].

Фермент ALAD/hemB человека кодируется одним геном, а мультимер ALAD/hemB состоит из нескольких копий этого белка. Каждая субъединица ALAD/hemB состоит из 300 остатков αβ-бочкообразного домена, в центре которого находится активный сайт фермента, и бокового плеча домена, содержащего более 25 а.о. Ген ALAD человека содержит два некодирующих (1A и 1B) и 11 кодирующих экзонов. Первым экзоном может быть или 1A, или 1B. Транскрипт основной (housekeeping) формы включает экзон 1A, тогда как эритроидный транскрипт – экзон 1B [7]. Альтернативный сплайсинг приводит к множеству вариантов транскриптов, кодирующих разные изоформы. Слияние экзонов 1A и 1B со вторым, в котором находится старт трансляции, приводит к тому, что все ткани содержат идентичный фермент ALAD/hemB, но мРНК существует в двух формах: основной (1A) и эритроидной (1B). Аналогично устроен ген ALAD мыши [8]. Экспрессия 1A- и 1B-мРНК идет с разных промоторов с разными регуляторными элементами. Оба промотора содержат CG-богатые последовательности и сайты связывания для транскрипционного фактора GATA-1, но только эритроидный промотор связывает транскрипционный фактор KLF-1 [9]. Метилирование гена ALAD приводит к снижению его экспрессии [10]. Структура гена ALAD и мультимерная организация ALAD/hemB у базальных животных не изучены.

Губки (Porifera) традиционно считаются древнейшим типом животных [11]. Как и другие животные, морские губки развиваются только в присутствии ионов железа [12] и устойчивы к гипоксии. Это обусловило их использование в качестве модели для исследования ранней эволюции метаболизма железа у животных, которая происходила на фоне глобальной оксигенизации. Клетки губок способны к трансдифференцировкам и дедифференцировкам (то есть, трансформации одного клеточного типа в другой и в плюрипотентную клетку), обеспечивающим непрерывную реорганизацию их водоносной системы. Клеточная пластичность губок проявляется в процессе регенерации их тела и реагрегации диссоциированных клеток, при которой происходит восстановление исходной структуры губки [13, 14]. Трансформации клеток губки в этих процессах могут быть аналогичны процессам, происходящим в стволовых клетках высших животных [15]. Симбионты морских губок (бактерии, водоросли и грибы), реализуя сходные метаболические пути, производят вторичные метаболиты, а также мощные токсины, отпугивающие хищников и конкурентов, и создают губкам оптимальные условия для существования. Ранее нами показано, что в процессе реагрегации клеток губок происходит повышение уровня экспрессии нейроглобина, белков, ответственных за обмен железа, а также транскрипционного фактора HIF [2, 16].

Нами исследована структура гена ALAD холодноводной морской губки Halisarca dujardinii, описана мультимерная организация белка ALAD/hemB, а также особенности экспрессии ALAD губки в разные периоды ее годичного репродуктивного цикла, который сопровождается изменениями разных параметров: температуры, степени оксигенации морской воды и интенсивности ультрафиолетового излучения.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Материал исследования. Образцы губок Halisarca dujardinii были собраны в сублиторальной зоне (0‒2 м) в районе Беломорской биологической станции МГУ (66°34′ N 33°08′ E). Сбор губок проводили в разные периоды их репродуктивного годичного цикла: январе, марте, июле и ноябре [17]. Образцы губок собирали с субстратом (водорослями) для сохранения микроокружения и 7‒8 особей помещали в 5-литровый аквариум с природной морской водой. Аквариум размещали в термобоксе с контролем температуры: 1‒4°С зимой, 8‒10°С летом и 5‒8°C весной/осенью ‒ и транспортировали в ИБР РАН. Перед экспериментом у губок выявляли функциональную целостность водоносной системы ‒ по наличию фильтрации воды через оскулумы ‒ и очищали от сопутствующих беспозвоночных [2].

Подготовка препаратов диссоциированных клеток и клеточных агрегатов. Препараты диссоциированных клеток и клеточных агрегатов губки H. dujardinii получали по методике, описанной нами ранее [2, 16]. Клеточную суспензию центрифугировали 5 мин при 300 g. Количество и процент живых клеток (обычно более 96–98%) определяли в 10 мкл суспензии, смешанной с 10 мкл 0.1%-ного трипанового синего, с помощью стандартного гемоцитометра. Время от диссоциации губки до фиксации образцов и выделения РНК составляло 20 мин. Из клеточной суспензии и интактной губки (тело губки) выделяли РНК. Часть клеточной суспензии в концентрации 1 × 107 клеток/мл вносили в лунки 6-луночного планшета (2 мл/лунка) и инкубировали 24 ч при соответствующей температуре для получения агрегатов, после чего их собирали в пробирки и выделяли РНК [2].

Выделение РНК, конструирование библиотек кДНК и секвенирование. РНК выделяли с использованием TRI Reagent (“Molecular Research Center, Inc.”, США), обрабатывали ДНКазой I (“Ambion”, США) и очищали с помощью Ribo-zero rRNA Removal Kit (Human/Mouse/Rat) (“Illumina”, США). Фрагменты кДНК для библиотек получали с использованием NEBNext® Ultra™ II Directional RNA Library Prep Kit для Illumina® (“New England Biolabs”, США), проверяли, используя Agilent 2100 DNA High Sensitivity Kit, и секвенировали на Illumina Hiseq2500 с парноконцевыми чтениями длиной 125 п.н. мРНК. Для одноконцевых прочтений длиной 50 п.н. выделение из суммарной РНК проводили с помощью NEBNext® Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module (“New England Biolabs”). Далее проводили конструирование библиотек кДНК и их секвенирование на приборе Illumina Hiseq 2500.

