Молекулярная биология, 2023, T. 57, № 6, стр. 1077-1083

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Реагенты. В работе использованы ЭДТА, дезоксихолат натрия, глицин, мышиные моноклональные антитела против Hsp70 (Lot: 029K4845, “Sigma-Aldrich”, США), Tris, перекись водорода, коктейль ингибиторов протеаз, CHAPS и PMSF (“Sigma-Aldrich”); Affi-gel 10, акриламид, метилен-бис-акриламид и другие реагенты для проведения электрофореза в ПААГ (“Bio-Rad”, США); PVDF-мембраны (“ICN Biomedical”, США); Тriton X-100, глутаровый альдегид, имидазол (“Merck”, Германия); Coomassie R-250 (“Serva”, Германия). Мелиттин из яда пчелы (свободный от фосфолипазы A2), полученный методом ВЭЖХ, покупали у фирмы “Аура” (Россия).

Получение модифицированного мелиттином аффинного сорбента. Для получения аффинного сорбента для выделения мелиттинспецифичных антител использовали сорбент Affi-gel 10. Сначала 5 мл геля дважды промывали 5-кратным объемом холодной деионизованной воды и один раз 5-кратным объемом холодного раствора 100 мМ MOPS (рН 7.4). Навеску мелиттина (75 мг) растворяли в 10 мл 100 мМ MOPS, рН 7.4 (из расчета 15 мг мелиттина на 1 мл геля). Раствор мелиттина (10 мл) добавляли к 5 мл носителя и инкубировали при перемешивании при 4ºС в течение 2.5 ч. Жидкость декантировали, добавляли двукратный объем 100 мМ раствора МOPS (рН 7.4), в который для блокировки свободных сукцинимидных групп вносили 0.5 мл 1 М раствора этаноламина, рН 8.0 (из расчета 100 мкл раствора на 1 мл носителя). Полученную суспензию инкубировали в течение 1 ч при 4°С.

Получение поликлональных антител против мелиттина. Поликлональные антитела против мелиттина, сшитого 3%-ным глутаровым альдегидом (для повышения иммуногенности), были получены путем иммунизации кроликов, как описано ранее [5]. Антитела очищали с использованием модифицированного мелиттином Affi-gel 10. Готовый аффинный носитель объемом 5 мл и емкостью 15 мг белка на 1 мл помещали в хроматографическую колонку, в которую вносили частично очищенные антитела со скоростью 20 мл/ч. Носитель промывали последовательно 10-кратным объемом PBS (pH 7.2) с 0.1% Tween-80 (PBST), 5-кратным объемом буфера 100 мМ Gly-HCl (pH 2.5) и 10-кратным объемом PBST до нулевого значения оптической плотности. Фракцию не сорбировавшихся на колонке белков элюировали PBST, cодержащим 0.2% NaN₃, а затем тем же раствором, содержащим дополнительно 300 мМ NaCl. Для элюции антител с колонки использовали буфер 100 мМ Gly-HCl, рН 2.5. В полученном препарате антител рН доводили до нейтральных значений с помощью 1 М раствора NaHCO₃ (pH 8.0) и диализовали дважды против PBS, содержащего 0.2% NaN₃.

Концентрацию белка во фракциях, полученных в ходе аффинной хроматографии, определяли методом Лоури [7]. В качестве стандарта использовали раствор БСА (“Thermo Fisher Scientific”, США) с концентрацией 2 мг/мл.

Препарат антител, связывающихся с мелиттином, использовали в качестве лиганда для получения аффинного сорбента (по методике, приведенной выше для мелиттина) с целью выделения мелиттинподобных белков из гомогената почек мыши (к 1 мл носителя добавляли 6 мг антител).

Электрофорез белков в SDS-ПААГ и иммуноблотинг. Фракции элюата, полученные в ходе аффинной хроматографии, анализировали электрофорезом в 10%-ном SDS-ПААГ. Электроперенос белков с геля на PVDF-мембрану проводили в течение 1 ч 30 мин при силе тока 200 мА. После окончания электропереноса мембрану блокировали в 5%-ном сухом молоке (“Valio”, Финляндия), приготовленном на PBST, в течение 1 ч при комнатной температуре и постоянном перемешивании. Далее добавляли поликлональные антитела, специфичные к мелиттину и очищенные методом аффинной хроматографии, в разведении 1 : 1000 и инкубировали мембрану в течение 1 ч при комнатной температуре и перемешивании. Мембрану отмывали PBST от несвязавшихся первичных антител 3 раза по 10 мин и инкубировали с конъюгированными с пероксидазой хрена (HRP) мышиными антителами против IgG кролика (“Sigma-Aldrich”) в разведении 1 : 5000 в течение 1 ч при комнатной температуре. Для визуализации комплексов антиген-антитело использовали коммерческий набор ECL-kit SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate (“Thermo Fisher Scientific”) и прибор ChemiDoc XRS+ Molecular Imager (“Bio-Rad”).

