Молекулярная биология, 2023, T. 57, № 6, стр. 995-1005

ВВЕДЕНИЕ

Метаболизм низкомолекулярных тиолов в клетках бактерий играет важную роль в поддержании редокс-баланса при воздействии антибактериальных препаратов, окислителей и других стрессовых агентов [1–4]. Цистеин и глутатион принимают участие в регуляции различных биосинтетических процессов, приводя к редокс-зависимой модификации белков, что модулирует активность ферментов [5, 6]. Ранее нами были изучены показатели тиолового гомеостаза в мутантах Escherichia coli по генам биосинтеза ADP-гептозы, одного из компонентов клеточной стенки [7]. Следует отметить, что мутанты, утратившие ADP-гептозу в составе липополисахаридов (ЛПС), обнаруживают сверхчувствительность к действию антибиотиков, однако механизм возникновения этой чувствительности остается неизвестным. Показано, что делеции генов gmhA, hldE, rfaD и waaC, кодирующих ферменты пути синтеза ADP-гептозы, провоцируют значительное снижение внутриклеточного пула цистеина с одновременным повышением общего пула восстановленных тиолов. Наряду с изменением профиля серосодержащих метаболитов, в клетках, утративших ADP-гептозу, наблюдается повышение уровня генерации активных форм кислорода (АФК), сопровождающиеся истощением восстановительных эквивалентов NADPH. Таким образом, потеря ADP-гептозы приводит к развитию мощного окислительного стресса и перестройке гомеостаза тиолов в клетках E. coli.

В клетках E. coli основным внутриклеточным низкомолекулярным тиолом в норме является восстановленный трипептид глутатион (GSH), содержание которого (2‒4 мМ) существенно выше, чем содержание цистеина (0.1‒0.2 мМ) [4]. Возможно, это связано с тем, что хотя стандартные редокс-потенциалы пар цистеин–цистин (‒250 мВ при pH 7.4) и пары восстановленный глутатион/окисленный глутатион (GSH/GSSG) (–264 мВ при pH 7.4) близки [8], цистеин более эффективно восстанавливает железо и обладает большей генотоксичностью [4]. Внутриклеточная концентрация цистеина определяется интенсивностью процессов синтеза de novo и транспорта. В клетках E. coli гены биосинтеза и транспорта цистеина объединены в один регулон под контролем транскрипционного регулятора cysB [9]. CysB нуждается в кофакторе O-ацетилсерине, который синтезируется из L-серина ацетилтрансферазой CysE. Кроме того, O-ацетилсерин является интермедиатом пути биосинтеза цистеина [10]. Таким образом, синтез и транспорт цистеина зависят от активности генов cysB и cysE (рис. 1). Транспортная система цистеина представляет собой так называемый шаттл, в котором транспортер TcyP осуществляет перенос окисленной формы цистеина – цистина, из периплазматического пространства в цитоплазму [11] (рис. 1). В цитоплазме цистин подвергается быстрому восстановлению и транспортер EamA возвращает цистеин обратно в периплазму [12] (рис. 1). Ген eamA не входит в состав регулона cysB.

Рис. 1.

Схема метаболизма низкомолекулярных тиолов в клетках E. coli. Ген cysB кодирует транскрипционный регулятор генов цистеинового гомеостаза и контролирует синтез цистеина de novo и работу системы транспортеров TcyP и EamA.

Синтез глутатиона в клетках E. coli осуществляется глутамат-цистеин-лигазой GshA и глутатионсинтазой GshB (рис. 1). Хотя GSH не является незаменимым тиолом для клеток E. coli, он играет критическую роль в защите от экологических стрессов, включая осмотический шок, кислотность, защиту от токсинов и окислительного стресса, вызванного пероксидами [13].

Поскольку в мутантах E. coli, утративших ADP-гептозу в составе ЛПС клеточной стенки, нарушен тиоловый гомеостаз и повышена чувствительность к антибиотикам, мы предположили, что введение мутаций в гены метаболизма цистеина и глутатиона может играть критическую роль в модуляции их чувствительности к антибиотикам.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Бактериальные штаммы. Использованные в работе штаммы E. coli и их генотип представлены в табл. 1.