Транскриптомная сборка и анализ дифференциальной экспрессии. На основе транскриптомной сборки [2] произведено предсказание белковых продуктов с помощью TransDecoder v.5.5 [18]. Предсказанные продукты были проверены с помощью черновой сборки генома. Одноконцевые прочтения интактных губок (тело губки), диссоциированных клеток и агрегатов губок, собранных в разные сезоны, были картированы на транскриптомную сборку с помощью bowtie 2 v.2.4.1 [19]. Уровни экспрессии транскриптов были рассчитаны с помощью RSEM v1.3.3 [20], как описано ранее [16, 21].

Структура гена и транскриптов ALAD. На основании черновой геномной сборки и последовательности транскрипта ALAD (QEH04756, NCBI) определена экзон-интронная структура. Поиск CpG-островков проводили с помощью программы Cpgplot на сайте EMBOSS (https://www.ebi. ac.uk/Tools/seqstats/emboss_cpgplot/). Поиск минорной изоформы ALAD проводили путем картирования транскриптомов (NCBI, проект PRJNA594150) на участке размером 10 т.п.н. с геном ALAD. Использовали следующие шаблоны последовательностей сайтов связывания транскрипционных факторов: (A/T)(A/G)GATA для GATA1; CCAAT для PCBP1; (T/G)GGGCGG(G/A)(G/T) для SP1; CCCACCC для KLF1.

Филогенетическое древо белка ALAD губок. Аминокислотные последовательности ALAD искали при помощи NCBI BLAST 2.2.29+ [22]. Для неаннотированных геномов губок последовательности ALAD предсказывали при помощи exonerate 2.2.0 [23], используя данные по белку ALAD других губок в качестве запроса. Выравнивание аминокислотных последовательностей выполняли в программе MEGA X с помощью ClustalW. Выравнивание для построения дерева выполняли с использованием инструмента MAFFT v7.130b [24] при помощи алгоритма L-INS-i. Перед построением дерева из выравнивания удаляли столбцы, состоящие более чем на 90% из пробелов. Реконструкцию филогенетического дерева выполняли методом максимального правдоподобия с IQ-TREE 1.6.12 [25]; выбор модели эволюции проводили автоматически с ModelFinder [26]; поддержка узлов дерева оценена при помощи сверхбыстрого бутстрэпа UFBoot [27] c 1000 репликами. Для визуализации реконструированного дерева использовали инструмент MEGA 7.0.21 [28].

Анализ аминокислотных последовательностей ALAD. Пространственное моделирование по гомологии проводили с использованием веб-сервера SWISS-MODEL, как описано ранее [16]. В качестве основного шаблона для модели ALAD H. dujardinii использовали структуру ALAD Homo sapiens (PDB: 5HMS). На основе результатов SWISS-MODEL подготовили молекулярные графики с использованием программного обеспечения PyMOL версии 2.5.2 (http://citebay.com/how-to-cite/pymol/).

Электрофорез в нативных условиях. Для выявления нативных форм фермента ALAD фрагменты тела, суспензию клеток и агрегаты губки H. dujardinii измельчали в буфере для гомогенизации (20 мМ ЭДТА, 50 мМ HEPES, рН 7.0, 200 мМ N-aCl) в соотношении 1 : 3, добавляли 5 мкл 0.2 М PMSF и 1 мкл коктейля ингибиторов протеаз (“Sigma”, США) и центрифугировали при 12 000 g в течение 30 мин при 4°С. Осветленный гомогенат (супернатант) отбирали и смешивали с буфером для нанесения образцов (50% сахароза, 0.01% бромфенолового синего) в соотношении 5 : 1. Электрофорез проводили в нативном 12.5%-ном ПААГ [29] в буферной системе TBE (7.6 мл H2O, 1 мл 10× TBE-буфера, 1.2 мл 30% акриламид/бис-акриламид), 40 мкл 0.5 M ATР, 50 мкл 1 M MgCl2, 100 мкл 10% PSA, 10 мкл TEMED) при 6‒8°С в камере для электрофореза (“Bio-Rad”, США). В лунки вносили по 25‒40 мкг осветленного гомогената.

SDS-ПААГ-электрофорез. Аликвоты осветленного гомогената, содержащие 80 мкг белка, разводили в буфере для нанесения образцов, выдерживали в течение 4 мин на водяной бане при 95°С и затем проводили денатурирующий электрофорез в 12%-ном SDS-ПААГ (160 V).

Иммуноблотинг для идентификации белка ALAD. Перенос белков из геля на нитроцеллюлозную мембрану (“Bio-Rad”) проводили в буфере для “мокрого” переноса с SDS (25 мМ Трис, 92 мМ глицин, 0.05% SDS с метанолом, pH 8.3) в течение 12 ч при постоянном токе 30 V и 4°С. После переноса белков из геля мембрану помещали в чашку Петри и заливали красителем Понсо на 30 с, затем отмывали дистиллированной водой 2‒3 раза и помещали в TNT-буфер (20 мM Трис-HCl, pH 7.6, 150 мM NaCl, 0.01% Tween-20). Мембрану в течение 2 ч инкубировали с поликлональными антителами кролика (#ARP41657_P050; “Aviva Systems Biology”, Канада; разведение 1 : 1000) к структурному домену белка ALAD, отмывали TNT-буфером и блокировали 5%-ным молоком (“GE Healthcare”, США) на TNT-буфере. В качестве вторичных использовали антитела козы против IgG кролика, коньюгированные с пероксидазой хрена (goat anti-rabbit IgG (H + L) cross-adsorbed secondary antibody, HRP; “Invitrogen”, США). Для детекции хемилюминеcценции использовали набор ECL Luminol Enhancer Solution (“GE Healthcare”). Результаты обрабатывали в программе ImageJ. Содержание белка ALAD оценивали по отношению к общему белку в пробе.

