Российские нанотехнологии, 2022, T. 17, № 5, стр. 712-720

ВВЕДЕНИЕ

Долина Дона – винодельческий регион Юга России, локализованный как защищенное наименование места происхождения в Ростовской области [1]. Имеются исторические и археологические свидетельства существования здесь культурного виноградарства и виноделия в V–III вв. до н.э., первые упоминания отрасли виноделия в российских источниках относятся к эпохе Петра I (1709–1711 гг.) [2]. Именно исторические источники задают главную проблематику виноградарства этого региона: происхождение распространенных здесь автохтонных сортов винограда.

Возникшие в результате многовековой народной селекции автохтонные или аборигенные сорта винограда, относясь к определенной территории, являются достоянием той или иной нации и культуры. Имея в основном неизвестное происхождение, или происхождение от дикорастущих форм винограда [3], они появились в результате спонтанной народной гибридизации в дофиллоксерную эпоху, т.е. до второй половины XIX века, когда появились и направленная селекция, и межвидовая гибридизация рода Vitis [4].

В научной литературе XIX и XX веков был описан 141 сорт V. vinifera, локализованный на Дону, Кубани, в Крыму и на Северном Кавказе [5–9]. К сортам Долины Дона можно отнести 42 из указанных сортов. Согласно основным историческим источникам они происходят от сортов, интродуцированных из Венгрии и Германии Петром I, а также от принесенных из похода 1814 г. в Европу донскими казаками чубуков винограда [10], о чем могут напрямую свидетельствовать названия ряда сортов (Бургундский, Шампанчик, Венгерский). Есть также теория о принесении сортов с территории современного Дагестана во время миграции в Долину Дона хазар в IX в. до н.э. [11]. Оспорить или подтвердить данные теории могли только глубокие исследования генофонда сортов Долины Дона.

В настоящее время бо́льшая часть автохтонных сортов сохранилась только в государственных и частных коллекциях, в промышленных посадках они занимают лишь 2% от массива российских виноградников (площади которых составляют 96 800 га на 2021 г. по данным Министерства сельского хозяйства РФ) [12]. В то же время просыпающийся интерес производителей и потребителей российских вин к автохтонным сортам, как и угроза исчезновения большинства из них, потребовал генетической паспортизации и создания биобанка сортов.

Этот процесс впервые в истории отечественной науки был начат в КГЦ – НИЦ “Курчатовский институт” в конце 2020 г. На первом этапе исследований было принципиально важно выяснить, имеем ли дело с уникальным генофондом или речь идет об интродуцированных до XX века сортах Западной Европы, как это было указано в подавляющем большинстве научных источников прошлых лет. Также следовало разобраться с вероятными повторами сортов, отделить сорта от клонов и выявить вероятные межвидовые гибриды, выдаваемые за сорта V. vinifera.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В течение 2021 г. провели шесть экспедиций для поиска посадок автохтонных сортов винограда и забора биоматериала: две экспедиции в Краснодарский край (Анапа, Краснодар), три в Ростовскую область (Новочеркасск, Цимлянск, районы Нижнего Дона) и одну в Крым (Ялта, Севастополь). Автохтонные сорта Долины Дона обнаружили в коллекциях ВНИИВиВ им. Потапенко (г. Новочеркасск), Анапской зональной опытной станции (г. Анапа), в частной коллекции В.И. Косова, агронома отдела карантина растений и семеноводства ФГБУ “Ростовский референтный центр Россельхознадзора”, в частных подворьях и крестьянско-фермерских хозяйствах станиц Мелеховской, Мишкинской, п. Саркел и г. Цимлянска Ростовской области.

Помощь в розыске и ампелографической экспертизе сортов оказали кандидаты сельскохозяйственных наук Н.А. Молчанов и С.И. Красохина, виноделы и эксперты Н.П. Лукьянов, П.Г. Сериков, В.А. Нефедов, Е. Софийский, Я.В. Кауров, В.И. Косов, другие виноградари и виноделы из Ростовской области. Кроме того, были получены образцы дикорастущего винограда из одичалых посадок 1950-х годов в Цимлянском, Константиновском и Аксайском районах Ростовской области.

