Российские нанотехнологии, 2023, T. 18, № 1, стр. 135-144

ВВЕДЕНИЕ

Быстрое распространение штаммов со множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) патогенных и условно-патогенных микроорганизмов признано ВОЗ одной из самых серьезных угроз для глобального общественного здравоохранения. Появление штаммов МЛУ-бактерий в последние десятилетия в основном связано с широким и неконтролируемым применением антибиотиков и отсутствием производства новых антибактериальных препаратов. В связи с этим потребность в эффективных антимикробных стратегиях, альтернативных традиционной антибактериальной терапии, которые могли бы помочь в лечении резистентных к лекарственным препаратам бактериальных инфекций, стала еще более актуальной. Одно из наиболее перспективных инновационных направлений антимикробной стратегии связано с нанотехнологиями. Эти современные технологии направлены на конструирование и синтез наноматериалов и систем, функционирование которых опосредовано структурой наночастиц (НЧ) размером от 1 до 100 нм. Отмечено, что применение НЧ с выраженным антибактериальным эффектом характеризуется появлением новых возможностей в борьбе с инфекционными агентами и биологическими загрязнителями [1].

В современной нанотехнологии выделяется направление – создание и использование нанокомпозитов на основе металлических частиц и полимеров в качестве противомикробных препаратов [1]. Они должны объединять в себе такие свойства, как высокая антибактериальная активность, экологичность, низкая токсичность, безопасность, простота изготовления и использования. Особое внимание в последнее время уделяется материалам на основе наночастиц серебра (НЧ Ag), обладающих антимикробным действием [2, 3]. Выявленные многовекторные антимикробные эффекты дают основания для широких перспектив использования НЧ Ag в клинической практике, а не только как альтернатива обработке инфицированных ран. Антимикробные механизмы этих НЧ связаны со взаимодействием с липидами, полисахаридами или мембранными белками бактериальной клетки, в то же время окислительный стресс является ключевым фактором в изменении проницаемости и повреждении бактериальной стенки. НЧ Ag могут действовать и на биопленки, эффективность в отношении которых, однако, зависит от многих факторов, включая зрелость и химический состав биопленок.

К настоящему моменту описано большое количество методов синтеза (традиционных и нетрадиционных) НЧ Ag [2], но в связи с мировой тенденцией экологизации производства актуальна разработка методов “зеленого” синтеза НЧ, когда для стабилизации синтезируемых НЧ Ag используются малотоксичные полисахариды природного происхождения (в частности, пектины и хитозан).

Хитозан является биосовместимым для живых организмов, обладает широким спектром физиологической активности, в том числе антимикробной [4–6]. Кроме собственного антибактериального действия хитозан способен повышать чувствительность к антибиотикам некоторых устойчивых к ним микроорганизмов [7]. Данное свойство позволяет рассматривать его как перспективное биологически активное соединение для решения проблемы развития микроорганизмов с МЛУ и их биопленок на колонизируемых поверхностях, приводящих в условиях оказания амбулаторной и стационарной медицинской помощи к росту числа случаев нозокомиальных инфекций.

Все эти достоинства хитозана обусловливают его широкое применение для синтеза НЧ Ag, при этом в данной реакции он выступает одновременно в качестве восстановителя и стабилизатора формирующихся НЧ. Однако, несмотря на большое количество публикаций, касающихся получения НЧ Ag, стабилизированных оболочкой хитозана, они в основном посвящены методологическим аспектам синтеза и исследованию физико-химических характеристик и антимикробной активности получаемых материалов [8–12]. В единичных работах поднимаются вопросы токсичности НЧ Ag с оболочкой хитозана, при этом эксперименты проводятся на клеточных линиях [13]. Так, в [14] с помощью изучения лизосомальной активности смеси олигосахаридов хитозана в клетках фибробластов V79 методом нейтрального красного анализа (NRU assay) установлено отсутствие выраженного цитотоксического действия. В дальнейших исследованиях было продемонстрировано, что токсичность хитозана увеличивалась при введении в молекулу хитозана гидрофобных заместителей, увеличении молекулярной массы и степени ацетилирования молекулы [15]. А способность хитозана к биодеградации тканевыми и клеточными ферментами была эффективнее у низкомолекулярных производных с высокой степенью ацетилирования [16].