Делеционные мутанты получали, выращивая фаг Р1 на штаммах из коллекции Keio [17 ] , содержащих инсерции cysB::kan, cysE::kan, gshA::kan, gshB::kan и emaA::kan, с последующей трансдукцией в геном штамма E. coli MG1655 [18 ] . Из полученных штаммов с помощью хелперной плазмиды pCP20 удаляли канамициновую кассету [19 ] с образованием соответствующих делеций (∆cysB, ∆cysE, ∆gshA, ∆gshB и ∆emaA). Наличие делеций подтверждали с помощью ПЦР. Получение штамма, содержащего делецию гена gmhA, описано в работе [7], а P_tet-tcyP – в [16 ] .

Среды и условия культивирования. В качестве полноценной питательной среды для выращивания бактерий использовали среду LB без глюкозы [20 ] . В жидкой среде бактерии культивировали в термостатированном шейкере (200 об./мин). При необходимости в среду добавляли: налидиксовую кислоту – 0.25 мкг/мл, тетрациклин – 0.75 мкг/мл, ампициллин – 50 мкг/мл, канамицин – 20 мкг/мл.

Определение чувствительности бактерий к антибиотикам. Способность к образованию колоний оценивали методом микроразведений. Ночные бактериальные культуры разводили в 100 раз и подращивали в термостатированном шейкере при 37°С до оптической плотности OD₆₀₀= 0.5–0.6. Все суспензии выравнивали по оптической плотности. Из полученных культур готовили серию десятикратных разведений в 96-луночном планшете в объеме 100 мкл. Полученные разведения высевали на чашки с богатой средой, содержащей различные концентрации исследуемых антибиотиков. Чашки инкубировали в течение ночи в термостате при 37°С. Результат фотографировали с помощью аналитической системы GelCamera M-26XV.

Определение жизнеспособности и редокс-статуса клеток с использованием проточной цитометрии. Клетки выращивали в полноценной среде до оптической плотности 0.4, затем отмывали дважды в фосфатном буфере (PBS), центрифугировали, удаляли супернатант и ресуспендировали в 100 мкл PBS. Жизнеспособность и редокс-статус клеток оценивали с помощью проточной цитометрии на цитофлуориметре BD LCR Fortessa (“Becton Dickinson”, США). Клеточную популяцию E. coli гейтировали по параметрам малоуглового (FSC) и бокового рассеяния (SSC), которые характеризуют размер и гранулярность клеток соответственно. Процент мертвых клеток в популяции оценивали, используя пропидий йодид (Ex/Em = 535/617 нм, “Sigma-Aldrich”, США), который добавляли к клеткам до концентрации 10 мкг/мл за 1 мин до начала анализа. Пропидий йодид проникает в клетки с поврежденной мембраной, его связывание с ДНК приводит к возрастанию интенсивности флуоресценции в красной области спектра. Редокс-статус клеток E. coli характеризовали по уровню АФК и внутриклеточных тиолов, значительную часть которых составляет глутатион (GSH). Уровень АФК оценивали с помощью дигидрородамина 123 (DHR123) (Ex/Em = 507/525 нм, “ThermoFisher Scientific”, США) [7], который добавляли к клеткам до конечной концентрации 7.5 мкM, а затем инкубировали клетки в течение 1 ч в темноте при 37°C. Уровень внутриклеточных тиолов оценивали с помощью красителя ThiolTracker Violet (Ex/Em = = 405/526 нм, “ThermoFisher Scientific”) [7], который добавляли в концентрации 10 мкМ, и инкубировали клетки в течение 1 ч при 37°C. Внутриклеточные тиолы и АФК оценивали в клетках с неповрежденной мембраной, которые не окрашиваются пропидий йодидом. Данные цитометрии анализировали c помощью программы FlowJo (“BD Biosciences”).

