Молекулярная биология, 2023, T. 57, № 6, стр. 1188-1198

ВВЕДЕНИЕ

Эритроциты – самые многочисленные клетки крови, обеспечивающие снабжение всех органов и тканей кислородом, который переносится основным белком эритроцитов гемоглобином. Продолжительность жизни и функциональная активность эритроцитов определяется условиями их созревания в красном костном мозге, а также различными стрессовыми факторами и составляет в среднем около 115 дней [1]. Вследствие отсутствия органелл и рибосом эритроцит имеет ограниченный и невосполняемый запас белков [1–3], окислительное повреждение которых приводит к изменению функционирования и старению эритроцита [4]. Перемещаясь по кровотоку, эритроциты испытывают механический, осмотический и метаболический стресс. Последний во многом обусловлен прохождением клеток через органы и ткани с различным содержанием кислорода и доступностью питательных веществ, что в свою очередь влияет на редокс-статус эритроцитов и их способность восполнять уровень АТФ. Выраженность стресса определяется функциональным состоянием организма. Метаболический стресс в эритроцитах возникает при дефиците АТФ и NADPH вследствие снижения уровня глюкозы в крови при голодании или метаболических нарушениях [5]. Так, например, сахарный диабет (СД) типа 1 и 2 приводит к сверхфизиологическим колебаниям уровня глюкозы, а заболевания дыхательной системы (например, хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ), астма, фиброз легких) приводят к формированию дыхательной недостаточности, метаболического ацидоза и хронической гипоксии [6, 7]. Пожилые люди с диабетом имеют более высокий риск гипогликемии из-за возрастного нарушения целого ряда адаптивных физиологических реакций [8]. Хроническая гипогликемия повышает риск когнитивной дисфункции и сердечно-сосудистых заболеваний. Частота возникновения гипогликемических эпизодов коррелирует с длительностью заболевания СД и продолжительностью лечения инсулином [9]. Для того, чтобы предотвратить или уменьшить влияние гипогликемии на функциональное состояние эритроцитов, необходимо понимать, к каким изменениями состояния эритроцитов приводит данный фактор.

Из-за отсутствия митохондрий эритроцитам недоступен аэробный путь получения АТФ с помощью дыхания [10], и в зрелых эритроцитах гликолиз является единственным источником АТФ. На синтез АТФ посредством гликолиза затрачивается около 90% поступающей в эритроциты глюкозы, а оставшиеся 10% направляется по пентозофосфатному пути, в котором происходит образование NADPH [11]. При активном расходовании NADPH концентрация NADP⁺ в цитозоле эритроцитов растет, в результате чего активируется пентозофосфатный путь, позволяющий восстановить окисленный NADPH. Дефицит АТФ приводит к нарушению функции трансмембранных ионных насосов (Na⁺/K⁺-АТФазы, Ca²⁺-АТФазы), обеспечивающих поддержание ионного градиента, а так-же синтеза восстановленного глутатиона (GSH), являющегося важным звеном антиоксидантной защиты; метаболизма пуринов и пиримидинов; поддержания железа гемоглобина в восстановленном состоянии (Fe²⁺); защиты клеточных белков от окислительного повреждения; сохранения асимметрии мембранных фосфолипидов [10, 12]. Неспособность эритроцитов обеспечить свои энергетические потребности при гипогликемии приводит к нарушению работы антиоксидантной системы, повреждению ограниченного запаса белков, ускорению процессов старения и преждевременному гемолизу [13].