Очистка мелиттинподобных белков. Фракция мелиттинподобных белков с молекулярной массой ~70 кДа была очищена из гомогената почек мыши с использованием метода аффинной хроматографии [8]. Все операции по получению гомогената проводили при 4°С. Почки двух мышей общей массой 0.93 г измельчали ножницами, добавляли 10-кратный объем среды выделения (30 мМ имидазол, рН 7.4, 130 мМ NaCl, 5 мМ ЭДТА, 1.1% Triton X-100, 0.25% CHAPS, 2 мкМ PMSF, коктейль ингибиторов протеаз). Коктейль ингибиторов протеаз и PMSF вносили непосредственно перед выделением. Ткань гомогенизировали с помощью гомогенизатора Potter-Elvehjem (“Kleinfeld”, США). Гомогенат центрифугировали в течение 10 мин при 13 000 g, осадок удаляли, а супернатант пропускали через бумажный складчатый фильтр. Далее супернатант в объеме 8 мл наносили на колонку с носителем Affi-gel 10 с иммобилизованными антителами, специфичными к мелиттину. Не связавшиеся с носителем компоненты сыворотки отмывали PBST c 0.2% NaN₃ и затем тем же раствором, содержащим дополнительно 300 мМ NaCl. Для элюции мелиттинподобных белков использовали буфер 100 мМ Gly-HCl (рН 2.5). Во фракциях, содержащих мелиттинподобные белки, рН доводили до нейтральных значений раствором 1 М NaHCO₃ (pH 8.0). Полученный препарат мелиттинподобных белков анализировали методами электрофореза по Лэммли [9] и иммуноблотинга.

Идентификация мелиттинподобных белков. Целевые фракции аффинной хроматографии анализировали методами электрофореза в 10%-ном SDS-ПААГ и иммуноблотинга с использованием в качестве первичных антител мелиттинсвязывающей фракции сыворотки кролика (см. выше), а в качестве вторичных ‒ HRР-конъюгированные мышиные антитела против IgG кролика.

Кроме того, проведен масс-спектрометрический анализ полученных белков. Препараты мелиттинподобных белков для масс-спектрометрического анализа готовили следующим образом. Реактивы для электрофореза фильтровали через фильтры с размером пор 0.45 мкм в ламинарном боксе. Образцы белковой фракции наносили на ПААГ и проводили электрофорез при силе тока 25 мА в концентрирующем и 50 мА в разделяющем гелях по методу Лэммли. Гель окрашивали раствором Coomassie R-250. В ламинарном боксе из геля вырезали белковые полосы, измельчали их на кубики размером 1 мм × 1 мм и помещали в 100 мкл деионизованной воды. Полученные образцы белков анализировали в Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (Москва) с использованием метода тандемной масс-спектрометрии, сопряженной с ВЭЖХ с нанопотоками (LC-MS/MS).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

На рис. 1 представлен профиль элюции сыворотки крови иммунизированного кролика (30 мл с концентрацией белка 3 мг/мл) на колонке с Affi-gel 10 с иммобилизованным мелиттином.

Рис. 1.

Профиль элюциии белков сыворотки крови кролика, иммунизированного мелиттином, с колонки с носителем Affi-gel 10, конъюгированным с мелиттином. Пунктирной линией указан градиент рН.

Фракцию поликлональных антител, элюированных с колонки после резкой смены рН, анализировали методом иммуноблотинга с окрашиванием вторичными антителами ‒ HRP-конъюгированными антителами мыши против IgG кролика. На рис. 2 представлены результаты электрофореза этой фракции (2а) и последующего иммуноблотинга (2б) с использованием вторичных антител, а также детекция мелиттина на PVDF-мембране с использованием полученной сывороточной фракции антимелиттиновых антител (2в).

Рис. 2.

Анализ белкового состава сыворотки иммунизированного мелиттином кролика в ходе аффинной хроматографии и анализ специфичности полученных антител. Анализ белкового состава фракций элюата аффинной хроматографии методом электрофореза в SDS-ПААГ (а) и идентификация фракций, содержащих IgG кролика, методом иммуноблотинга с использованием HRP-конъюгированных мышиных антител соответствующей специфичности (б). На дорожки 1а и 1в нанесены маркеры молекулярной массы белков PageRuler Plus Prestained Protein Ladder (“Thermo Fisher Scientific”, США), 1б ‒ Spectra Multicolor Low Range Protein Ladder (“Thermo Fisher Scientific”); на дорожки 2‒4 ‒ фракции антител, соответствующие пику их элюции. Анализ специфичности антител (в) во фракциях, полученных в результате аффинной хроматографии, методом иммуноблотинга с использованием мелиттина (указано стрелкой) в качестве антигена.

Как видно на рис. 2б, мышиные антитела против IgG кролика связываются с двумя белковыми полосами ‒ c кажущимся молекулярным массам ~55 и ~25 кДа, которые соответствуют тяжелым и легким цепям IgG. Показано, что объединенный образец фракций 2‒4 связывается с мелиттином (рис. 2в), то есть в очищенной аффинной хроматографией сыворотке кролика присутствуют целевые антитела.

