Российские нанотехнологии, 2023, T. 18, № 4, стр. 512-519

ВВЕДЕНИЕ

Одним из перспективных направлений развития современной онкологии является разработка новых подходов к таргетной терапии опухолевых заболеваний, в том числе с применением соединений, включающих в себя действующий компонент (радионуклиды, низкомолекулярные и белковые токсины и др.), поражающий клетку, и направляющий или адресный компонент, обеспечивающий адресную доставку действующего компонента к опухолевой клетке определенного молекулярного профиля. При адресном воздействии на опухолевые ткани основной задачей является повышение концентрации действующих агентов, в частности радиоактивных изотопов, непосредственно в опухоли за счет их целевой селективной доставки, что позволяет существенно снизить терапевтические дозы и уменьшить системную интоксикацию организма.

Сегодня рак молочной железы (РМЖ) является самым частым злокачественным новообразованием среди женщин. Одна из наиболее неблагоприятных форм РМЖ HER2-положительный рак молочной железы встречается примерно в 20–25% случаев и характеризуется агрессивным течением, высоким риском метастазирования и низкими показателями выживаемости [1]. Гиперэкспрессия HER2 встречается также в клетках рака яичника, желудка, поджелудочной железы, глиобластомы. 20 лет назад HER2-положительный РМЖ считался плохо поддающимся лечению. В настоящее время большинство пациенток с подобным диагнозом может быть вылечено, в том числе, благодаря импортным инновационным лекарственным препаратам на основе моноклональных антител (Трастузумаб, Пертузумаб, Кацила производства F. Hoffmann-La Roche, Швейцария) и пока единственному российскому дженерику Гертикад (Биокад).

В этой связи цель данной работы – создание российского таргетного радиофармпрепарата (РФП) для радионуклидной терапии (РНТ) HER2-положительных опухолей.

Традиционно для целевой доставки действующих агентов к опухоли используют моноклональные антитела или их фрагменты, которые имеют целый ряд недостатков принципиального и технологического характера [2]. В настоящей работе в качестве альтернативы антителам для нацеливания создаваемого РФП на опухолевые HER2-положительные клетки-мишени использовали рекомбинантный адресный скаффолдовый полипептид ZHER2, специфичный к эпитопу внеклеточного домена трансмембранного рецептора HER2, не совпадающему с эпитопами связывания Трастузумаба и Пертузумаба [3]. При разработке таргетных препаратов наряду с общей эффективностью препарата, зависящей от механизма действующего агента, необходимо учитывать другие характеристики, предопределяющие эффективность доставки и фармакокинетику носителя [4, 5]. Для обеспечения оптимального размера создаваемой конструкции, а также увеличения времени циркуляции в кровотоке и улучшения фармакокинетических показателей в качестве биодеградируемого носителя РФП в настоящей работе применен человеческий сывороточный альбумин (ЧСА) [6].

В составе РФП в качестве терапевтического агента, воздействующего на опухолевую клетку, использовали короткоживущие радионуклиды – β-эмиттеры ¹⁷⁷Lu и ²¹²Pb. Использование радионуклидов в качестве терапевтических агентов в составе таргетных препаратов для РНТ имеет преимущества перед другими действующими агентами, например токсинами, поскольку для радионуклидов неизвестен феномен множественной лекарственной устойчивости (multidrug resistance), а также благодаря так называемому эффекту “перекрестного огня” (cross-fire effect), т.е. облучению опухолевых клеток радионуклидами, доставленными к их злокачественным соседям [7].

МЕТОДЫ

Получение адресного полипептида ZHER2. Плазмидный вектор pET39-ZHER2-Cys с геном мутантного варианта полипептида ZHER2, содержащего остаток цистеина и олигогистидиновый фрагмент, получен путем мутагенеза с помощью ПЦР на основе информации об аминокислотной последовательности адресного полипептида ZHER2 из учетной записи 3MZW в банке данных PDB (https://www.rcsb.org/structure/3MZW) с учетом частоты употребления кодонов в Еscherichia coli. Рекомбинантный полипептид ZHER2 (молекулярная масса 8.2 кДа, специфическое связывание с HER2 c K_D = 22 pM) наработан в клетках E. coli BL21(DE3) [pET39-ZHER2-Сys] и выделен с помощью аффинной хроматографии.