Процессы формирования активных форм кислорода (АФК) в эритроцитах до конца не изучены, однако известно, что аутоокисление гемоглобина приводит к продукции супероксид-аниона. Дисфункция ионных транспортеров, перегрузка кальцием, а также формирование АФК эндотелиальными клетками приводят к окислительному стрессу в эритроцитах, что в свою очередь индуцирует перекисное окисление липидов и окислительное повреждение белков [14]. Антиоксидантная система эритроцитов состоит из ферментов, таких как супероксиддисмутаза (СОД), катализа, пероксиредоксин-2, глутаредоксин, глутатионпероксидаза, NADPH, и пула восстановленного GSH [4] ‒ основного низкомолекулярного тиола клеток млекопитающих [15]. При развитии окислительного стресса GSH взаимодействует с АФК и окисленными до SOH тиоловыми группами белков, что приводит к существенному снижению отношения восстановленного глутатиона к окисленному глутатиону (GSH/GSSG) и инициирует запуск глутатионилирования тиоловых групп белков [16]. Глутатионилирование тиоловых групп не только предотвращает их необратимое окисление, но и в ряде случаев изменяет функциональную активность белка [17, 18]. При нормализации редокс-статуса, а именно восстановлении уровня NADPH, глутаредоксин осуществляет деглутатионилирование SH-групп белков [16]. Гемоглобин также способен подвергаться глутатионилированию, которое считается одним из маркеров окислительного стресса эритроцитов [19]. В настоящее время имеющиеся в литературе данные о влиянии депривации глюкозы на состояние эритроцитов в организме [20, 21] и изолированных эритроцитов [22, 23] несколько противоречивы, поэтому вопрос о влиянии глюкозного голодания на редокс-статус изолированных эритроцитов и редокс-зависимые модификации гемоглобина остается открытым.

Понимание ключевых механизмов повреждения и адаптации эритроцитов при метаболическом стрессе позволит разработать новые подходы для повышения их адаптационной способности при различных патологических состояниях. В данной работе мы охарактеризовали состояние эритроцитов при метаболическом стрессе, индуцированном отсутствием глюкозы, по изменению их размера, уровня АТФ, внутриклеточного редокс-статуса, ионного гомеостаза и степени глутатионилирования гемоглобина.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Подготовка образцов. Забор образцов проводили во время донации цельной донорской крови из контейнера Бактивам (“Maco Pharma”, Франция) в пробирку с гепарином после поворота ‒ для предотвращения попадания воздуха в адаптер для вакуумных пробирок Вакувам (“Improvacuter”, Россия). Отсутствие воздуха предотвращало активацию клеточного состава, гепарин необходим для антикоагуляции. Для получения эритроцитов кровь центрифугировали, отбирали супернатант и ресуспендировали эритроциты в буфере, имитирующем плазму крови (140 мМ NaCl, 4 мМ KCl, 2 мМ СaCl₂, 0.75 мМ MgSO₄, 0.015 мМ ZnCl₂, 100 мкМ L-аргинин, 200 мкМ глутамат натрия, 200 мкМ глицин, 200 мкМ аланин, 600 мкМ глутамин, 20 мМ HEPES-имидазол, pH 7.4), как описано ранее [24]. Процедуру центрифугирования повторяли трижды. В буфер, используемый для ресуспендирования контрольной группы, предварительно добавили 10 мМ глюкозы. Отмытые эритроциты ресуспендировали соответствующим буфером (в объемном соотношении 1 : 2) и инкубировали в буфере с глюкозой (контроль) и в безглюкозной среде (стресс) в течение 24 ч при 37°С.

Проточная цитометрия. Методом проточной цитофлуометрии проведен анализ внутриклеточного редокс-статуса клеток по уровням GSH, АФК и оксида азота (NO), а также определен уровень внутриклеточного кальция (Ca²⁺). Для окрашивания клеток флуоресцентными красителями 1 мкл суспензии эритроцитов ресуспендировали в 100 мкл буфера, имитирующего плазму крови, с глюкозой (контроль) и без глюкозы (стресс). Содержание низкомолекулярных тиолов оценивали с использованием флуоресцентного красителя монобромбимана (Ex/Em = 392/490 нм; “Thermo Fisher Scientific”, США), который добавляли до конечной концентрации 20 мкМ [24]. Уровень АФК и уровень NO определяли с помощью окрашивания 5 мкМ дигидрородамина 123 (DHR123) (Ex/Em = 507/525 нм; “Thermo Fisher Scientific”) [25] и 5 мкМ DAF-FM DA (Ex/Em = 495/515 нм; “Thermo Fisher Scientific”) [26] соответственно. Внутриклеточный Ca²⁺ определяли окрашиванием клеток 2.5 мкМ Fluo-4 (Ex/Em = 494/506 нм; “Thermo Fisher Scientific”), как описано ранее [27]. После окрашивания клетки инкубировали в темноте в течение 30 мин при 37°C. Также оценивали среднее значение параметров малоуглового (FSC) и бокового светорассеяния (SSC), характеризующих соответственно размер и форму/гранулярность клеток [28]. Анализ эритроцитов проводили на проточном цитофлуориметре BD LSRFortessa™ (“Becton Dickinson”, США).

Атомно-абсорбционная спектрометрия. Методом атомно-абсорбционной спектрометрии оценивали содержание ионов Na⁺ и K⁺ в контрольных образцах и образцах после стресса, как описано ранее [29]. После завершения эксперимента клетки несколько раз отмывали холодным раствором 0.1 M MgCl₂ путем центрифугирования при 2000 g в течение 10 мин с последующим отбором супернатанта и ресуспендированием клеток в 0.1 M MgCl₂. После отмывки осажденные клетки ресуспендировали в 5%-ной трихлоруксусной кислоте (ТХУ) для осаждения белков [30]. После центрифугирования в течение 10 мин при 13 700 g супернатант собирали и определяли в нем концентрации ионов Na⁺ и K⁺ на приборе Квант-2М (“КОРТЭК”, Россия) [31]. Осадок растворяли в 0.1 M NaOH и использовали для определения белка по методу Бредфорда. Полученные значения концентраций Na⁺ и K⁺ в пробах нормировали на содержание в них белка.

Оценка уровня АТФ. Содержание АТФ в клетках оценивали по уровню флуоресценции на микропланшетном ридере Spark (“Tecan”, Австрия) при помощи набора ATP Assay Kit (“Sigma-Aldrich”, США) [26].

Иммуноблотинг. Глутатионилирование гемоглобина в клетках оценивали методом иммуноблотинга. После инкубации клеток в безглюкозной среде или в контрольных условиях эритроциты лизировали путем трехкратного цикла разморозки‒заморозки и добавляли буфер для образцов (Tris-Glycine SDS sample-buffer; “Novex”, США) без меркаптоэтанола. Электрофорез проводили в 14%-ном ПААГ. Перед инкубацией в блокирующем буфере (5%-ное молоко) мембраны фиксировали 5%-ным раствором формалина в течение 40 мин (для снижения потерь α- и β‑субъединиц гемоглобина, M_r 12‒13 кДа). Уровень глутатионилирования гемоглобина оценивали с использованием антител на глутатион в составе белков (MAB5310; “Millipore”, США) в разведении 1 : 1000. Полученный сигнал нормировали на содержание α- и β-субъединиц гемоглобина, которое оценивали с использованием коммерческих антител (ab92492 и ab214049 соответственно; “Abcam”, Великобритания) в разведении 1 : 1000.

Статистическая обработка. Статистический анализ проводили в программе GraphPad Prism 8. Нормальность распределения данных оценивали по критерию Шапиро‒Уилка. Для оценки достоверности различий между двумя группами использовали парный t-критерий Стьюдента для двух зависимых (парных) выборок. При значении p < 0.05 различия между средними значениями групп считали достоверными. На графиках приведены средние значения и величина стандартного отклонения, рассчитанные на основании 3‒5 независимых экспериментов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

С целью оценить влияние депривации по глюкозе на энергетический баланс эритроцитов определяли уровень АТФ. Установлено, что инкубация эритроцитов в безглюкозной среде в течение 24 ч приводит к существенному снижению уровня АТФ в клетках – на 47% относительно контроля (p = 0.0149) (рис. 1). Известно, что падение уровня АТФ ниже 25% от нормального приводит к разрушению цитоскелета с последующим гемолизом [32]. В условиях проведенного нами эксперимента критического падения внутриклеточного АТФ не зарегистрировано. Таким образом, наблюдаемое через 24 ч депривации по глюкозе снижение содержания АТФ свидетельствует об успешной индукции метаболического стресса в эритроцитах.

Рис. 1.

Содержание АТФ в эритроцитах через 24 ч инкубации в среде с глюкозой (контроль) и в безглюкозной среде (стресс). Данные представлены как среднее ± SD, n = 3.

Как следует из результатов, полученных методом проточной цитометрии, 24-часовая инкубация эритроцитов в безглюкозной среде приводила к росту среднего значения малоуглового рассеяния (FSC), характеризующего размер клеток, на 40% (p = 0.0160) (рис. 2a); при этом параметр бокового рассеяния клеток (SSC), характеризующий их гранулярность и форму, практически не изменялся (рис. 2б).

Рис. 2.

Изменение параметров малоуглового (FSC) (а) и бокового (SSC) (б) светорассеяния эритроцитов через 24 ч инкубации в среде с глюкозой (контроль) и в безглюкозной среде (стресс). Данные представлены как среднее ± SD, n = 5.

Для того, чтобы выяснить, с чем связано изменение объема клеток, мы оценили внутриклеточные уровни ионов Na⁺ и K⁺. Установлено, что при метаболическом стрессе существенно (p = 0.0104) возрастает содержание внутриклеточного Na⁺ (рис. 3а). Концентрация K⁺ при этом достоверно не меняется, хотя и наблюдается некоторая тенденция к снижению (рис. 3б). Таким образом, увеличение размера клеток связано с нарушением градиента Na⁺ и K⁺, что, по-видимому, обусловлено снижением активности Na⁺/K⁺-АТФазы.

Рис. 3.

Содержание в эритроцитах внутриклеточного Na⁺ (а) и K⁺ (б) через 24 ч инкубации в среде с глюкозой (контроль) и в безглюкозной среде (стресс). Данные представлены как среднее ± SD, n = 3.

Как видно из результатов, представленных на рис. 4а, не выявлено значимых отличий в уровне внутриклеточного Ca²⁺ через 24 ч инкубации в безглюкозной среде по сравнению с контролем.

Рис. 4.

Уровень Ca²⁺ (а), АФК (б), GSH (в), NO (г) в эритроцитах через 24 ч инкубации в среде с глюкозой (контроль) и в безглюкозной среде (стресс). За 100% принято значение исследуемых параметров в контроле. Данные представлены как среднее ± SD, n = 5.

Влияние метаболического стресса на редокс-статус эритроцитов оценивали по изменению уровня АФК, GSH и NO при инкубации в условиях депривации глюкозы. Выявлено, что через 24 ч глюкозного голодания уровень АФК не изменялся (рис. 4б), что свидетельствует об отсутствии окислительного стресса. Несмотря на это, наблюдалось значительное, на 42% (p = 0.0115), снижение уровня GSH (рис. 4в). Уровень NO при этом достоверно не изменялся (p = 0.1418), хотя тенденция к снижению просматривалась (рис. 4г).

С целью оценить, как метаболический стресс влияет на состояние основного белка эритроцитов ‒ гемоглобина, мы определили степень его глутатионилирования. Согласно результатам иммуноблот-анализа, 24-часовой метаболический стресс эритроцитов приводил к значительному, почти в 2 раза, увеличению степени глутатионилирования гемоглобина (рис. 5).

Рис. 5.

Уровень глутатионилирования гемоглобина (Hb) через 24 ч инкубации эритроцитов в среде с глюкозой (контроль) и в безглюкозной среде (стресс). Иммуноблотинг с антителами против глутатионилированного белка (GS-Hb) (а) и α-субъединицы гемоглобина (α-Hb) (б). в ‒ Результаты количественного анализа. За 100% принят уровень глутатионилирования Hb в эритроцитах, инкубируемых в присутствии глюкозы (контроль). Данные представлены как среднее ± SD.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В проведенном исследовании оценили изменения в состоянии эритроцитов и их основного белка ‒ гемоглобина ‒ в условиях метаболического стресса, который был вызван отсутствием глюкозы в среде инкубации. В результате 24-часового голодания по глюкозе в эритроцитах в 2 раза снижался уровень АТФ по сравнению с соответствующим временным контролем (рис. 1). Ранее в литературе описано и более существенное (на 80% от начального значения) снижение АТФ при отсутствии глюкозы в среде [22]. Однако необходимо заметить, что авторы, G. Pompeo и др. [22], не приводят данные о соответствующим временном контроле, и описанный ими буфер для эритроцитов не содержал не только глюкозы, но и аминокислот, в то время как нами использована среда, имитирующая плазму крови, в состав которой входил ряд необходимых аминокислот.