В целом низкая степень токсичности хитозана позволяет использовать его в разных областях, в том числе в медицинской практике (для создания гемостатических препаратов, носителей для доставки лекарств, применяемых при терапии различных заболеваний и др.), где предъявляются высокие требования к безопасности и оценке биологического действия фармакологических препаратов и медицинских изделий.

Цель данной работы заключалась в токсикологической оценке в исследованиях in vivo коллоидных растворов НЧ Ag, стабилизированных оболочкой хитозана с учетом потенциальной возможности их практического применения в медицине.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Синтез нанокомпозитов хитозан–Ag. Нанокомпозиты хитозан–Ag получали методом “зеленой химии” путем химического восстановления нитрата серебра хитозаном в гидротермальных условиях [17]. Для этого готовили 100 мл раствора хитозана (30 кДа) с концентрацией 34 мг/мл в 2%-ной уксусной кислоте. Далее к раствору при перемешивании добавляли 10 мл водного раствора нитрата серебра (3.4 или 34 мг/мл) и через 15 мин реакционную смесь помещали в автоклав. Гидротермальный синтез проводили в стерилизаторе паровом ГК-100-3 в течение 1 ч при 1.5 атм и 121°С (“ТЗМОИ”, Россия). Синтезированные нанокомпозиты хитозан–Ag очищали путем диализа против дистиллированной воды (6 ч). Таким образом синтезированы коллоидные растворы нанокомпозитов хитозан–Ag c различным содержанием серебра: нанокомпозит 1 – 0.19 мг/мл; нанокомпозит 2 – 1.9 мг/мл. Концентрация хитозана в обоих растворах была одинаковой и составляла 19.4 мг/мл.

Характеризация нанокомпозитов хитозан–Ag. Спектры оптического поглощения гидрозолей нанокомпозитов хитозан–Ag регистрировали с помощью спектрофлуориметра CM2203 (Солар, Беларусь) в диапазоне длин волн λ = 300–600 нм. Величину ζ-потенциала нанокомпозитов хитозан–Ag определяли путем измерения электрофоретической подвижности частиц, а их средний гидродинамический диаметр – методом динамического рассеяния света (ДРС) на анализаторе Zetasizer Nano ZS (Malvern, Великобритания). Морфологию изучали методом просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) на электронном микроскопе JEOL-LEM-1400 (Jeol Ltd., Япония). Для этого НЧ адсорбировали на подслое коллодия, нанесенного на медную сетку, и сушили на воздухе при комнатной температуре.

Антимикробная активность нанокомпозитов хитозан–Ag. В качестве тест-культур были выбраны штаммы Staphylococcus aureus (КМИЭВ В161), Salmonella dublin (КМИЭВ В152) и Escherichia coli (КМИЭВ В88), выращенные на мясопептонном агаре без антибиотиков.

Определение антибактериальной активности синтезированных нанокомпозитов проводили с использованием метода “колодцев” (метод диффузии в агар). В толще питательной агаровой среды Гивенталя–Ведьминой (АГВ), содержащей суточную культуру микроорганизмов в дозе 200 млн. клеток/мл, стерильно делали лунки диаметром 6 мм. В лунки вносили исследуемые нанокомпозиты и помещали в термостат при 37°С на 18–20 ч. Результаты оценивали по зоне задержки роста тест-культур вокруг лунки. В контрольные чашки Петри с АГВ засевали по 1 мл суспензий, содержавших по 200 млн. клеток 18-часовой культуры. Через 24 ч инкубирования при 37°С проводили учет роста. Далее проводили визуальную оценку наличия роста тест-штамма в опытных пробах в сопоставлении с ростом тест-штамма в положительном контроле (питательная среда с тест-штаммом без препарата) и измеряли диаметр зоны ингибирования.