Отобранные для исследования в ходе экспедиций образцы представлены в табл. 1, условные сокращения приведены в табл. 2. Отобрали 68 образцов автохтонных сортов Долины Дона и соседних регионов, включая их клоны и выявленные повторы, а также 15 образцов автохтонных сортов России и других стран, продемонстрировавшие родство с некоторыми сортами Долины Дона. Таким образом, полная выборка составила 83 генотипа сортов и сортоформ винограда.

Экстракцию ДНК из листьев винограда проводили согласно ранее описанному протоколу [13]. Чистоту получаемой ДНК оценивали с помощью измерения оптической плотности на спектрофотометре Nanodrop 1000 (Thermo Fisher Scientific, США). Концентрацию определяли с помощью флуориметра Qubit 2.0 (Thermo Fisher Scientific, США).

Библиотеки для полногеномного секвенирования были получены при помощи набора NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA). Оценку распределения длин итоговых библиотек провели на Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Полногеномное секвенирование провели на приборе Illumina Novaseq 6000 (Illumina, San Diego, CA, USA) с использованием проточной ячейки S2 (Illumina, San Diego, USA) и стандартного набора реагентов. Длина прочтений составила 2 × 150 нуклеотидов.

Процесс создания ампликонных библиотек включал в себя следующие основные этапы:

– таргетное обогащение локусов с однонуклеотидными полиморфизмами геномной ДНК (10 нг) методом ПЦР с использованием урацилсодержащих праймеров (524 пары);

– удаление праймеров с восстановлением концов;

– лигирование адаптерных последовательностей;

– амплификация и индексирование библиотек.

Панель состоит из одного пула праймеров, дающих ампликоны размером 125–175 пар нуклеотидов (п.н.), которые покрывают 524 локуса генома V. vinifera [14]. Суммарная длина покрываемого праймерами региона составляет 57 973 п.н. Секвенирование ампликонных библиотек было выполнено на приборе Illumina MiSeq с применением набора реактивов MiSeq Reagent Kit V2 согласно протоколу производителя.

Популяционный и генеалогический анализы. Качество полученных прочтений оценивали при помощи программы fastp. Предварительная обработка прочтений, картирование прочтений на референсный геном и обработка файлов картирования описаны ранее [14]. Уменьшенный набор однонуклеотидных полиморфизмов (SNP), подходящих для использования в популяционных и генеалогических исследованиях, был получен из ранее опубликованного набора, включающего в себя 10 000 SNP V. vinifera [15], шаги и параметры фильтрации подробно описаны в [14]. Оценку сходства сортов, поиск родственных связей, анализ предковых популяций, кластеризацию и визуализацию генетических данных проводили согласно методикам, описанным в [15]. В исследовании дополнительно использовали оценку генетических расстояний по алгоритму NeiDA. Данные, полученные при полногеномном и амликонном секвенировании, были объединены с референсной базой 793 сортов, находящихся в пяти национальных коллекциях Франции, Германии и Испании, а также Грузии [15]. Референсная база, как и данные настоящего исследования, депонирована в прототип Национальной базы генетической информации, находящийся в НИЦ “Курчатовский институт”, и может быть представлена по запросу.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Популяционный и генеалогический анализ сортов винограда по данным полногеномного секвенирования

Идентичные сорта и неверно “маркированные”. Достоверно установлено, что сорт Пухляковский белый является синонимом сорта Коарнэ Альба, происходящего с территории Румынии и Молдавии.

Образцы одичалого винограда из пос. Саркел (Саркел 1 и Саркел 2) с предполагаемым отнесением к сорту Цимлянский черный по анализу происхождения и сходству генотипов с другими сортами были определены как сорт Плечистик. К сорту Цимлянский черный относятся образцы дикоросов Мишкинская 2 (земли КФХ Нефедов, Аксайский р-н. ст. Мишкинская) и образец Саркел 3, обнаруженный в одичалых посадках (Школьная балка, п. Саркел, Цимлянский р-н).