Хромато-масс-спектрометрический анализ. Зоны, соответствующие подвижности белка ALAD, вырезали из геля, окрашенного Coomassie R250. Для протеолиза использовали трипсин. Образцы загружали на преколонку размером 50 × 0.1 мм (Inertsil ODS-3 HPLC Column 3 μm; “GL Sciences”, Япония) в растворе, содержащем 2% ацетонитрила, 98% H2O, 0.1% трифторуксусной кислоты, при скорости потока 4 мкл/мин. Хроматографию проводили при комнатной температуре на колонке из плавленного кварца (300 × 0.1 мм), изготовленной на приборе P2000 Laser Puller (“Sutter Instrument”, США), с сорбентом ReproSil-Pur C18-AQ 1.9 μm (“Dr. Maisch”, Германия). Обращеннофазовую хроматографию проводили на хроматографе Ultimate 3000 Nano LC System (“Thermo Fisher Scientific”, США), соединенном с масс-спектрометром Q Exactive Plus Orbitrap mass spectrometer (“Thermo Fisher Scientific”) посредством наноэлектроспрейного источника (“Thermo Fisher Scientific”). Для хроматографического разделения пептидов использовали систему растворителей А (99.9% вода, 0.1% муравьиная кислота) и Б (19.9% вода, 0.1% муравьиная кислота, 80% ацетонитрил). Пептиды элюировали с колонки линейным градиентом: 3 → 35% Б в течение 55 мин; 35 → 60% Б в течение 5 мин, 60 → → 99% Б в течение 0.1 мин, 99% Б в течение 10 мин, 99 → 3% Б в течение 0.1 мин ‒ при скорости потока 500 нл/мин. Масс-спектрометрический анализ проводили в режиме DDA (TopN = 10) со следующими настройками прибора: MS1 сканирование ‒ разрешение 70 000, диапазон сканирования ‒ 200‒1600 m/z, максимальное время инжекции ионов – 35 мс, уровень AGC – 3 × 106, MS2 сканирование ‒ разрешение 17 500, HCD фрагментация c энергией 30%, максимальное время инжекции ионов – 80 мс, уровень AGC – 1 × 105.

Анализ данных масс-спектрометрии. Полученные данные анализировали при помощи компьютерной программы Peaks studio 10.0 (“Bioinformatics Solutions Inc.”) [30]. Идентификацию белков проводили посредством корреляции тандемных масс-спектров с базой данных аминокислотных последовательностей Halisarca dujardinii (NCBI, PRJNA594150), полученной нами ранее, со следующими параметрами: постоянная модификация ‒ Cys-карбамидометилирование, переменные модификации ‒ дезамидирование Asn/Gln и окисление Met, допустимый уровень ложноположительных идентификаций пептидов – 0.01 (определялся по реверсной базе данных аминокислотных последовательностей), специфичность протеазы ‒ C-концевые остатки Arg и Lys (при поиске в базе данных допускалось до двух пропущенных сайтов гидролиза). При идентификации пептидов допускалось отклонение экспериментально полученной массы пептида от его теоретической массы до 10 мДа, а отклонение массы фрагментов – до 0.05 Да.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

У губки Н. dujardinii найден один ген ALAD. В его состав входит 9 экзонов, а промоторная область обладает сходством с housekeeping-промотором гена человека: по CG-богатой последовательности и сайту связывания с транскрипционным фактором GATA-1 (рис. 1). На основе транскриптомных сборок для H. dujardinii, описанных нами ранее (NCBI: PRJNA594150), идентифицирована мажорная изоформа ALAD, включающая 9 экзонов, и укороченные транскрипты. Найденные элементы позволяют предположить, что в регуляцию экспрессии гена ALAD H. dujardinii, как и у млекопитающих, вовлечены транскрипционный фактор GATA-1 и метилирование ДНК. Наличие нескольких транскриптов ALAD описано ранее у моллюсков [31]. Укороченные формы ALAD обнаружены также при некоторых мутациях гена ALAD у человека [32].

Рис. 1.

Структура генов ALAD H. dujardinii (а) и человека (б). Черными прямоугольниками обозначены экзоны, узкие прямоугольники соответствуют нетранслируемым областям. Синими цифрами указаны размеры интронов, красными ‒ размеры CpG-островков, буквами на сером фоне — последовательности сайтов связывания. Длина 5'-нетранслируемой области (5'UTR) мРНК ALAD H. dujardinii подтверждена экспериментально. hk — housekeeping промотор; транскрипционные факторы: GATA1 — эритроидный фактор транскрипции, PCBP1 — поли(rC)-связывающий белок 1, SP1 — белок специфичности 1, KLF1 — Krüppel-подобный фактор 1.