Биодеградируемый носитель РФП – ZHER2–ЧСА–DOTA. Конъюгат ЧСА–DOTA получен путем конъюгации ЧСА с NHS-эфиром DOTA (1,4,7,10-тетраазациклододекан тетрауксусная кислота), служащим в качестве хелатирующего агента и способным образовывать прочные координационные связи с катионами металлов. Полученный конъюгат ЧСА–DOTA активировали гетеробифункциональным линкером sulfo-SIAB и конъюгировали с HER2-специфичным полипептидом ZHER2. В результате в качестве адресного носителя РФП получен биоконъюгат ZHER2–ЧСА–DOTA. Соотношение компонентов в полученных конъюгатах варьируется в зависимости от условий конъюгации. Состав конъюгата, использованного в работе: ZHER2–ЧСА–DOTA (одна–две молекулы ZHER2 на одну условную молекулу конъюгата; 4.1 молекулы DOTA на одну условную молекулу конъюгата; суммарная молекулярная масса ~90 кДа).

Получение радионуклидов. Схема распада радионуклидов ²¹²Pb и ¹⁷⁷Lu, использованных для получения РФП, показана на рис. 1. Радионуклид ¹⁷⁷Lu получали “непрямым” методом – облучением оксида Yb₂O₃, обогащенного (99.8%) по изотопу ¹⁷⁶Yb [8]. Оксид иттербия был герметично упакован в кварцевую ампулу, помещаемую в ампульное устройство, которое затем заваривали для облучения на исследовательском реакторе ИР-8 (НИЦ “Курчатовский институт”, г. Москва). После облучения ампулу вскрывали и переводили оксид иттербия в раствор, из которого отбирали пробу для измерения накопленной активности. Измерения активности проводили на γ-спектрометре Canberra GL0515R, обработку спектров выполняли в программе GRANIT с библиотекой констант, сформированной на основе базы рекомендованных данных NUDAT-2 (МАГАТЭ). Выделение ¹⁷⁷Lu проводили методом цементации [9]. После выделения ¹⁷⁷Lu получали в конечной форме ¹⁷⁷LuCl₃ в растворе 0.1 М HCl. Объемная активность ¹⁷⁷Lu непосредственно перед проведением работ составляла 90 МБк/мл.

Рис. 1.

Цепочки распада ²¹²Pb и ¹⁷⁷Lu.

Радионуклид ²¹²Pb в виде ²¹²PbCl₂ получали с помощью разработанного генератора ²²⁸Th/²¹²Pb. Для получения радионуклида ²¹²Pb был разработан генератор ²²⁸Th/²¹²Pb, принципиальная схема которого показана на рис. 2. Реактор генератора, ограниченный пористыми политетрафторэтиленовыми мембранами, содержит смесь изотопов тория, в состав которой входит радионуклид ²²⁸Th (Т_1/2 1.9 г). В цепочке распада ²²⁸Th присутствует газообразный радионуклид ²²⁰Rn (Т_1/2 56 с), который в результате диффузии попадает в полипропиленовый накопитель и в результате ряда распадов переходит в ²¹²Pb (Т_1/2 10.64 ч) и осаждается на его внутренних стенках. В качестве элюента для смыва ²¹²Pb со стенок сосудов накопителя использовали раствор 0.1 М HCl (pH 1.0). Объемная активность наработанного на генераторе ²¹²Pb составляла 400 кБк/мл.

Рис. 2.

Принципиальная схема генератора ²¹²Pb.

Радиоактивное мечение биоконъюгата ZHER2–ЧСА–DOTA. К полученному раствору радионуклида ¹⁷⁷Lu или ²¹²Pb объемом 0.4–0.8 мл добавляли 1 M KH₂PO₄ в 1/10 части от общего объема реакционной смеси, также во избежание денатурации белкового носителя ZHER2–ЧСА–DOTA в процессе мечения доводили рН смеси концентрированным раствором NaOH до значения 5.5–6.5. Затем для связывания ¹⁷⁷Lu или ²¹²Pb в полученный раствор добавляли 100–125 мкл раствора биоконъюгата ZHER2–ЧСА–DOTA в концентрации 1 мг/мл и инкубировали в течение 60 мин при температуре 60°С с кратковременным перемешиванием каждые ~15 мин. После охлаждения сосуда со смесью выделяли целевые конъюгаты [¹⁷⁷Lu/²¹²Pb]ZHER2–ЧСА–DOTA методом эксклюзионной хроматографии.

Радиометрический анализ всех радиоактивных образцов, где не оговорено специально, проводили по площади фото-пиков γ-линий 239 и 208 кэВ от распадов ²¹²Pb и ¹⁷⁷Lu соответственно, измеренных полупроводниковым Ge-детектором, соединенным с многоканальным анализатором (ORTEC GEM-25185).

Выделение целевых конъюгатов [¹⁷⁷Lu/²¹²Pb]ZHER2–ЧСА–DOTA. Радиохимическую чистоту (РХЧ) меченого соединения определяли методом эксклюзионной хроматографии на гель-фильтрационной колонке (ГФК) Illustra NAP-5 Column (GE HealthCare), уравновешенной 0.1 М MES (2-(N-морфолино)этансульфоновая кислота). Радиоактивно меченые конъюгаты элюировали тем же буфером, а не связавшиеся с конъюгатом радионуклиды смывали раствором 0.1 М лимонной кислоты. РХЧ определяли как процентное отношение суммарной активности всех фракций, содержащих радиоконъюгат, к суммарной активности во всех фракциях смывочных растворов.

Исследование устойчивости комплексов. Диссоциативную устойчивость полученных РФП определяли по РХЧ препарата после выдержки при 37°С в растворе 0.9% NaCl или эмбриональной телячьей сыворотке (ЭТС) (HyClone Laboratories) в течение 1, 2 и 3 ч в случае ²¹²Pb и 1, 2 и 3 сут в случае ¹⁷⁷Lu методом эксклюзионной хроматографии на ГФК, как описано выше. Устойчивость рассчитывали как процентное отношение радиоактивности в элюате к суммарной активности нанесенного на ГФК препарата.

Оценка цитотоксической активности РФП. Для оценки цитотоксической активности РФП использовали линии клеток РМЖ человека SK-BR-3 и BT474 с гиперэкспрессией онкомаркера HER2/neu. Линию клеток аденокарциномы молочной железы MCF-7 с низким уровнем экспрессии HER2/neu использовали в качестве “отрицательного” контроля.

Опухолевые клетки культивировали в пластиковых флаконах с поверхностью роста клеток 25 см² (Costar, США) на среде RPMI-1640 (культуры клеток BT-474, SK-BR-3) и Игла (культура клеток MCF-7) с L-глутамином и добавлением 10% ЭТС (ПанЭко, Россия) при 37°С во влажной атмосфере с 5% СО₂ (СО₂-инкубатор Binder, Германия). В работе использовали клеточные линии от трех до семи пассажей. Концентрацию клеток выбирали с таким расчетом, чтобы воздействие приходилось на экспоненциальную (логарифмическую) фазу роста. В лунку, содержащую адгезированные клетки, добавляли по 100 мкл исследуемых субстанций РФП, приготовленных на культуральной среде в двукратных последовательных разведениях. В контрольные лунки вносили по 100 мкл стерилизованных мембранной фильтрацией растворов не связанных с биоконъюгатом радионуклидов ¹⁷⁷Lu (в форме соли цитрата лютеция в 0.1 M лимонной кислоте с pH, доведенным добавлением концентрированной NaOH до значения 6.0) и ²¹²Pb в 0.1 MES-буфере (рН 6.0) в активностях, равных радиоактивной метке. В каждом случае оставляли контрольные лунки без радиоизотопов, в которые вносили соответствующее количество среды или среды, содержащей эквивалентное количество MES-буфера. Далее клетки инкубировали 24 или 72 ч и проводили оценку их выживаемости с помощью МТТ-теста по стандартной методике. Мерой цитотоксичности служила процентная доля погибших клеток. Все тесты проводили в триплетах, величины оптической плотности, полученные в трех независимых лунках, усредняли.

Для всех количественных данных вычисляли групповое среднее арифметическое (M) и стандартную ошибку среднего (m). Статистический анализ выполняли с использованием программы Statistica v. 10.0. Достоверность различий между группами данных оценивали с применением t-критерия Стьюдента. Различия считали достоверными при р < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Получение меченых биоконъюгатов ZHER2–ЧСА–DOTA. Мечение конъюгата ZHER2–ЧСА–DOTA проводили полученными  в настоящей работе ¹⁷⁷Lu и ²¹²Pb. Для проведения очистки полученного меченого конъюгата [¹⁷⁷Lu/²¹²Pb]ZHER2–ЧСА–DOTA от несвязавшегося изотопа с помощью ГФК калибровали путем пропускания через колонку свободных радионуклидов с отбором 0.1 мл элюатов, что позволило построить кривые элюирования свободных радионуклидов ¹⁷⁷Lu/²¹²Pb (рис. 3, кривые 2). Видно, что в случае очистки [²¹²Pb]ZHER2–ЧСА–DOTA белковая фракция полностью отделяется от фракции со свободным ²¹²Pb, которая, в свою очередь, смывается с колонки раствором 0.1 M лимонной кислоты (рис. 3а, кривая 1). В случае с [¹⁷⁷Lu]ZHER2–ЧСА–DOTA часть свободного радионуклида выходит также в нулевой фракции, при этом перекрытие пиков происходит в координате 1.25 мл (рис. 3б, кривая 1). В этой связи отбор меченной ¹⁷⁷Lu белковой фракции проводили начиная с координаты 1.25 мл.

Рис. 3.

Результаты эксклюзионной хроматографии на гель-фильтрационной колонке (ГФК) Illustra NAP-5 Column (GE HealthCare) конъюгатов ZHER2-ЧСА-DOTA, меченных радиоактивными изотопами ²¹²Pb (а) и ¹⁷⁷Lu (б) (кривые 1). Калибровка ГФК свободными изотопами ²¹²Pb (а) и ¹⁷⁷Lu (б) (кривые 2).

Для подтверждения наличия белка в аликвоты добавляли реагент Кумасси, в результате чего образец, содержащий белок, окрашивался. Было обнаружено, что фракции, следующие за нулевой, за исключением фракций смыва раствором лимонной кислоты, содержат в себе белковую компоненту, что подтвердило корректность указанной схемы разделения.

В этих условиях радиохимическая чистота меченного ¹⁷⁷Lu и ²¹²Pb комплекса ZHER2–ЧСА–DOTA составила 57 ± 10 и 72 ± 5% соответственно. Причина такого уровня РХЧ заключается в отношении количества свободных катионов к количеству хелаторов на поверхности молекул ЧСА. Широко известно, что на РХЧ препарата влияет не только концентрация ионов целевого радионуклида, но и концентрация примесных металлов. Меньшего содержания примесных ионов (железа, меди, цинка и др.) можно добиться очищением раствора, в частности, методами ионообменной хроматографии.

После разделения на ГФК наиболее активные фракции объединили для дальнейшего использования в экспериментах по цитотоксичности. Во всех случаях перед добавлением меченого конъюгата к среде рН доводили до биологически совместимых значений (pH 5.5–6.5). Объемная активность радиоактивно меченых биоконъюгатов перед применением на клеточных культурах составила 5 МБк/мл для [¹⁷⁷Lu]ZHER2–ЧСА–DOTA и 80 кБк/мл для [²¹²Pb]ZHER2–ЧСА–DOTA.

Определение устойчивости комплексов. Исследуемый образец [¹⁷⁷Lu]ZHER2–ЧСА–DOTA (1.5 МБк, 1 мл) разделяли на две равные части, затем добавляли к изотоническому раствору и среде ЭТС при температуре 37°С в отношении объемов препарата и сред 1 : 1. Через 24, 48, 72 ч из каждой из образованных смесей отбирали аликвоту с последующим элюированием на ГФК и расчетом устойчивости.

Исследуемый образец [²¹²Pb]ZHER2–ЧСА–DOTA (40 кБк, 0.5 мл) добавляли к среде ЭТС при температуре 37°С в отношении 1 : 1. В препарат, содержащий ²¹²Pb (56 кБк, 1 мл), добавляли 110 мкл раствора 1.5 М NaCl, так что итоговая концентрация NaCl в смеси составляла значение изотонического раствора. Через 1, 2, 3 ч из каждой из образованных смесей отбирали аликвоту с последующим элюированием на ГФК и расчетом устойчивости. В табл. 1, 2 приведены величины устойчивости для конъюгатов, меченных ¹⁷⁷Lu и ²¹²Pb соответственно. Величины даны в процентах как значение ±предельное отклонение. Видно, что на протяжении 72 ч устойчивость [¹⁷⁷Lu]ZHER2–ЧСА–DOTA сохраняется на уровне 73 ± 8%, а соединение [²¹²Pb]ZHER2–ЧСА–DOTA сохраняет устойчивость более 90% на протяжении 3 ч. Отметим, что устойчивость соединения может быть переоценена в случае, если часть катионов покинула комплекс и связалась с лигандами сыворотки, такими как альбумин или трансферрин, которые не подверглись разделению с комплексом. Для верификации результатов по устойчивости следует проводить анализ с помощью методов высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Оценка цитотоксической активности РФП. Результаты исследований [¹⁷⁷Lu]ZHER2–ЧСА–DOTA представлены на рис. 4. При 24-часовой инкубации опухолевых клеток линий BT-474 и SK-BR-3 в присутствии РФП [¹⁷⁷Lu]ZHER2–ЧСА–DOTA при максимальной объемной активности 5 МБк/мл цитотоксическая активность РФП была низкой: ингибирование пролиферации не превысило 35–38% (рис. 4а). Сопоставимую активность относительно клеток в культуре проявлял и не связанный с биоконъюгатом ¹⁷⁷Lu в виде соли.

Рис. 4.

Цитотоксическая активность адресного радиоактивного конъюгата [¹⁷⁷Lu]ZHER2–ЧСА–DOTA в отношении опухолевых клеток РМЖ человека с высоким (BT-474, SK-BR-3) и низким (MCF-7) уровнем экспрессии онкомаркера HER2/neu при воздействии в течение 24 (а) и 72 ч (б). Различия статистически достоверны (р < 0.05).

При увеличении времени инкубации до 72 ч цитотоксическая активность [¹⁷⁷Lu]ZHER2–ЧСА–DOTA значительно возрастала относительно клеток, которые гиперэкспрессировали онкомаркер HER2/neu, что выражалось в ингибировании роста клеток в культуре на 58–63% при объемной активности РФП 5 МБк/мл (рис. 4б), и не изменялась в отношении клеток MCF-7 с низким уровнем экспрессии HER2/neu. При этом цитотоксическая активность ¹⁷⁷Lu в виде соли не зависела от времени инкубации с клетками (рис. 5). Таким образом, показано, что [¹⁷⁷Lu]ZHER2–ЧСА–DOTA обладает специфической цитотоксической активностью только относительно опухолевых клеток молочной железы человека линий BT-474 и SK-BR-3, гиперэкспрессирующих онкомаркер HER2/neu.

Рис. 5.

Цитотоксическая активность ¹⁷⁷Lu в виде соли относительно опухолевых клеток РМЖ человека с высоким (BTр474, SK-BR-3) и низким (MCF-7) уровнем экспрессии онкомаркера HER2/neu при воздействии в течение 24 (а) и 72 ч (б). Различия статистически достоверны (р < 0.05).

Результаты исследований [²¹²Pb]ZHER2–ЧСА–DOTA представлены на рис. 6. При инкубации клеток линии SK-BR-3 в течение 24 ч при объемных активностях ²¹²Pb в диапазоне 5–80 кБк/мл было зафиксировано снижение числа живых клеток относительно контрольной группы (MES-буфер) (рис. 6а). Ингибирование пролиферации для опухолевых клеток культуры SK-BR-3 при объемной активности радионуклида в РФП 80 кБк/мл составило 40%, в то время как для контрольной линии MCF-7 при той же активности данная величина оказалась ниже примерно в 2 раза. С увеличением времени инкубации до 72 ч на клетках, гиперэкспрессирующих онкомаркер HER2/neu (SK-BR-3), отмечено значительное увеличение цитотоксического эффекта: максимальное ингибирование пролиферации опухолевых клеток в культуре составило 63% при объемной активности 80 кБк/мл (рис. 6б). Отметим, что количество жизнеспособных клеток увеличивалось со снижением концентрации экспериментального образца препарата, т.е. выявлен дозозависимый цитотоксический эффект исследуемого РФП. Ингибирование пролиферации при использовании ²¹²Pb в виде соли не превысило 48% (рис. 7). Таким образом, показано, что [²¹²Pb]ZHER2–ЧСА–DOTA обладает специфической цитотоксической активностью только в отношении линии SK-BR-3, гиперэкспрессирующей онкомаркер HER2/neu. Выявлено, что MES-буфер, тестируемый в качестве контроля, не оказывал цитотоксического действия на клетки в системе in vitro в выбранных концентрациях и временных диапазонах.

Рис. 6.

Цитотоксическая активность адресного радиоактивного конъюгата [²¹²Pb]ZHER2–ЧСА–DOTA относительно опухолевых клеток РМЖ человека с высоким (SK-BR-3) и низким (MCF-7) уровнем экспрессии онкомаркера HER2/neu при воздействии в течение 24 (а) и 72 ч (б). Различия статистически достоверны (р < 0.05).

Рис. 7.

Цитотоксическая активность ²¹²Pb относительно опухолевых клеток РМЖ человека с высоким (SK-BR-3) и низким (MCF-7) уровнем экспрессии онкомаркера HER2/neu при воздействии в течение 24 (а) и 72 ч (б). Различия статистически достоверны (р < 0.05).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Разработан лабораторный генератор радионуклида ²¹²Pb и получены два терапевтических РФП на основе короткоживущих β-эмиттеров ¹⁷⁷Lu и ²¹²Pb и биосовместимого конъюгата ZHER2–ЧСА–DOTA, который представляет собой комплекс из адресного HER2-специфичного полипептида ZHER2, конъюгированного с ЧСА и хелатором DOTA. При проведении экспериментов в системе in vitro установлено, что РФП [¹⁷⁷Lu]DOTA–ЧСА–ZHER2 (клеточные линии ВТ-474 и SK-BR-3) и [²¹²Pb]DOTA–ЧСА–ZHER2 (клеточная линия SK-BR-3) обладают специфической цитотоксической активностью в отношении клеток РМЖ человека, гиперэкспрессирующих онкомаркер HER2/neu, которая выражалась в способности ингибировать рост HER2/neu позитивных опухолевых клеток в культуре.

Полученные результаты свидетельствуют о необходимости доклинического изучения разработанных РФП в системе in vivo на животных с привитыми опухолями, гиперэкспрессирующими HER2/neu.