Определение уровня внутриклеточного глутатиона с помощью реактива Эллмана. Клетки E. coli (OD₆₀₀ 0.5) дважды отмывали натрий-фосфатным буфером (100 мМ Na-фосфатный буфер (Na₂HPO₄/NaH₂PO₄), 0.5 мМ EDТА, pH 7.5) и лизировали с помощью трехкратной процедуры замораживания (жидкий азот, –196°С)–оттаивания (37°С). После последнего оттаивания пробы ставили в лед и добавляли трихлоруксусную кислоту (ТХУ) до концентрации 5%. После осаждения белков пробы центрифугировали при 13 000 g в течение 10 мин, при температуре 4°C. Супернатант отбирали и использовали далее для определения глутатиона с помощью реактива Эллмана (5,5'-дитиобис-2-нитробензойная кислота, DTNB) методом спектрофотометрии, поскольку продукт восстановления DTNB обладает сильным поглощением при 412 нм. Для построения калибровочной кривой использовали восстановленный глутатион, растворенный в 5% ТХУ. К осадку добавляли раствор щелочи до pH 7.4, в котором растворяли осадок, полученный раствор использовали для оценки количества белка в пробах с использованием бицинхониновой кислоты (BCA). Полученные значения количества глутатиона в пробе нормировали на количество белка в данной пробе.

Определение доли восстановленного и окисленного глутатиона в клетках. Количественное определение уровня внутриклеточного глутатиона в данном случае проводили модифицированным методом Титца [21 ] . Клетки ночной культуры (100 мкл) переносили в 10 мл свежей среды LB и подращивали до OD₆₀₀ 0.5. Клетки из 5 мл суспензии осаждали центрифугированием и суспендировали в лизирующем буфере KPE c добавлением 0.1% Triton X100. Клетки гомогенизировали пестиком и центрифугировали (11 000 об/мин, 5 мин при 4°С). Супернатант переносили в чистые пробирки. Реакционную смесь, состоящую из 20 мкл клеточного экстракта и равных объемов (60 мкл) DTNB, глутатионредуктазы и NADPH инкубировали в течение 3 мин при комнатной температуре, после чего измеряли поглощение при 412 нм. Для построения калибровочной кривой использовали GSH (“Sigma Aldrich”, США). Полученные значения относили к концентрации суммарного белка и выражали в процентах. Для определения окисленной формы глутатиона (GSSG) клеточные экстракты обрабатывали 2-винилпиридином как описано в [21 ] . Для построения калибровочной кривой использовали окисленный глутатион (“Sigma Aldrich”). Рассчитывали процент восстановленного и окисленного глутатиона в пробах.

Статистический анализ данных. Данные представлены как средние значения ± стандартные отклонения, полученные из 3–4 экспериментов. Статистическую разницу между экспериментальными группами определяли с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) c тестом Тьюки для множественных сравнений. Различия между средними для групп значениями считали статистически значимыми при p < 0.05. Статистический анализ проводили, используя GraphPad Prism 9.1.2 software (GraphPad Software Inc., США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Метаболизм низкомолекулярных тиолов и чувствительность мутанта ∆gmhA к антибиотикам

Поскольку инактивация генов биосинтеза АDP-гептозы приводит к значительным изменениям в метаболизме низкомолекулярных тиолов в клетках E. coli [7], которые являются компонентами системы редокс-регуляции, защищающей бактериальные клетки в различных стрессовых условиях [1, 3, 12, 13], изменение метаболизма низкомолекулярных тиолов могло привести к еще более выраженному увеличению чувствительности данных штаммов к антибиотикам. В настоящей работе нами получены мутанты ∆gmhA, несущие делеции генов регуляции цистеинового гомеостаза cysB и cysE, транспорта цистеина (eamA) и сверхэкспресcирующие ген транспорта цистина (tcyP), а также делеции генов биосинтеза глутатиона gshA и gshB (рис. 1), и изучено влияние этих делеций на чувствительность мутанта ∆gmhA к антибиотикам.

Как следует из данных, представленных на рис. 2, ограничение метаболизма цистеина (делеции генов cysB и cysE) приводит к значительной супрессии чувствительности мутанта ∆gmhA к антибиотикам как бактерицидного (налидиксовая кислота), так и бактериостатического действия (тетрациклин). Кроме того, блокирование биосинтеза глутатиона (делеции gshA и gshB) также повышает устойчивость штамма ∆gmhA к исследуемым антибиотикам. С другой стороны, изменение работы системы транспорта цистеина, направленное на повышение его внутриклеточной концентрации, усиливает чувствительность клеток ∆gmhA к налидиксовой кислоте (рис. 2).

Рис. 2.

Влияние модулирования метаболизма низкомолекулярных тиолов на чувствительность мутанта ∆gmhA к налидиксовой кислоте (0.25 мкг/мл) и тетрациклину (0.75 мкг/мл). Инактивация генов биосинтеза цистеина cysB и cysE, а также генов биосинтеза глутатиона gshA и gshB вызывает супрессирующий эффект. Активация транспорта цистеина внутрь клетки (P_tet-tcyP) и ограничение экспорта цистеина (∆eamA) повышают чувствительность штамма ∆gmhA к налидиксовой кислоте.