Ранее установлено, что ALAD/hemB относится к наиболее эволюционно консервативным среди белков биосинтеза гема, в отличие от глобинов ADGB и NGB, которые накапливают аминокислотные замены быстрее [16]. С целью сравнить функциональные домены ALAD/hemB губок с таковыми у других видов (табл. 1) мы построили множественные выравнивания аминокислотных последовательностей ALAD/hemB губок, беспозвоночных, растений, грибов, бактерий и человека (рис. 2а). В отношении аминокислотной последовательности ALAD/hemB найдено высокое сходство губок с другими беспозвоночными. Эти белки содержат консервативные функциональные домены каталитического сайта, домены связывания ионов Zn2+ и “крышки” активного центра. Белки ALAD губок класса Demospongia кластеризуются вместе и удалены от белков губок класса Calcarea (рис. 2в). ALAD морских губок Amphimedon queenslandica и Petrosia ficiformis являются наиболее дивергентными среди класса Demospongia. Представители подкласса Heteroscleromorpha образуют единую группу на дереве, но ALAD морских губок H. dujarinii и Chondrosia_reniform не входят в нее (рис. 2в).

Таблица 1.

Последовательности ALAD, которые использованы в выравнивании (рис. 2)

Организм Аббревиатура ID в Genbanka
Homo sapiens H.sap NP_000022.3
Halisarca dujardinii H.duj QEH04756.1
Halichondria panicea H.pan QIA61829.1
Amphimedon queenslandica A.que XP_019852250.1
Suberites domuncula S.dom CAE02648.1
Ephydatia muelleri E.mue Em0016g656ab
Lubomirskia baicalensis L.bai A8_TRINITY_DN16294_c0_g1_i1c
Chondrosia_reniform ‒ OX359193.1
Spongilla_lacustris ‒ OX442424.1
Agelas_oroides ‒ OX422197.1
Oscarella pearsei ‒ m.7375d
Oscarella lobularis ‒ OX382157.1
Petrosia ficiformis ‒ OX345639.1
Leucosolenia complicata ‒ Gene.107319
Sycon ciliatum ‒ scpid88365d
Trichoplax sp. T sp. RDD46522.1
Mnemiopsis leidyi M.lei см. примечаниеe
Saccharomyces cerevisiae S.cer AJR94895.1
Arabidopsis thaliana A.tha OAP13053.1
Paramecium octaurelia P.oct CAD8165915.1
Kiritimatiellae bacterium K.bac MBP7274600.1

a Все последовательности присутствуют в базе данных NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/), кроме ALAD Ephydatia muelleri, Lubomirskia baikalensis, Oscarella_pearsei, Sycon ciliatum и Mnemiopsis leidyi.

b https://spaces.facsci.ualberta.ca/ephybase/

c https://figshare.com/articles/Transcriptomic_and_genomic_assemblies_Lake_Baikal_Sponge_Data/6819812

d http://www.compagen.org/datasets.html

e https://kona.nhgri.nih.gov/mnemiopsis/

Рис. 2.

Домены и вторичная структура белка ALAD губок. а ‒ Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей ALAD: человека, базальных животных, грибов, растений, одноклеточных и бактерий (см. табл. 1). Нумерация аминокислот соответствует нумерации b-изоформы ALAD человека (ALAD-b). Аминокислоты, идентичные у разных видов, обозначены черным цветом. Стрелками показаны консервативные остатки Lys и Arg. Зеленым цветом выделены аминокислоты, играющие ключевую роль в формировании четвертичной структуры ALAD человека. Розовым цветом обозначено N-концевое плечо; желтым ‒ металлсвязывающий сайт; голубым ‒ “крышка” активного центра. б ‒ 3D-структуры областей, соответствующих N-концевому плечу ALAD-b человека и ALAD губки H. dujardinii. Выбранная структура ALAD Homo sapiens (PDB: 5HMS) представляет собой октамер. Значения GMQE (Global Model Quality Estimate) = 0.90, QSQE (Quaternary Structure Quality Estimate) = 0.94 для 5HMS; например, для мыши (PDB: 2Z1B) они составляли 0.83 и 0.55 соответственно. RMSD (Root-Mean-Square Deviation of atomic positions) составляет 0.59 Å. Эта структура выбрана как обладающая наиболее высокими оценками качества предполагаемых моделей GMQE и QSQE по сравнению с другими доступными структурами-шаблонами эукариот (мышь, дрожжи) на использованном сервере Swiss Model. в ‒ Филогенетическое древо ALAD губок. Максимально правдоподобное дерево ALAD губок, реконструированное с IQ-TREE; цифры на узлах дерева соответствуют оценкам поддержки узла (в процентах) методом сверхбыстрого бутстрэпа c 1000 реплик.

Рис. 2.

Окончание.

Для предсказания трехмерной структуры ALAD губки H. dujardinii использовали данные для ALAD человека. Идентичность аминокислотных последовательностей ALAD губки и человека (PDB: 5HMS) составляет 65.9%, а покрытие использованных для моделирования оснований (2‒325) ‒ 98%. N-концевой участок ALAD/hemB губок короткий, наименее консервативен и имеет замены в ключевых остатках функционального домена: S5M и F12H (N-концевой участок плеча) (рис. 2а, б). Кроме этих замен ALAD H. dujarinii несет замену T127A в металлсвязывающем центре и V275M. Короткий участок (до S5) N-концевого плеча одной субъединицы затрудняет взаимодействие с R240 С-доменов двух других субъединиц ALAD и формирование мультимеров ALAD/hemB (рис. 2б). Показано, что такие замены в N-концевом плече и в металлсвязывающем центре приводят к снижению активности фермента [4, 33, 34].