Изучение острой токсичности. Острая токсичность нанокомпозита хитозан–Ag была изучена в эксперименте на животных (нелинейные самки и самцы белых крыс) при внутрижелудочном и внутрибрюшинном способах введения. Дозу нанокомпозита рассчитывали на единицу массы тела животного (мг/кг). Наблюдение за подопытными животными осуществляли в течение 14 сут после введения препарата: в первые 30 мин после введения, через 4 ч, затем ежедневно. Животных взвешивали до начала эксперимента и контролировали массу тела не реже раза в неделю. В ходе исследования острой токсичности регистрировали общее состояние животных, особенности их поведения, потребление корма и воды, характер симптомов интоксикации, наличие гибели животных и макроскопические изменения со стороны внутренних органов. В соответствии с требованиями ГОСТ 32644-2014 [18], а также принимая во внимание данные о низкой степени острой пероральной токсичности для животных хитозана [19], в целях гуманного обращения с животными эксперимент был проведен на трех животных (самки с исходной массой 160–180 г) с максимальной тестируемой дозой нанокомпозита – 5000 мг/кг (введение с помощью иглы-зонда). Класс опасности исследуемого нанокомпозита определяли на основании полученных результатов по Согласованной на глобальном уровне системе классификации опасности и маркировки химической продукции СГС (GHS) [20] и ГОСТ 12.1.007-76 [21].

Острая внутрибрюшинная токсичность изучена на белых крысах, которым вводили однократно внутрибрюшинно нанокомпозит с помощью стерильных одноразовых шприцев. Экспериментальные группы животных были сформированы рандомно в количестве 10 особей, состояли из животных обоего пола с исходной массой 180–220 г. Для тестирования выбрана максимальная доза – 1500 мг/кг. Животным контрольных групп в аналогичных условиях эксперимента вводили 0.9%-ный изотонический раствор натрия хлорида в эквивалентных количествах. Оценку результатов и классификацию нанокомпозитов проводили по ТКП 125-2008 (02040) [22].

Местно-раздражающее, ирритативное и кожно-резорбтивное действие. Целью изучения местно-раздражающего и кожно-резорбтивного действия являлись установление особенностей эпикутанного воздействия нанокомпозитов и оценка степени проявления кожно-раздражающих свойств при нанесении на кожу и слизистые оболочки глаз (ирритативное действие) лабораторных животных, а также кожно-резорбтивных свойств при однократных и повторных аппликациях нанокомпозитов на кожу лабораторным животным. На выстриженные участки кожи спины белых крыс (размером 3 × 2 см) наносили нанокомпозиты в дозе 0.5 мл с помощью окклюзионной марлевой повязки, время экспозиции – 4 ч. Предварительные испытания проводили с одним животным (белые крысы), подтверждающий тест на двух дополнительных особях крыс. Контролем служили симметрично расположенные на другой стороне спины животного “кожные окошки”, на которые наносили дистиллированную воду в эквивалентных дозах. Оценку функционального состояния кожи на опытном и контрольном участках кожи каждого животного проводили через 1, 24, 48 и 72 ч после аппликации и удаления нанокомпозитов с поверхности кожи по степени выраженности отека (нарастанию кожной складки, измеряемой микрометром типа МК-25) и эритемы (визуально). Интерпретацию и оценку результатов выполняли с учетом рекомендаций ГОСТ 32436-2013 [23].

Кожно-резорбтивное действие нанокомпозитов изучали на белых крысах “пробирочным методом”. Нанокомпозиты наносили эпикутанно на хвосты белых крыс в течение 20 сут (5 раз в неделю), ежедневная экспозиция – 4 ч. Контрольным животным наносили в эквивалентных объемах воду. О наличии резорбтивного действия судили по клинике отравления и гибели животных [24].

Местное раздражающее действие на слизистую глаз (ирритативное действие) изучали путем инстилляции 50–100 мкл нанокомпозитов хитозан–Ag в нижний конъюнктивальный свод правого глаза кролика-альбиноса (по три особи на каждый тестируемый нанокомпозит). Левый глаз служил контрольным, в него в той же дозе вносили дистиллированную воду. Визуальное наблюдение за состоянием слизистой оболочки и коньюктивы глаз проводили на протяжении суток с регистрацией признаков раздражения через 1 и 4 ч и далее ежесуточно в течение двух недель после воздействия. Оценку выраженности ирритативного действия проводили в баллах, классифицировали по Инструкции 1.1.11-12-35-2004 [24] и ГОСТ 32419-2013 [25] с учетом рекомендаций по клиническому наблюдению и классификации признаков раздражения глаз, изложенных в ГОСТ 34658-2020 [26].