Образец сорта Плечистик, полученный в КФХ Сериков, г. Цимлянск, предположительно является потомком сорта Плечистик на основании данных о происхождении и генетической схожести с образцами, подвергнутыми ампликонному секвенированию.

Родственные сорта и происхождение. Установлено, что сорт Цимлянский черный был получен в результате скрещивания сортов Кокур белый и Плечистик. Найдены парные связи предок–потомок у образцов: Кокур белый и Кара Оглан Фо (Kara oglan faux, “Ложный Кара Оглан”) из французской коллекции Монпелье [15], Плечистик (Саркел 1) и Старенький, Цимлянский черный и Кумшацкий белый.

Популяционный и генеалогический анализ по данным ампликонного секвенирования. Идентичными генотипами обладают образцы Ладанный 2 и Мушкетный (В.И. Косов, Усть-Донецкий р-н, ст. Мелиховская). Сорт Молдавский Черный является синонимом сорта Даркайя Нуар (Коарнэ Нягра), близким родственником сорта Коарнэ Альба (Пухляковский). Сорт Дурман (Мускат Константинопольский) соответствует по генотипу образцу сорта Мускате из Румынии – Muscate (Collection Ravaz).

Генотип образца сорта Асыл Кара (Терский черный) – автохтона долины Терека, отобранный на Анапской зональной опытной станции виноградарства и виноделия, не совпадает с данными по сорту Асыл Кара, представленными в [15], что может говорить о некорректном использовании этих двух сортов как синонимов либо об ошибке в коллекциях.

С высокой достоверностью установлено и подтверждено происхождение 16 сортов винограда (табл. 4).

Таблица 4.

Происхождение селекционных и автохтонных российских сортов, восстановленное по данным ампликонного секвенирования

Сорт	Сорта-предки
Венгерский синий	Мадлен Анжевин и Мускат Гамбургский
Бурый 2, Крестовский	Асыл Кара (Терский черный, Кизлярский черный, Прасковейский черный) и Коз Изюм (Аг-Хазры, Ореховый)
Старенький	Плечистик и Буланый
Махроватчик	Плечистик и Кокур белый
Пухляковский черный, Белобуланый, Кабашный, Шампанчик Бессергеневский, Ольховский, Сиволистый, Сибирьковый	Пухляковский белый и Буланый
Бургундский, Цимладар, Кумшацкий черный, Безымянный донской	Бурый 2 и Цимлянский черный

Для следующих сортов с высокой вероятностью установлены родственные пары потомок–предок: Сыпун черный и Плечистик, Хоца цибил и Бурый 2, Старый Горюн и Плечистик.

Для ряда сортов направление родства предок–потомок оценить без дополнительных данных не представляется возможным: Донской алый и Димиат, Косоротовский и Пухляковский белый, Алый Терский и Асыл Кара, Початочный и Кокур белый, Достойный и Красностоп Золотовский, Грдзелмтевана и Асыл Кара, Костюковский и Ангур калан (Нимранг), Жирный слитной и Асыл Кара. Установленное филогенетическое древо сортов винограда Долины Дона и соседних регионов представлено на рис. 1.

Рис. 1.

Установленное происхождение донских сортов винограда на основании полногеномного и ампликонного секвенирования.

Родственными являются следующие сорта, однако характер связи установить не удалось: Ефремовский и Плечистик, Слитной и Хоца цибил, Первенец Прасковейский и Халили белый (также известен как Ак Халили, Ильинский, Новраст белый, Царский, Яй изюм), Ефремовский и Бурый 1, Ладанный 2 и Бурый 2, Нарма и Гюляби Дагестанский.

Визуализация двумерной свертки данных о парном сходстве генотипов исследованных сортов винограда (рис. 2) подтвердила различия генетического материала сортов винограда в географических группах и выявила следующие крупные кластеры:

Рис. 2.

Визуализация двумерной свертки данных о парном сходстве проанализированных генотипов методом стохастического вложения соседей с t-распределением (tsne).

– Средний и Дальний Восток (MFEAS), Восточное Средиземноморье и Кавказ (EMCA), Россия и Украина (RUUK);

– Балканы (BALK);

– Западная и центральная Европа (WCEU), Апеннинский полуостров (ITAP);

– Магриб (MAGH), Пиренейский полуостров (IBER);

– Новый свет (NEWO);

– Смешанный кластер гибридных сортов, включающий в себя главным образом выведенные на Балканах и Апеннинском полуострове сорта.

Полученные описанным методом данные позволяют использовать ампликонное секвенирование как альтернативу полногеномному секвенированию, генотипированию коротких повторяющихся последовательностей (SSR) и секвенированию посредством ДНК-микрочипов для установления и проверки происхождения сортов винограда.

Проведенный популяционный анализ свидетельствует о том, что изучаемые российские автохтонные сорта винограда из Долины Дона формируют отдельный кластер среди остальных сортов V. vinifera.

Таким образом, наибольший вклад в происхождение исследованных автохтонных сортов винограда внесли:

– донские сорта Красностоп Золотовский, Цимлянский белый и Буланый, ни у одного из которых не обнаружены в настоящий момент предки, происходящие из других регионов и стран;

– решающую роль в происхождении и, вероятно, направленной селекции ряда сортов сыграл румынско-молдавский сорт Пухляковский белый (Коарнэ Альба). Это может быть, в частности, связано с существованием с начала XIX века в хуторе Пухляковском (Собакинском) с 1814 г. “Образцового винного подвала” – опытного и учебного заведения Войска Донского [16]. Как и его потомок Сибирьковый, на сегодня Пухляковский белый – весьма распространенный у виноградарей Дона сорт;

– особый вклад в генофонд донских сортов внесли также происходящий от сортов Северного Кавказа сорт Бурый и крымский автохтонный сорт Кокур белый.

Для дополнения генезиса автохтонных сортов России требуется более детальное изучение как дикорастущих форм винограда, так и других автохтонных сортов. В него должны быть включены геномы сортов из соседних стран (Грузия, Армения, Абхазия), а также дикорастущего винограда на месте досоветских и позднесоветских насаждений, которые могут представлять собой утраченные автохтонные сорта и предков современных сортов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Ограниченный набор SNP оказался надежным инструментом для определения происхождения сортов винограда и отношений между родителями и потомством. Впервые в отечественной науке решены вопросы происхождения и родства автохтонных сортов Долины Дона. Найдено и независимо подтверждено их место на мировом филогенетическом древе V. vinifera, отработаны алгоритмы, позволяющие с высокой долей вероятности идентифицировать неизвестный биоматериал винограда. Проведенные работы формируют базу для развития отечественного питомниководства, новых подходов к селекции. Образуются уникальный биобанк и генетическая база отечественных автохтонных сортов винограда, многие из которых сохранились в государственных и частных коллекциях в количестве нескольких кустов.

За исключением близкородственных сортов Коарнэ Нягра (на Дону получил название Молдавский) и Коарнэ Альба (переименованный в Пухляковский белый и ставший предком ряда других сортов), не было установлено ни одного зарубежного влияния на генофонд изученных автохтонных сортов винограда. Это касается и происхождения таких сортов, как Бургундский, Шампанчик Бессергеневский, Шампанчик Цимлянский, во французском происхождении которых, казалось бы, можно было не сомневаться.

В то же время присутствие среди автохтонных сортов Дона потомков сортов Кокур белый (Крым), Коз Изюм и Асыл Кара (Северный Кавказ) свидетельствует как об историческом взаимодействии народов России в области виноградарства и селекции, так и о том, что большинство изученных сортов Дона, Северного Кавказа и Крыма образуют свой уникальный кластер на мировой филогенетической дендрограмме Vitis vinifera с собственными родительско-потомственными трио и дуэтами.

Работа выполнена при поддержке НИЦ “Курчатовский институт” (Приказ № 2756 от 28.10.2021 г.).