С целью охарактеризовать экспрессию генов белков биосинтеза гема: ALAS, ALAD, NGB, ADGB, ферритинов Ft1a/b и Ft2, ‒ а также факторов NF-κB1, BCL2, NOS1 в процессах диссоциации и реагрегации клеток губки H. dujardinii в разные периоды годового цикла мы сравнили методом RNA-seq уровень их экспрессии в интактном теле, диссоциированных клетках и клеточных агрегатах губок, собранных в разные сезоны и, следовательно, в разные периоды жизненного цикла губок. В интактном теле губок наибольший уровень экспрессии характерен для генов ферритинов Ft1a/b [16] во все исследованные периоды жизни (рис. 3). Экспрессия генов белков биосинтеза гема: ALAD и ADGB ‒ в теле губок, собранных летом, была ниже, а NGB выше, чем в другие исследованные периоды (рис. 3). Экспрессия ALAD в клеточных агрегатах губок, собранных во все исследованные сезоны, снижалась, а экспрессия NGB снижалась только в клеточных агрегатах губок, собранных летом, но увеличивалась в собранных зимой, весной и осенью (рис. 3). Также увеличивалась экспрессия генов Ft2 [16], транскрипционного фактора NF-κB и антиапоптотического белка BCL2 в клеточных агрегатах губок, собранных во все исследованные сезоны (рис. 3). Таким образом, в летний период, характеризующийся повышенной температурой и пониженной степенью оксигенации морской воды, а также усилением интенсивности ультрафиолетового излучения, в теле губки повышена экспрессия гена глобинового белка NGB, но экспрессия гена ключевого белка цитозольного пути биосинтеза гема ALAD снижена. Несмотря на различия в среднем уровне экспрессии в интактном теле губок, собранных в разные сезоны, для ALAD, NF-κB и BCL2 наблюдались сходные изменения при реагрегации, что свидетельствует о возможном их участии в регуляции этого процесса. Экспрессия ALAD снижалась в агрегатах по сравнению с экспрессией в тканях. Понижение экспрессии было стабильным и не зависело от периода репродуктивного цикла. Известно, что снижение экспрессии ALAD ассоциировано с развитием злокачественных опухолей у человека: гепатоцеллюлярной карциномы [6] и рака молочной железы [5]. C. Neslund-Dudas и соавт. [35] сообщали, что ALAD вовлечен в прогрессирование рака предстательной железы. Можно предположить, что при развитии опухоли и образовании агрегатов у губки могут быть задействованы сходные механизмы трансдифференцировки клеток в клеточные типы со сниженной экспрессией ALAD.

Рис. 3.

Экспрессия отдельных дифференциально экспрессирующихся генов белков биосинтеза гема, ферритинов и белков, связанных с обменом железа, в процессах диссоциации/реагрегации у губки H. dujardinii в разные периоды годового цикла. Большими и маленькими точками обозначены диссоциированные клетки и агрегаты. Экспрессия транскриптов (мРНК) белков в CPM (counts per million, число прочтений, отнесенных к данному транскрипту, на миллион прочтений) после нормализации методом TMM (trimmed mean of M-values ‒ усеченное среднее М-значений) рассчитана c использованием программного обеспечения edgeR (https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html). *Статистически значимые различия экспрессии в интактной ткани между разными сезонными периодами для скорректированных по методу Бенджамини‒Хохберга значений p < 0.001 t-критерия Стьюдента, проведенного для повторов каждого периода относительно зимнего периода. На тепловой карте справа изображены логарифмированные уровни изменения экспрессии в диссоциированных клетках и агрегатах по отношению к образцам интактной губки (тело губки) соответствующих сезонных периодов; при этом численные значения указаны только в тех ячейках, где изменения на данном контрасте статистически значимы согласно модели дифференциальной экспрессии пакета edgeR (FDR < 0.001). В связи с тем, что последовательности мРНК минорной и мажорной изоформ ALAD практически идентичны, их экспрессия рассчитана как сумма.

В транскриптомах губки H. dujardinii также были идентифицированы ALAD симбиотических микроорганизмов, в основном бактерий рода Alpha- и Gammaproteobacteria. Лучшие совпадения, полученные с помощью инструмента BlastP (https:// blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE=Proteins) путем запроса последовательностей бактериального ортолога ALAD в базе данных белков NCBI, имеют хорошее покрытие последовательностей (80–100%) и значения идентичности (выше 70%) для Rhodobacteraceae. Бактериальные симбионты H. dujardinii могут регулировать биосинтез гема губки. Известно, что симбиотические грамотрицательные бактерии легче утилизируют железо из гема хозяина [36].

Белок ALAD/hemB губки H. dujardinii имеет мажорную изоформу с молекулярной массой 35 414.46 Да, состоящую из 325 а.о. и имеющую изоэлектрическую точку (pI), равную 7.82. Прогнозируемая изоэлектрическая точка pI ALAD/hemB губки H. dujardinii значительно выше рабочего диапазона ALAD/hemB других животных. Исходя из этого, мы предположили, что активность ALAD губки ниже, чем у человека. Методом масс-спектрометрии идентифицирован белок ALAD/hemB клеток губки H. dujardinii и обнаружено 4 посттрансляционные модификации: ацетилирование (А6), карбамидометилирование (С96), дезамидирование (N185) и окисление (M193) (рис. 4, табл. 2).

Рис. 4.