В организме человека физиологической нормой считается суточная гликемическая вариабельность, подразумевающая поочередную смену пониженного и повышенного уровня глюкозы [33], который варьирует в пределах 3.9–6.1 ммоль/л. Снижение уровня глюкозы ниже 3.9 ммоль/л считается состоянием гипогликемии, хотя первые симптомы начинают проявляться при снижении содержания глюкозы до 3.0 ммоль/л [8, 34]. При некоторых заболеваниях, таких как СД типа I и II [35, 36], поражениях гипофиза [37], патологических состояниях (сепсис [38]), в том числе обусловленных хирургическим вмешательством (бариатрическая хирургия [39]) и несвоевременной коррекцией гипогликемической терапии [40], может развиваться хроническая гипогликемия, которая влечет за собой развитие окислительного стресса, вызывающего сосудистые осложнения, риск тромбозов и эндотелиальную дисфункцию [41].

Гипогликемия, индуцированная введением инсулина здоровым волонтерам, также приводила к быстрому росту АФК как в эндотелиальных клетках [41], так и в эритроцитах [21], такой же эффект вызывала физическая активность пациентов с СД типа 2 [20]; при этом падал уровень тиолов и снижалась активность СОД [21]. Согласно полученным нами данным, инкубация эритроцитов в отсутствие глюкозы в течение 24 ч не приводит к росту АФК (рис. 4б). Это может быть связано с тем, что в организме АФК возрастает вследствие окислительного стресса эндотелиальных клеток, чего в изолированных эритроцитах не происходит.

Несмотря на отсутствие окислительного стресса в изолированных эритроцитах, нехватка глюкозы приводит к значительному снижению уровня GSH (рис. 4в). Это обусловлено как недостатком NADPH, необходимого для восстановления GSSG глутатионредуктазой, так и нарушением синтеза GSH ферментами синтеза глутатиона: γ-глутамилцистеинсинтетазой и глутатионсинтазой, ‒ вызванного дефицитом АТФ [23]. Ранее показано, что нарушение метаболизма глюкозы через пентозофосфатный путь в эритроцитах быстро приводит к снижению содержания NADPH и GSH [42]. В отсутствие глюкозы в среде происходит ингибирование глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (G6PD) ‒ основного фермента пентозофосфатного пути, в ходе которого NADP⁺ восстанавливается до NADPH. Известно, что снижение активности G6PD вследствие мутаций или при добавлении ингибитора ведет к повышению чувствительности эритроцитов к окислительному стрессу и, как следствие, к их усиленному гемолизу. Это один из механизмов патогенеза гемолитической анемии. В клетках с дефицитом G6PD GSSG не восстанавливается до GSH; а при окислительном стрессе в клетке не происходит восстановления дисульфидных связей в мембранных белках, которое индуцируется присутствием GSH [43]. При анализе метаболомного состава эритроцитов, испытывающих недостаток глюкозы в течение 48 ч, наблюдали снижение общего пула глутатиона, которое происходило на фоне роста внутриклеточных концентраций непосредственных его предшественников – глутамата и цистеина [23]. Это свидетельствует о том, что вследствие недостатка АТФ снижается активность двух АТФ-зависимых ферментов, участвующих в синтезе глутатиона: γ-глутамилцистеинсинтетазы и глутатионсинтазы. Также наблюдается снижение метаболитов гликолиза и увеличение отношения пирувата к лактату, что свидетельствует о нарушении гомеостаза восстановительных эквивалентов [23].

Условия снижения уровней GSH и NADPH благоприятны для глутатионилирования внутриклеточных белков [17]. Нами обнаружено, что индуцированный метаболический стресс вызывает повышение уровня глутатионилирования основного белка эритроцитов ‒ гемоглобина (рис. 5). Это может иметь важное физиологическое значение, поскольку ранее показано, что глутатионилирование гемоглобина приводит к увеличению его сродства к кислороду [44, 45]. Тетрамер гемоглобина, в состав которого входит 2α- и 2β-субъединицы, содержит 6 остатков цистеина – по 1 на каждой α-субъединице (Cys104) и по 2 на каждой β-субъединице (Cys93, Cys112) [46]. Каждая из субъединиц имеет гем, обеспечивающий связывание O₂ [47]. В настоящее время доказано глутатионилирование по остаткам Cys93β [48] и Cys112β [45], в то время как данные о глутатионилировании Cys104α противоречивы [49, 50]. Как нами показано ранее, доступность Cys93β для глутатионилирования гораздо выше в деоксиформе гемоглобина, в то время как Cys112β доступен для глутатионилирования как в окси-, так и в деоксиформе, а доступность Cys104α сомнительна [49]. На рис. 6 показаны остатки цистеина на трехмерной модели гемоглобина человека. Следует заметить, что эксперимент проводили в условиях 20%-ного кислорода, при которых весь гемоглобин находится в оксиформе [51]. В этом случае, скорее всего, происходит глутатионилирование остатка Cys112β.

Рис. 6.

Структура гемоглобина человека (PDB Acc. No. 1GZX). Темно-серым цветом показаны β-субъединицы молекулы, светло-серым – α-субъединицы. Синим выделены остатки цистеина C93β и С112β, которые могут подвергаться глутатионилированию, красным ‒ остаток С104α, сведения о глутатионилировании которого противоречивы.

Необходимо отметить, что значительное повышение степени глутатионилирования гемоглобина описано при диабете, хронической почечной недостаточности и железодефицитной анемии [52]. Причиной возрастания уровня глутатионилирования cчитают окислительный стресс, развивающийся при этих патологиях. Так, при окислительном стрессе возрастает степень глутатионилирования не только гемоглобина, но и ключевых мембранных белков, а также белков цитоскелета клетки (спектрина, анкирина), что сказывается на реологических свойствах эритроцитов [19]. Несмотря на то, что окислительный стресс относится к одной из наиболее часто встречающихся причин глутатионилирования белков, которое защищает тиоловые группы белков от необратимого окисления и в ряде случаев изменяет их функционирование [17], мы показали, что метаболический стресс в отсутствие роста АФК также может быть индуктором глутатионилирования.

Наблюдаемое нами повышение уровня внутриклеточного Na⁺ (рис. 3а), наряду с увеличением среднего размера клеток (рис. 2а), свидетельствует о снижении активности Na⁺/K⁺-АТФазы [53] ‒ как следствия падения уровня АТФ (рис. 1). На основании зарегистрированного нами повышения глутатионилированной формы гемоглобина (рис. 5) можно предположить, что в снижение активности Na⁺/K⁺-АТФазы вносит вклад также ее глутатионилирование, которое ингибирует активность фермента [18].

Необходимо также отметить, что гемоглобин может образовывать нековалентный комплекс с глутатионом, высвобождая две из четырех молекул GSH при деоксигенации [49], поэтому снижение уровня глутатиона при метаболическом стрессе влияет на этот процесс и тем самым изменяет адаптационную способность эритроцитов к гипоксии.

Таким образом, метаболический стресс, вызванный недостатком глюкозы, приводит к снижению уровня АТФ и глутатиона, что, несмотря на отсутствие окислительного стресса, индуцирует глутатионилирование гемоглобина. В связи с тем, что глутатионилирование гемоглобина изменяет его сродство к кислороду [44, 45], этот процесс может существенно изменить функциональную активность эритроцитов. На фоне снижения АТФ также нарушается работа ионных транспортеров, что приводит к увеличению внутриклеточной концентрации Na⁺ и объема эритроцитов. На основании полученных данных можно сделать вывод, что метаболический стресс повышает степень глутатионилирования белков эритроцитов, что может оказывать влияние на функционирование не только гемоглобина, но и других компонентов этих клеток, в частности белков ионного транспорта.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект № 19-14-00374).

Все процедуры, выполненные в данной работе, соответствуют этическим стандартам институционального комитета по исследовательской этике и Хельсинкской декларации 1964 года и ее последующим изменениям или сопоставимым нормам этики. От всех пациентов получено информированное согласие на проведение медицинского обследования, в том числе взятие образцов крови.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.