Аллергенная активность. Изучение потенциальной аллергенной (сенсибилизирующей) способности нанокомпозитов, стабилизированных хитозаном, проводили экспрессным методом согласно Инструкции 1.1.11-12-35-2004 путем однократной внутрикожной сенсибилизации в тесте опухания лапы (ТОЛ) с дополнительной постановкой реакции специфического лизиса лейкоцитов (РСЛЛ) [24] и определением показателей общего анализа крови на автоматическом анализаторе крови Mythic 18 (Швейцария). В качестве разрешающей дозы использовали 0.35%-ный водный раствор нанокомпозитов, который не вызывал раздражения кожи.

Статистическая обработка результатов экспериментов по изучению токсичности нанокомпозитов. Количественные данные экспериментов представлены в виде медианы (Ме) и межквартильного интервала (Q1–Q3). Сравнение между группами выполнено непараметрическим методом с помощью U-критерия Манна–Уитни для независимых групп. Различия считали статистически значимыми при уровне p < 0.05.

Условия содержания животных при выполнении экспериментов соответствовали требованиям санитарных правил и норм 2.1.2.12-18-2006 “Устройство, оборудование и содержание экспериментально-биологических клиник (вивариев)”, утвержденных постановлением Главного государственного санитарного врача Республики Беларусь от 31 октября 2006 г. № 131. Перед проведением опытов лабораторные животные проходили карантин и акклиматизацию в условиях вивария в течение 14 дней. Проведение экспериментов и выведение лабораторных животных из опыта соответствовали принципам Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (Хельсинки, 1986 г.).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Физико-химические характеристики и антибактериальные свойства нанокомпозитов хитозан–Ag. После гидротермальной обработки реакционных смесей, содержащих хитозан и нитрат серебра, наблюдалось изменение их окраски с бесцветной до темно-коричневой, что свидетельствовало об образовании НЧ Ag. На спектрах поглощения синтезированных гидрозолей нанокомпозитов хитозан–Ag также имеется пик с максимумом поглощения при 415 нм, который соответствует пику поверхностного плазмонного резонанса НЧ Ag и подтверждает их формирование (рис. 1).

Рис. 1.

Спектры поглощения гидрозолей нанокомпозитов 1 и 2.

Как известно, величина ζ-потенциала является одним из важным параметров, характеризующих стабильность коллоидной системы. ζ-потенциал отражает разность потенциалов дисперсной среды и неподвижного слоя жидкости, окружающего частицу. Коллоидные растворы НЧ со значением ζ-потенциала (по модулю) свыше 18 мВ (по данным [27]) являются электрически стабилизированными. Согласно [27] размер НЧ и величина ζ-потенциала для антибактериальных композиций, содержащих НЧ металлов, связаны с проявлением бактерицидного эффекта. При сравнении размера НЧ, их ζ-потенциала и биоцидной активности был сделан вывод, что размер НЧ дисперсных систем в большинстве случаев находится в обратной корреляции с биоцидным эффектом в отношении тестируемых микроорганизмов, а величина ζ-потенциала напрямую обусловливает величину дезинфицирующего эффекта в антимикробных композициях [27].

В настоящей работе установлено, что синтезированные образцы заряжены положительно и величина их ζ-потенциала составляет 37.3 ± 0.2 и 43.2 ± 2.5 мВ в случае нанокомпозита 1 и 2 соответственно. Следовательно, синтезированные нанокомпозиты хитозан–Ag являются агрегационно-стабильными и их свойства при хранении будут оставаться неизменными, что является важным критерием возможности их практического применения. Средний гидродинамический диаметр составляет 340 и 250 нм для нанокомпозита 1 и 2 соответственно. Отметим, что согласно данным ДРС нанокомпозит 1 имеет мономодальное распределение частиц по размеру (рис. 2а), в то время как для нанокомпозита 2 характерно бимодальное распределение частиц (рис. 2б). В нанокомпозите 2 вклад в светорассеивание вносят две фракции: НЧ диаметром менее 40 нм и субмикронная фракция со средним диаметром ⁓100–300 нм (рис. 2). Оцененные значения индекса полидисперсности составляют 0.20 ± 0.04 и 0.40 ± 0.01 для нанокомпозита 1 и 2 соответственно.

Рис. 2.

Распределение частиц нанокомпозитов 1 (а) и 2 (б) по гидродинамическому диаметру.

Детальную информацию о форме и размерах НЧ позволяет получить ПЭМ. Так, согласно ПЭМ-анализу нанокомпозит 1 представляет собой монодисперсные НЧ диаметром 5–10 нм, собранные в сферические агрегаты, размер которых достигает ~150 нм (рис. 3а). С другой стороны, нанокомпозит 2 кардинально отличается от нанокомпозита 1 и представляет собой отдельные частицы со структурой “ядро (наночастица Ag⁰)–оболочка (хитозан)” (рис. 3б). Диаметр неорганического ядра в нанокомпозите 2 составляет 10–40 нм, а толщина хитозановой оболочки, которой оно покрыто, – 20–25 нм (рис. 3б). Данные ПЭМ согласуются с результатами ДРС и данными спектроскопического анализа: максимумы ППР для обоих образцов различаются незначительно, что указывает на сопоставимые размеры неорганического ядра Ag⁰. Бимодальное распределение частиц по размерам для нанокомпозита 2, оцененное методом ДРС, может быть связано с формированием ассоциатов из отдельных НЧ со структурой “ядро–оболочка”.

Рис. 3.

ПЭМ-изображения нанокомпозитов 1 (а) и 2 (б).

Результаты определения антибактериальной активности синтезированных нанокомпозитов в отношении выбранных тест-штаммов бактерий представлены в табл. 1. Установлено, что нанокомпозиты 1 и 2 проявляют активность в отношении как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий: зоны ингибирования составляют 11–16 мм (табл. 1). При этом в отношении Staphylococcus aureus и Escherichia coli нанокомпозит 2 более активен по сравнению с нанокомпозитом 1. Согласно [28–30] антибактериальное действие НЧ Ag обусловлено несколькими процессами: прикреплением НЧ Ag к поверхности клеточной стенки и мембраны, проникновением НЧ внутрь клетки, генерацией активных форм кислорода и свободных радикалов, высвобождением катионов Ag⁺ из НЧ. Взаимодействие НЧ Ag с клеточной мембраной нарушает ее проницаемость и целостность, тем самым провоцируя гибель клетки. При этом более активны мелкие частицы, имеющие большую площадь поверхности, доступную для взаимодействия с клеточной мембраной, и высокую способность проникать внутрь бактерий. Так как стадия взаимодействия НЧ Ag с мембраной является важным этапом в реализации их антибактериальной активности, наличие на поверхности НЧ положительно заряженной стабилизирующей оболочки (например, хитозана) будет способствовать усилению их взаимодействия с отрицательно заряженной мембраной бактериальных клеток, тем самым усиливая их антимикробное действие. Таким образом, наблюдаемая выраженная антибактериальная активность синтезированных нанокомпозитов хитозан–Ag подтверждает эту гипотезу. Отметим, что в ряде исследований также показано, что наличие на поверхности НЧ Ag полимерной оболочки способно снижать их токсичность [13, 30, 31]. Положительное влияние модифицирующих НЧ оболочек природного происхождения может быть связано с повышением биосовместимости НЧ [32, 33]. В связи с этим провели экспериментальное изучение на лабораторных животных токсичности нанокомпозитов хитозан–Ag, проявляющих антибактериальные свойства, с учетом потенциальной возможности дальнейшего практического применения синтезированных нанокомпозитов.

Экспериментальные результаты токсикологических исследований нанокомпозитов. Введение в желудок крыс нанокомпозитов пектин–Ag в максимальной дозе 5000 мг/кг не приводило к гибели подопытных животных. Тестируемые наноматериалы не оказывали отрицательного влияния на их общее состояние. Поведение, подвижность, пищевая и питьевая активность среди животных подопытных и контрольной групп на протяжении эксперимента не различались. В течение двух недель после введения наблюдали положительный прирост массы тела. По окончанию эксперимента органы умерщвленных животных при макроскопическом осмотре не имели патологических особенностей и не отличались от таковых у животных контрольной группы. Полученные результаты изучения острой внутрижелудочной токсичности позволяют сделать вывод о низкой степени опасности изученных нанокомпозитов хитозан–Ag, не требующих классификации и маркировки согласно требованиям СГС (GHS), как опасная химическая продукция по степени воздействия на организм человека при пероральном способе поступления [20]. По классификации ГОСТ 12.1.007-76 нанокомпозиты могут быть отнесены к веществам малоопасным (IV класс опасности) [21].

Тестирование нанокомпозитов при однократном внутрибрюшинном введении в дозе 1500 мг/кг не приводило к гибели и признакам интоксикации животных, что позволяет отнести изученные соединения по степени токсичности к относительно безвредным по ТКП 125-2008 (02040) [22].

По результатам изучения местно-раздражающего действия нанокомпозитов на кожу при однократных четырехчасовых аппликациях не выявлено видимых (клинических) признаков интоксикации животных и функциональных признаков раздражения кожи на протяжении всего периода наблюдений. Нанокомпозиты могут быть отнесены к химической продукции, не вызывающей повреждение/раздражение кожи и не подлежащей классификации в соответствии с критериями СГС (GHS) по данному виду опасности [20].

При однократном и 20-кратном погружении хвостов белых крыс в пробирки с нанокомпозитами, а также по окончанию эксперимента гибели и внешних (клинических) признаков интоксикации не установлено, что позволяет сделать вывод об отсутствии кожно-резорбтивного действия у изученных нанокомпозитов.

Инстилляция 50–100 мкл нанокомпозита 1 (содержание НЧ Ag – 0.19 мг/л) не приводила к функциональным изменениям со стороны глаз животных (гиперемия, слезотечение, хемоз и другие офтальмологические проявления), что свидетельствует об отсутствии способности нанокомпозита 1 оказывать ирритативное действие. В свою очередь, инстилляция 50–100 мкл нанокомпозита 2 в нижний конъюнктивальный свод глаза кроликов приводила к рефлекторному блефароспазму и слезотечению, умеренному отеку века, умеренной (диффузной) гиперемии коньюктивы глаза. Все перечисленные изменения были обратимы и восстанавливались в течение четырех суток наблюдения. Общая оценка выраженности ирритативного действия нанокомпозита 2 составила 4.5 балла, что соответствует 2 классу (умеренная степень раздражения) согласно Инструкции 1.1.11-12-35-2004 [24]. По критериям СГС (GHS) нанокомпозит 2 был отнесен к химическим веществам, обладающим потенциальной способностью вызывать обратимое раздражение глаз (класс опасности 2, подкласс 2А) [20].

Выявление сенсибилизирующего действия нанокомпозитов хитозан–Ag проводили лабораторными методами определения клеточно-опосредованного механизма формирования аллергии: провокационным ТОЛ и постановкой РСЛЛ [24]. Результаты ТОЛ и РСЛЛ, зафиксированные у лабораторных животных, отражены в табл. 2.

Эпикутанное тестирование животных продемонстрировало высокую аллергическую активность нанокомпозита с хитозаном в группе 2, в которой у животных наблюдалась наиболее высокая частота положительной кожной реакции на введение разрешающей дозы нанокомпозита, проявившейся увеличением в 1.4 раза относительных (p < 0.05) и в 3.0 раза абсолютных величин ТОЛ (p < 0.05). Выраженность кожной реакции у 87.5% животных опытной группы 2 составляла 1–4 балла, также отмечается возрастание показателя “процент лейколизиса” в 1.75 раза (p < 0.05) по сравнению с контролем.

У животных группы 1 показатели ТОЛ хоть и были выше, чем у контрольных животных, однако не являлись статистически значимыми. Значение показателя “процент лейколизиса” у животных опытной группы 1 практически не отличалось от уровня контрольных животных и не превышало 10%.

При изучении картины периферической крови у сенсибилизированных животных обращает на себя внимание увеличение в опытной группе 2 в 2.8 раза относительного содержания моноцитов (p < 0.05) на фоне общего гранулоцитоза, что также можно интерпретировать как неспецифический признак сенсибилизации, развития и формирования аллергической реакции (табл. 3).

Таким образом, результаты ТОЛ свидетельствуют о том, что нанокомпозит, модифицированный хитозаном, с концентрацией НЧ Ag 1.9 мг/мл способен вызывать в организме лабораторных животных формирование аллергической реакции по механизму гиперчувствительности замедленного типа (IV тип аллергических реакций), а величина показателей ТОЛ и их статистическая значимость позволяют классифицировать данный нанокомпозит как вещество с выраженной сенсибилизирующей способностью (2 класс аллергенной активности) [24].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные методом “зеленой химии” нанокомпозиты, содержащие наночастицы Ag, модифицированные хитозаном, обладают высокой устойчивостью к агрегации (величина их ζ-потенциала – 37.3 ± 0.2 и 43.2 ± 2.5 мВ) и выраженными антимикробными свойствами в отношении Staphylococcus aureus, Salmonella dublin и Escherichia coli. Нанокомпозиты характеризются разной концентрацией НЧ Ag (1 – 0.19 мг/мл и 2 – 1.9 мг/мл) и имеют различное строение: нанокомпозит 1 представляет собой монодисперсные наночастицы, собранные в сферические агрегаты; нанокомпозит 2 – отдельные частицы со структурой “ядро (наночастица Ag⁰)–оболочка (хитозан)”.

Полученные результаты экспериментальных исследований острой токсичности, местно-раздражающих свойств и аллергенной (сенсибилизирующей) активности нанокомпозитов серебра с хитозаном и концентрацией НЧ Ag в коллоидных растворах, отличающейся на порядок, позволили установить следующие токсикологические параметры и оценить степень опасности нанокомпозитов:

– при остром внутрижелудочном введении нанокомпозиты являются малоопасными химическими веществами в соответствии с ГОСТ 12.1.007-76 (IV класс опасности) [21] и не подлежат классификации по критериям опасности СГС (GHS) [20];

– при остром внутрибрюшинном введении нанокомпозиты по степени токсичности характеризуются как относительно безвредные вещества (согласно ТКП 125-2008 (02040)) [22];

– могут быть отнесены к химической продукции, не вызывающей повреждение/раздражение кожи и не подлежащей классификации в соответствии с критериями СГС (GHS) [20] по данному виду опасности;

– не обладают кожно-резорбтивным действием.

Нанокомпозит с содержанием НЧ Ag 0.19 мг/л не оказывает ирритативного действия на слизистые оболочки лабораторных животных и обладает слабой аллергенной активностью, что не противоречит требованиям безопасности при оценке биологического действия НЧ и материалов, которые планируется использовать в качестве компонентов медицинских изделий и устройств (в частности, планируется практическое применение синтезированных нанокомпозитов для создания антимикробных покрытий на медицинских устройствах (стентах, стомах, дренажах, противоожоговых и ранозаживляющих повязках/сетках и т.д.).

Нанокомпозит, модифицированный хитозаном, с концентрацией НЧ Ag 1.9 мг/мл по критериям СГС (GHS) может быть отнесен к химическим веществам, обладающим потенциальной способностью вызывать обратимое раздражение глаз (класс опасности 2, подкласс 2А) [20], а также обладает выраженной сенсибилизирующей способностью (2 класс аллергенной активности) по классификации [24], реализующейся в виде формирования аллергической реакции по механизму гиперчувствительности замедленного типа (IV тип аллергических реакций).

Представленные данные о токсических свойствах и выполненная классификационная оценка опасности нанокомпозитов могут быть использованы для составления паспорта безопасности (Material Safety Data Sheet), который необходим в случае перехода от опытных разработок к промышленно-коммерческому производству. Изучение особенностей биологического действия, установление критических органов-мишеней при разных уровнях доз и времени экспозиции нанокомпозитов планируется продолжить в субхронических и хронических экспериментах.

Исследование выполнено в рамках ГПНИ “Конвергенция-2025” (задание 3.03.1 “Формирование тонкопленочных биосовместимых и биомиметических антимикробных композиционных материалов различного функционального назначения в соответствии с принципами “зеленой химии”).