Аминокислотная последовательность ALAD/hemB и пептиды, определенные с помощью масс-спектрометрии (серые линии). Указана нумерация, соответствующая ALAD человека (NP_000022.3). Модификации аминокислот обозначены соответствующими буквами.

Таблица 2.  

Данные масс-спектрометрии для белка ALAD

Белок NCBI ID ‒10 lgPа Покрытие, % Ntb Nuc Посттрансляционные модификации Mr, Да
ALAD QEH04756.1 140.68 30 10 10 Окисление; дезаминирование; карбамидометилирование; ацетилирование 35 415

a Показатель PEAKS DB score, отражающий статистическую значимость совпадения спектра пептида c каким-либо из базы (форма записи p-значения, определяемого программой PEAKS как вероятность того, что ложная идентификация при поиске в базе данных даст такой же или лучший результат соответствия). Значения ‒10 lgP > 30 (эквивалентно p-значениям < 0.001) представляют собой совпадения высокого качества.

b Общее число пептидов.

c Число уникальных пептидов.

В результате проведенного исследования, состоящего из следующих этапов: фракционирование экстрактов белков клеток интактного тела губки, диссоциированных клеток и клеточных агрегатов в 12%-ном нативном геле или SDS-ПААГ, последующего иммуноблотинга с окрашиванием специфическими антителами к АLAD, ‒ выявлено увеличение содержания ALAD в диссоциированных клетках по сравнению с таковым в теле (рис. 5). Доля активной (октамерной) формы ALAD увеличивалась в 3.5 раза, тогда как неактивной (гексамерной) увеличивалась незначительно по сравнению с таковой в интактном теле. В клеточных агрегатах содержание октамерной и гексамерной форм ALAD снижалось относительно показателей диссоциированных клеток, но сохранялось на высоком уровне по сравнению с содержанием в интактном теле. Интересно, что в интактном теле соотношение неактивной формы ALAD/hemB к активной выше по сравнению с таковыми показателями в клетках и агрегатах. Высокое содержание неактивной (гексамерной) формы ALAD/hemB в интактном теле по сравнению с содержанием его активной формы, а также изменение этого соотношения при диссоциации и реагрегации можно интерпретировать как тонкий механизм регуляции этих процессов. Известно, что в клетках живых организмов существует динамическое равновесие различных форм ALAD: октамера, гексамера, димеров и тетрамера. Время сборки мультимеров и разборки до мономера зависит от организма, типа и состояния клеток [37], а соотношение различных форм может меняться при изменении pH, концентрации одно- и двухвалентных ионов металлов [38] и в присутствии морфлоков [4]. Возможно, повышение содержания активной формы ALAD/hemB при диссоциации вызывает активацию цитоплазматического пути биосинтеза гема в определенных клеточных типах, инициируя процесс реагрегации.

Рис. 5.

Анализ содержания белка ALAD/hemB в клетках губки Н. dujardinii. а ‒ Содержание октамерной и гексамерной форм ALAD в клетках губки при диссоциации и реагрегации: 1 – тело губки, 2 ‒ диссоциированные клетки, 3 ‒ агрегаты клеток. Представлены результаты иммуноблотинга, проведенного после электрофореза в 12%-ном ПААГ. б ‒ Содержание белка ALAD в тех же образцах. Представлены результаты иммуноблотинга, проведенного после электрофореза в 12%-ном SDS-ПААГ. в ‒ Электрофоретический анализ образцов 1 и 2 в 12%-ном SDS-ПААГ, окрашивание Coomassie G250. Стрелкой показана полоска в геле, использованная для идентификации ALAD/hemB методом масс-спектрометрии.

Таким образом, впервые показана аллостерическая модификация ALAD/hemB в процессе диссоциации губки и реагрегации ее клеток. В регуляции экспрессии гена ALAD губки может участвовать транскрипционный фактор GATA-1 и метилирование ДНК [9]. Реагрегация клеток губки Н. dujardinii сопровождается снижением экспрессии ALAD и изменением содержания активной и неактивной форм белка. Дальнейшее изучение процессов биосинтеза гема и роли ALAD/hemB в морфогенетических процессах у базальных животных позволит идентифицировать мишени, которые могут быть использованы для коррекции нарушений этих процессов у высших животных.

Авторы выражают благодарность за помощь в сборе материала туристическому центру “Полярный Круг” (Россия).

Исследования проведены с использованием оборудования Центра коллективного пользования Института биологии развития им. Н.К. Кольцова Российской академии наук (ИБР РАН).

Работа выполнена в рамках раздела Государственного задания ИБР РАН (№ ГЗ 0088-2021-0008).

Все применимые международные, национальные и/или институциональные принципы использования животных в экспериментах и условия ухода за ними были соблюдены.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Список литературы

  1. Jaffe E.K. (2020) Porphobilinogen synthase: an equilibrium of different assemblies in human health. Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 169, 85‒104. https://doi.org/10.1016/bs.pmbts.2019.11.003

  2. Finoshin A.D., Adameyko K.I., Mikhailov K.V., Kravchuk O.I., Georgiev A.A., Gornostaev N.G., Kosevich I.A., Mikhailov V.S., Gazizova G.R., Shagimardanova E.I., Gusev O.A., Lyupina Y.V. (2020) Iron metabolic pathways in the processes of sponge plasticity. PLoS One. 15, e0228722. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0228722

  3. Chiabrando D., Bertino F., Tolosano E. (2020) Hereditary ataxia: a focus on heme metabolism and Fe–S cluster biogenesis. Int. J. Mol. Sci. 21, 3760. https://doi.org/10.3390/ijms21113760