Доказав, что полученные нами и очищенные методом аффинной хроматографии антитела связывают мелиттин, мы использовали их в качестве лиганда для аффинной хроматографии ‒ с целью получения белков с мелиттинподобными детерминантами. Антитела, содержащиеся в объединенной фракции, иммобилизовали на носителе Affi-gel 10. Профиль элюции супернатанта, полученного после центифугирования гомогената из почек мыши и нанесенного на Affi-gel 10 с иммобилизованными антителами на мелиттин, представлен на рис. 3. Белки, вышедшие с колонки при рН элюирующего буфера 2.5, проанализированы методами электрофореза в ПААГ и иммуноблотинга. Результаты анализа представлены на рис. 4.

Рис. 3.

Профиль элюции белков супернатанта, полученного из гомогената почек мыши, с носителя Affi-gel 10, на котором иммобилизованы антитела против мелиттина.

Рис. 4.

Анализ фракции мелиттинподобных белков, полученной в результате аффинной хроматографии гомогената почек мыши (см. рис. 3). а ‒ Электрофорез в 10%-ном SDS-ПААГ с окрашиванием Coomassie R-250; б ‒ иммуноблотинг с использованием антител против мелиттина, полученных из сыворотки кролика (см. рис. 2), и вторичных антител ‒ HRP-конъюгированных мышиных антител против IgG кролика. Для маркировки молекулярной массы белков использован набор PageRuler Plus Prestained Protein Ladder (“Thermo Fisher Scientific”).

Белки, находящиеся в белковой полосе с молекулярной массой ~70 кДа, анализировали с использованием технологии тандемной масс-спектрометрии, сопряженной с ВЭЖХ с нанопотоками (LC-MS/MS). Результаты анализа представлены в табл. 1.

Таким образом, масс-спектрометрический анализ показал, что в полученной нами фракции мелиттинподобных белков содержится семь белков, три из которых являются молекулярными шаперонами из суперсемейства Hsp70: mtHsp70 (морталин), Hsp73 и Grp78.

Для подтверждения этих данных мы провели иммуноблотинг фракции мелиттинподобных белков с использованием антител не только против мелиттина, но и против Hsp70. Как видно из результатов, представленных на рис. 5, взаимодействующие с антителами против мелиттина белки связывались и с антителами против Hsp70.

Рис. 5.

Анализ мелиттинподобных белков с молекулярной массой ~70 кДа методом иммуноблотинга с использованием антител против мелиттина (1) и Hsp70 (2). Для маркировки молекулярной массы белков использован набор Blue Plus® V Protein Marker (“TransGen Biotech Co.”, Китай).

Ранее мы обнаружили, что при иммунопреципитации Na⁺/K⁺-АТРазы из гомогената почек мыши с использованием антител против α1-субъединицы совместно с ней осаждаются белки с молекулярной массой около 70 кДа, которые окрашиваются антителами против мелиттина. При перекрестной иммунопреципитации ‒ с использованием антител против мелиттина ‒ в осадке обнаружили α1-субъединицу Na⁺/K⁺-АТРазы. Более того, предварительная обработка гомогената специфическим ингибитором Na⁺/K⁺-АТРазы уабаином в концентрации 0.5 мМ приводила к увеличению количества мелиттинподобного белка с молекулярной массой ~70 кДа в иммунопреципитате [8]. На основании этих данных мы предположили, что Na⁺/K⁺-АТРаза взаимодействует с этим белком, а связывание Na⁺/K⁺-АТРазы с уабаином усиливает это взаимодействие.

В проведенном теперь исследовании получены белки, взаимодействующие с антителами против мелиттина, а методом масс-спектрометрии в этой фракции идентифицировано три белка-шаперона из суперсемейства Hsp70. Пока у нас нет информации о том, какой из них взаимодействует с Na⁺/K⁺-АТРазой. Попробуем гипотетически объяснить факт увеличения количества мелиттинподобного белка, связывающегося с Na⁺/K⁺-АТРазой в присутствии уабаина. Скорее всего, уабаин переводит Na⁺/K⁺-АТРазу в конформацию, которая лучше взаимодействует с шапероном, что приводит удалению комплекса Na⁺/K⁺-АТРаза–уабаин из мембраны. Логично предположить, что это происходит под действием шаперона Нsp70, который функционирует при фолдинге белков, а также при солюбилизации агрегированных белков [10].

Два других шаперона, обнаруженных во фракции мелиттинподобных белков (морталин и Grp78), также могут иметь отношение к удалению Na⁺/K⁺-АТРазы из плазматической мембраны. Однако они относятся к шаперонам эндоплазматического ретикулума и скорее имеют отношение к фолдингу и доставке Na⁺/K⁺-АТРазы к плазматической мембране. Нами показано, что шаперон, взаимодействующий с Na⁺/K⁺-АТРазой, содержит мелиттинподобный мотив, но ответ на вопрос о его функциональной значимости остается пока открытым. Предстоит выяснить и другие вопросы, поставленные результатами проведенного исследования: какой именно шаперон взаимодействует с Na⁺/K⁺-АТРазой; приводит ли это взаимодействие к удалению фермента из мембраны и необходим ли для этого мелиттинподобный мотив.

Настоящая статья не содержит описания каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.