Уровень внутриклеточных низкомолекулярных тиолов в мутантах ∆gmhA на фоне генетической модификации метаболизма цистеина и глутатиона

Ограничение метаболизма цистеина, обусловленное делециями генов cysB и cysE, а также ингибирование синтеза глутатиона (делеции gshA и gshB) приводят к значительному снижению уровня низкомолекулярных тиолов (на 65, 45 и 72% по сравнению с контролем соответственно) (рис. 3а). Это снижение сохраняется в присутствии дополнительной делеции ∆gmhA в случае ∆gmhA ∆cysE и ∆gmhA gshAB или становится еще более выраженным в случае ∆gmhA ∆cysB. В то же время, увеличение уровня цистеина при сверхэкспресии гена tcyP (P_tet-tcyP), который кодирует белок, осуществляющий транспорт цистина [22 ] и сульфоцистеина из периплазмы в цитоплазму клетки [23 ] , не вызывает снижения, а, напротив, приводит к небольшому повышению (на 12%) низкомолекулярных внутриклеточных тиолов. Сверхэкспрессия данного гена в сочетании с делецией gmhA приводит к снижению низкомолекулярных тиолов, однако оно не очень значительно и составляет всего 21%. Делеция гена eamA, кодирующего белок, экспортирующий цистeин (рис. 1), также не вызывает снижения содержания низкомолекулярных тиолов, а его сочетание с делецией gmhA приводит лишь к такому же небольшому снижению, как и одиночная делеция gmhA (рис. 3а). При делеции ∆eamA и сверхэкспрессии P_tet-tcyP в штамме с делецией ∆gmhA наблюдается повышение уровня окисленной формы глутатиона (GSSG), тогда как дополнительные делеции ∆cysE, ∆cysB и ∆gshAB вызывают снижение доли GSSG в клетках E.coli с ∆gmhA (рис. 3б).

Рис. 3.

Уровень внутриклеточных низкомолекулярных тиолов (GSH) (а) и соотношение GSH/GSSG (б) в популяции клеток E. coli с делецией генов gmhA, cysB, cysE, eamA, gshAB, сверхэкспрессией гена tcyP (P_tet-tcyP) и их сочетания с делецией гена gmhA. а – Уровень внутриклеточных низкомолекулярных тиолов в клетках с одиночными делециями и сверхэкспрессией обозначен серыми столбцами, уровень тиолов при совместных делециях и сверхэкспрессии в сочетании с делецией гена gmhA, обозначен штриховкой. б – Доля восстановленного глутатиона (GSH) показана светло-серым цветом; доля окисленного глутатиона (GSSG) – темно-серым. Приведены средние значения ± SD, полученные из трех независимых экспериментов. Звездочками над столбцами обозначено различие между контрольными и опытными образцами, звездочками над чертой отличия между одиночной мутацией ΔgmhA и мутантными штаммами, содержащими ΔgmhA. *p < 0.05.

Влияние изменений метаболизма тиолов и делеции ∆gmhA на редокс-статус и жизнеспособность клеток E. coli

Влияние изменений метаболизма тиолов в комбинации с делецией ∆gmhA на редокс-статус клеток оценивали, измеряя с помощью флуоресцентных красителей уровень тиолов и АФК в популяции живых клеток E. coli с неповрежденной мембраной (рис. 4). Установлено, что полный пул внутриклеточных тиолов снижается при ограничении метаболизма цистеина в результате делеций генов cysB и cysE на 54 и 62%, при ингибировании синтеза глутатиона (делеции gshAB) на 56%, а при усилении импорта цистина (P_tet-tcyP) или замедлении экспорта цистеина (∆eamA) на 48 и 40% соответственно (рис. 4а). При этом, как описано нами ранее, делеция gmhA приводит к возрастанию полного пула внутриклеточных тиолов более чем в 3 раза [7]. Это влияние на редокс-статус оказывается настолько сильным, что даже при комбинации делеций генов, нарушающих метаболизм тиолов (cysB, cysE, gshAB) и транспорт цистина (P_tet-tcyP и ∆eamA), содержание тиолов в двойных мутантах остается повышенным по сравнению с клетками дикого типа (рис. 4а). Наибольшее снижение этого эффекта наблюдалось при делеции cysE; в двойных мутантах (∆cysE ∆gmhA) уровень тиолов был существенно ниже, чем в клетках с одиночной делецией ∆gmhA, и лишь на 47% превышал значение в контрольных клетках дикого типа. При делеции cysB это снижение было незначительным по сравнению с одиночным мутантом ∆gmhA.

Рис. 4.

Изменение уровня внутриклеточных тиолов и уровня АФК в популяции клеток E. coli с делецией генов gmhA, сysB, сysE, eamA, gshAB, сверхэкспрессией гена tcyP (P_tet-tcyP) и их сочетания с делецией гена gmhA. Уровень тиолов (а) и АФК (б) в клетках с вышеперечисленными одиночными делециями и сверхэкспрессией гена tcyP обозначен темно-серыми столбцами; уровень тиолов при совместных делециях и сверхэспрессии в сочетании с делецией gmhA обозначен светло-серыми столбцами. Приведены средние значения ± SD из трех независимых экспериментов. Звездочками над столбцами обозначено различие между контрольными и опытными образцами, звездочками над чертой показаны отличия между одиночной делецией ΔgmhA и мутантными штаммами, содержащими ΔgmhA. *p < 0.05.

Оценка уровня АФК показала, что одиночные мутации в генах метаболизма цистеина и глутатиона, а также в генах транспорта цистина и цистеина приводят к некоторому снижению уровня АФК (рис. 4б). Делеция ∆gmhA, как показано нами ранее, вызывает умеренное (менее чем в 2 раза) повышение уровня АФК. Однако при комбинации делеции gmhA с делецией cysB, нарушающей метаболизм цистеина, и делецией gshAB, нарушающей синтез GSH, наблюдается резкое (более чем в 5‒6 раз) возрастание уровня АФК в клетках (рис. 4б). Это свидетельствует об истощении системы редокс-регуляции, не позволяющей скомпенсировать окислительный стресс, вызванный инактивацией гена биосинтеза АDP-гептозы. Однако делеция гена cysE, которая максимально снижала повышенный уровень GSH в клетках с делецией гена gmhA (рис. 3), полностью нивелирует возрастание уровня АФК, индуцированного данной делецией (рис. 4б).

Увеличение пула внутриклеточного цистина, вызванное повышением его импорта (P_tet-tcyP) или замедлением экспорта цистеина (∆eamA) в клетках с делецией gmhA, также приводит к росту АФК более чем в 3 и 4 раза соответственно. Это объясняется дополнительной нагрузкой на редокс-систему клеток и тратой восстановительных эквивалентов на восстановление цистина.

Рис. 5.

Изменение доли мертвых клеток (%) в популяции клеток E. coli с делецией генов gmhA, cysB, cysE, eamA, gshAB, сверхэкспрессией гена tcyP (P_tet-tcyP) и их сочетания с делецией гена gmhA. Доли мертвых клеток с вышеперечисленными одиночными делециями и сверхэкспрессией гена tcyP показаны темно-серыми столбцами, уровень тиолов при совместных делециях и сверхэспрессии в сочетании с делецией gmhA обозначен светло-серыми столбцами. Приведены средние значения ± SD из трех независимых экспериментов. Звездочками над столбцами обозначено различие между контрольными и опытными образцами; звездочками над чертой показаны отличия между штаммом с одиночной делецией ΔgmhA и мутантными штаммами, содержащими ΔgmhA. *p < 0.05.

Таким образом, снижение ресурсов систем антиоксидантной защиты при делеции gmhA приводит к развитию значительного окислительного стресса.

Одиночные мутации в генах метаболизма цистеина, глутатиона, а также транспорта цистина и цистеина не приводят к повышению числа (%) мертвых клеток в популяции (рис. 5). Однако внесение дополнительной делеции gmhA в клетки с мутациями ∆cysB, ∆cysE и P_tet-tcyP приводит к возрастанию содержания мертвых клеток в популяции, также как и одиночная делеция gmhA, что свидетельствует о снижении жизнеспособности клеток. В случае совместной делеции генов синтеза глутатиона gshAB и делеции гена gmhA процент мертвых клеток ниже, чем при одиночной делеции gmhA (рис. 5). А в клетках с делецией eam-A дополнительная делеция gmhA вообще не приводит к возрастанию количества мертвых клеток в популяции (рис. 5). Необходимо отметить, что для клеток с исследуемыми мутациями, несущих при этом делецию gmhA, не наблюдалось корреляции процента мертвых клеток в популяции с уровнем АФК (рис. 4, 5).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Cогласно традиционным представлениям, низкомолекулярные тиолы ‒ сероводород, цистеин, глутатион ‒ защищают клетки бактерий дикого типа от окислительного стресса [1, 3, 23 ] . Однако на фоне инактивации синтеза ADP-гептозы в клетках E. coli с делецией gmhA развивается окислительный стресс, сопровождающийся снижением пула восстановительных эквивалентов NADPH и редуктивной емкости цитоплазмы [7]. Подобный редокс-дисбаланс, по-видимому, ведет к возрастанию в клетках количества окисленных форм низкомолекулярных тиолов и, как следствие, к депрессии (снижению эффективности) защитных механизмов с участием тиолов. Кроме того, резкое снижение внутриклеточного пула цистеина и генерации H₂S, сопровождающееся повышением уровня восстановленных тиолов, в клетках мутанта ∆gmhA [7] может свидетельствовать о перераспределении серосодержащих метаболитов и возможных редокс-модификациях белков.

В данной работе нами обнаружено, что ограничение метаболизма цистеина (∆cysB и ∆cysE) и ингибирование синтеза глутатиона (∆gshAB) приводят не к ожидаемому возрастанию, а к снижению чувствительности мутанта ∆gmhA к антибиотикам, что особенно ярко выражено в случае такого бактерицидного антибиотика, как налидиксовая кислота. Полученные результаты позволяют предположить, что инактивация биосинтеза ADP-гептозы в клетках E. coli провоцирует развитие окислительного стресса, который сопровождается каскадными необратимыми редокс-модификациями белков с участием цистеина и глутатиона. Снижение общей концентрации низкомолекулярных тиолов ограничивает процессы глутатионилирования и цистеинилирования различных ферментов, снимая токсический эффект и повышая устойчивость штамма ∆gmhA к действию антибактериальных препаратов. Редокс-чувствительные цистеиновые остатки зачастую входят в каталитические центры ферментов центрального метаболизма, в частности, ферментов пентозофосфатного пути ‒ транскетолазы и рибулозо-5-фосфат-эпимеразы [24, 25 ] . Снижение каталитической активности таких ферментов или их полная инактивация могут драматически сказаться на способности клеток осуществлять жизненно важные анаболические процессы и снижать адаптивный потенциал клеток. Кроме того, поскольку уровень цистеина должен поддерживаться в пределах 0.1‒0.2 мМ для предотвращения генотоксичности, а его выкачивание из клетки требует расхода энергии [4], то снижение пула цистеина может сохранить ресурсы клетки, что критично при их недостатке (АТР и NADPH), наблюдаемом, как показано нами ранее [7], у мутантов c делецией gmhA. Действительно, мы наблюдали снижение доли окисленного глутатиона в штаммах ∆gmhA ∆cysE, ∆gmhA ∆cysB и ∆gmhA gshAB E. coli, что свидетельствует об эффективном восстановлении имеющегося глутатиона в данных штаммах, несмотря на снижение общего количества глутатиона (рис. 3).

Блокирование экспорта цистеина (∆eamA) или увеличение импорта (P_tet-tcyP) в клетки цистина, являющего окисленной формой цистеина, приводит к еще большему повышению чувствительности клеток с делецией gmhA к антибиотикам. Это связано с дополнительным истощением пула NADPH, который и так существенно снижен при ингибировании биосинтеза ADP-гептозы [7], поскольку накопление в клетке цистина должно увеличивать расход восстановительных эквивалентов (NADPH) для восстановления цистина до цистеина [22 ] . Повышение концентрации цистина опасно для клетки, так как цистин способствует образованию дисульфидных мостиков в белках, что влияет на их функционирование [27 ] . Например, таким образом цистин активирует щелочную фосфатазу [27 ] . Поэтому клетка старается быстро восстановить цистин, который в результате в нормальных условиях присутствует в малом количестве [28 ] . Вследствие этого не реализуется ингибирование импортера цистина продуктом (цистином), и он продолжает закачиваться в клетки. Наблюдаемое нами возрастание доли окисленной формы глутатиона GSSG при ∆eamA (рис. 3б) обусловлено повышением содержания цистина в клетке, которое способствует увеличению окисления тиоловых групп с образованием дисульфидных мостиков. Превышение нормальной внутриклеточной концентрации цистеина вследствие его восстановления из цистина или блокирования экспорта также опасно для клетки, так как вызывает рост АФК, а также активирует генотоксическую реакцию Фентона [2, 4]. Кроме того, в высокой концентрации цистеин может конкурировать с треонином за активный центр треониндезаминазы, первого фермента пути биосинтеза изолейцина [27 ] . Необходимо отметить, что повышение содержания цистина вследствие окислительного стресса также приводит к росту окисленной формы глутатиона GSSG. Известно, что фактор транскрипции Lrp реагирует на избыток цистеина и индуцирует AlaE, многофункциональный транспортер, который выкачивает цистеин из клетки до тех пор, пока не удастся снизить его уровень. Восстановление цистина и вывод цистеина из клетки существенно увеличивают потребность клеток в NADPH [27 ] . Таким образом, индуцированное нами усиление входа цистина увеличивает расход NADPH [27 ] , а замедление выхода цистеина приводит к восстановлению железа и генотоксичности [4]. В обоих случаях наблюдается рост окисленной формы глутатиона (GSSG) (рис. 3), которая может непосредственно взаимодействовать с тиоловыми группами белков, вызывая их глутатионилирование [29 ] . Кроме того, снижение уровня NADPH приводит к активации глутатионилирования белков глутаредоксином [24, 29 ] . Также необходимо отметить, что для того, чтобы справиться с избытком цистина и цистеина, клетке необходимо расходовать АТР, содержание которой в мутантах с делецией gmhA снижено в 2 раза [7]. Еще одним механизмом повышения чувствительности к антибиотикам в данном случае может быть нарушение окислительного фолдинга белков в периплазме E. coli. Таким образом, мы полагаем, что основной причиной возрастания чувствительности к антибиотикам штамма с делецией gmhA при росте уровня цистина и цистеина является истощение энергетических ресурсов клетки и редокс-модификации белков.

Внесение исследуемых мутаций приводит к снижению общего внутриклеточного пула тиолов, повышенного вследствие инактивации синтеза АDP-гептозы в клетках с делецией gmhA. Это предсказуемый результат, обусловленный значительным снижением уровня цистеина и глутатиона в клетках, а нарушение транспорта цистина создает избыток окисленных форм, требующий NADPH, что снижает способность клетки восстанавливать тиоловые группы. Наибольший эффект достигается в случае делеции cysE. Кроме того, эта делеция полностью нивелирует возрастание продукции АФК, вызванное делецией gmhA, в то время как все остальные мутации в генах, регулирующих метаболизм цистеина и глутатиона, а также нарушение транспорта цистина приводят к еще большему повышению уровня АФК в клетках с делецией gmhA. Поскольку O-ацетилсерин ‒ продукт реакции, катализируемой ацетилсеринтрансферазой, активирует регуляторный белок CysB, а также является интермедиатом в пути биосинтеза цистеина, то вполне объяснима более значительная супрессия эффекта делеции gmhA в клетках с ΔcysE по сравнению с ΔcysB.

Таким образом, не выявлена корреляция цитотоксического действия антибиотиков с уровнем АФК, общим пулом тиолов или жизнеспособностью исходной популяции клеток. Однако обнаружена корреляция между ростом чувствительности к антибиотикам и повышением доли окисленного глутатиона (GSSG). В мутантах с большей чувствительностью к антибиотикам уровень GSSG выше, а в мутантах с пониженной чувствительностью ниже. Полученные данные свидетельствуют о том, что причиной снижения чувствительности клеток с делецией gmhA к антибиотикам является истощение пула низкомолекулярных тиолов, наблюдаемое при нарушении метаболизма цистеина и глутатиона, в то время как увеличение содержания цистина ‒ окисленной формы цистеина, или цистеина, напротив, приводит к увеличению чувствительности данных клеток к антибиотикам.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект № 17-74-30030).

Настоящая работа не содержит описания исследований с использованием людей и животных в качестве объектов.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.