  4. Jaffe E.K., Lawrence S.H. (2012) Allostery and the dynamic oligomerization of porphobilinogen synthase. Arch. Biochem. Biophys. 519, 144‒153. https://doi.org/10.1016/j.abb.2011.10.010

  5. Ge J., Yu Y., Xin F., Yang Z.J., Zhao H.M., Wang X., Tong Z.S., Cao X.C. (2017) Downregulation of delta-aminolevulinate dehydratase is associated with poor prognosis in patients with breast cancer. Cancer Sci. 108, 604‒611. https://doi.org/10.1111/cas.13180

  6. Ye Q., Yang X., Zheng S., Mao X., Shao Y., Xuan Z., Huang P. (2022) Low expression of moonlight gene ALAD is correlated with poor prognosis in hepatocellular carcinoma. Gene. 825, 146437. https://doi.org/10.1016/j.gene.2022.146437

  7. Kaya A.H., Plewinska M., Wong D.M., Desnick R.J., Wetmur J.G. (1994) Human delta-aminolevulinate dehydratase (ALAD) gene: structure and alternative splicing of the erythroid and housekeeping mRNAs. Genomics. 19, 242‒248. https://doi.org/10.1006/geno.1994.1054

  8. Bishop T.R., Miller M.W., Beall J., Zon L.I., Dierks P. (1996) Genetic regulation of delta-aminolevulinate dehydratase during erythropoiesis. Nucleic Acids Res. 24, 2511‒2518. https://doi.org/10.1093/nar/24.13.2511

  9. Desgardin A.D., Abramova T., Rosanwo T.O., Kartha S., Shim E.H., Jane S.M., Cunningham J.M. (2012) Regulation of delta-aminolevulinic acid dehydratase by Krüppel-like factor 1. PLoS One. 7, e46482. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0046482

  10. Li C., Xu M., Wang S., Yang X., Zhou S., Zhang J., Liu Q., Sun Y. (2011) Lead exposure suppressed ALAD transcription by increasing methylation level of the promoter CpG islands. Toxicol. Lett. 203, 48‒53. https://doi.org/10.1016/j.toxlet.2011.03.002

  11. Simion P., Philippe H., Baurain D., Jager M., Richter D.J., Di Franco A., Roure B., Satoh N., Quéinnec É., Ereskovsky A., Lapébie P., Corre E., Delsuc F., King N., Wörheide G., Manuel M.A. (2017) Large and consistent phylogenomic dataset supports sponges as the sister group to all other animals. Curr. Biol. 27, 958‒967. https://doi.org/10.1016/j.cub.2017.02.031

  12. Wade J, Byrne D.J., Ballentine C.J., Drakesmith H. (2021) Temporal variation of planetary iron as a driver of evolution. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 118, e2109865118. https://doi.org/10.1073/pnas.2109865118

  13. Лавров А.И., Косевич И.А. (2014) Реагрегация клеток губок: механизмы и динамика процесса. Онтогенез. 45, 250‒271. https://doi.org/10.7868/S0475145014040077

  14. Ereskovsky A., Borisenko I.E., Bolshakov F.V., Lavrov A.I. (2021) Whole-body regeneration in sponges: diversity, fine mechanisms, and future prospects. Genes (Basel). 12, 506. https://doi.org/10.3390/genes12040506

  15. Sogabe S., Hatleberg W.L., Kocot K.M., Say T.E., Stoupin D., Roper K.E., Fernandez-Valverde S.L., Degnan S.M., Degnan B.M. (2019) Pluripotency and the origin of animal multicellularity. Nature. 570, 519–522. https://doi.org/10.1038/s41586-019-1290-4

  16. Adameyko K.I., Burakov A.V., Finoshin A.D., Mikhailov K.V., Kravchuk O.I., Kozlova O.S., Gornostaev N.G., Cherkasov A.V., Erokhov P.A., Indeykina M.I., Bugrova A.E., Kononikhin A.S., Moiseenko A.V., Sokolova O.S., Bonchuk A.N., Zhegalova I.V., Georgiev A.A., Mikhailov V.S., Gogoleva N.E., Gazizova G.R., Shagimardanova E.I., Gusev O.A., Lyupina Y.V. (2021) Conservative and atypical ferritins of sponges. Int. J. Mol. Sci. 22, 8635. https://doi.org/10.3390/ijms22168635

  17. Ereskovsky A.V. (2000) Reproduction cycles and strategies of the cold-water sponges Halisarca dujardini (Demospongiae, Halisarcida), Myxilla incrustans and Iophon piceus (Demospongiae, Poecilosclerida) from the White Sea. Biol. Bull. 198, 77‒87. https://doi.org/10.2307/1542805

  18. Haas B.J., Papanicolaou A., Yassour M., Grabherr M., Blood P.D., Bowden J., Couger M.B., Eccles D., Li B., Lieber M., MacManes M.D., Ott M., Orvis J., Pochet N., Strozzi F., Weeks N., Westerman R., William T., Dewey C.N., Henschel R., LeDuc R.D., Friedman N., Regev A. (2013) De novo transcript sequence reconstruction from RNA-seq using the Trinity platform for reference generation and analysis. Nat. Protoc. 8, 1494‒1512. https://doi.org/10.1038/nprot.2013.084

  19. Langmead B., Salzberg S.L. (2012) Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat. Methods. 9, 357‒359. https://doi.org/10.1038/nmeth.1923

  20. Li B., Dewey C.N. (2011) RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome. BMC Bioinformatics. 12, 323. https://doi.org/10.1186/1471-2105-12-323

  21. Адамейко К.И., Кравчук О.И., Финошин А.Д., Бончук А.Н., Георгиев А.А., Михайлов В.С., Горностаев Н.Г., Михайлов К.В., Бачева А.В., Индейкина М.И., Бугрова А.Е., Газизова Г.Р., Козлова О.С., Гусев О.А., Шагимарданова Е.И., Люпина Ю.В. (2020) Структура нейроглобина холодноводной губки Halisarca dujardinii. Молекуляр. биология. 54, 474‒479. https://doi.org/https://doi.org/10.31857/S0026898420030039

  22. Altschul S.F., Madden T.L., Schaffer A.A., Zhang J., Zhang Z., Miller W., Lipman D.J. (1997) Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 25, 3389‒3402. https://doi.org/10.1093/nar/25.17.3389

  23. Slater G.S., Birney E. (2005) Automated generation of heuristics for biological sequence comparison. BMC Bioinformatics. 6, 31. https://doi.org/10.1186/1471-2105-6-31

  24. Katoh K., Standley D.M. (2013) MAFFT multiple sequence alignment software version 7: improvements in performance and usability. Mol. Biol. Evol. 30, 772‒780. https://doi.org/10.1093/molbev/mst010

  25. Nguyen L.T., Schmidt H.A., von Haeseler A., Minh B.Q. (2015) IQ-TREE: a fast and effective stochastic algorithm for estimating maximum-likelihood phylogenies. Mol. Biol. Evol. 32, 268‒274. https://doi.org/10.1093/molbev/msu300

  26. Kalyaanamoorthy S., Minh B.Q., Wong T.K.F., von Haeseler A., Jermiin L.S. (2017) ModelFinder: fast model selection for accurate phylogenetic estimates. Nat. Methods. 14, 587‒589. https://doi.org/10.1038/nmeth.4285

  27. Hoang D.T., Chernomor O., von Haeseler A., Minh B.Q., Vinh L.S. (2018) UFBoot2: improving the ultrafast bootstrap approximation. Mol. Biol. Evol. 35, 518‒522. https://doi.org/10.1093/molbev/msx281

  28. Kumar S., Stecher G., Tamura K. (2016) MEGA7: molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets. Mol. Biol. Evol. 33, 1870‒1874. https://doi.org/10.1093/molbev/msw054

  29. Laemmli U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680‒685. https://doi.org/10.1038/227680a0

  30. Ma B., Zhang K., Hendrie C., Liang C., Li M., Doherty-Kirby A., Lajoie G. (2003) PEAKS: powerful software for peptide de novo sequencing by tandem mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 17, 2337‒2342. https://doi.org/10.1002/rcm.1196

  31. Williams S.T., Lockyer A.E., Dyal P., Nakano T., Churchill C.K.C., Speiser D.I. (2017) Colorful seashells: identification of haem pathway genes associated with the synthesis of porphyrin shell color in marine snails. Ecol. Evol. 7, 10379‒10397. https://doi.org/10.1002/ece3.3552

  32. Akagi R., Kato N., Inoue R., Anderson K.E., Jaffe E.K., Sassa S. (2006) delta-Aminolevulinate dehydratase (ALAD) porphyria: the first case in North America with two novel ALAD mutations. Mol. Genet. Metab. 87, 329‒336. https://doi.org/10.1016/j.ymgme.2005.10.011

  33. Inoue R., Akagi R. (2008) Co-synthesis of human delta-aminolevulinate dehydratase (ALAD) mutants with the wild-type enzyme in cell-free system-critical importance of conformation on enzyme activity. J. Clin. Biochem. Nutr. 43, 143‒153. https://doi.org/10.3164/jcbn.2008035

  34. Maruno M., Furuyama K., Akagi R., Horie Y., Meguro K., Garbaczewski L., Chiorazzi N., Doss M.O., Hassoun A., Mercelis R., Verstraeten L., Harper P., Floderus Y., Thunell S., Sassa S. (2001) Highly heterogeneous nature of delta-aminolevulinate dehydratase (ALAD) deficiencies in ALAD porphyria. Blood. 97, 2972‒2978. https://doi.org/10.1182/blood.v97.10.2972

  35. Neslund-Dudas C., Levin A.M., Rundle A., Beebe-Dimmer J., Bock C.H., Nock N.L., Jankowski M., Datta I., Krajenta R., Dou Q.P., Mitra B., Tang D., Rybicki B.A. (2014) Case-only gene-environment interaction between ALAD tagSNPs and occupational lead exposure in prostate cancer. Prostate. 74, 637‒646. https://doi.org/10.1002/pros.22781

  36. Richard K.L., Kelley B.R., Johnson J.G. (2019) Heme uptake and utilization by Gram-negative bacterial pathogens. Front. Cell. Infect. Microbiol. 9, 81. https://doi.org/10.3389/fcimb.2019.00081

  37. Jaffe E.K. (2016) The remarkable character of porphobilinogen synthase. Acc. Chem. Res. 49, 2509‒2517. https://doi.org/10.1021/acs.accounts.6b00414

  38. Selwood T., Tang L., Lawrence S.H., Anokhina Y., Jaffe E.K. (2008) Kinetics and thermodynamics of the interchange of the morpheein forms of human porphobilinogen synthase. Biochemistry. 47, 3245‒3257. https://doi.org/10.1021/bi702113z

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Молекулярная биология

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал