Российские нанотехнологии, 2024, T. 19, № 1, стр. 20-29

ВВЕДЕНИЕ

Астаксантин (АСТ) – природный кетокаротиноид оранжево-красного цвета, который встречается у многих рыб, ракообразных, некоторых птиц и микроорганизмов [1–4]. Молекулярная структура АСТ, содержащая 11 сопряженных π-связей, позволяет эффективно тушить активные формы кислорода и удалять радикалы [5–7]. АСТ может существовать в незамещенной форме, а также в виде эфиров (эфАСТ) [8]. По многим показателям АСТ считается сильнейшим антиоксидантом среди всех каротиноидов [9–11], причем эфАСТ в опытах in vitro показывают лучший эффект, чем незамещенная форма [12, 13]. За последние десятилетия АСТ набрал популярность благодаря широкому спектру своей биологической активности [14–18].

АСТ может блокировать окисление липопротеина низкой плотности [19], улучшать липидный обмен, оптимизируя уровень липидов и адипоктина, а также снижать уровень воспаления [20, 21]. АСТ благоприятно действует при воспалительных заболеваниях, вызванных окислительным стрессом [22–24], может восстанавливать уровни активности антиоксидантных ферментов (супероксиддисмутазы, глутатионпероксидазы) и глутатиона и положительно влиять на профилактику лечения возрастных и нейродегенеративных заболеваний [25–28], в том числе на болезнь Альцгеймера [3, 15, 29]. АСТ легко преодолевает гематоэнцефалический барьер [30], что может использоваться для создания средств терапии нейродегенеративных заболеваний.

Однако из-за малой растворимости в воде и низкой биодоступности использование АСТ и его эфиров сильно ограничено. В связи с этим существует большое количество публикаций, посвященных разработке дисперсных форм АСТ и его эфиров: липосом [31–36], наноэмульсий [37–39]. Основной целью являлось изучение антиоксидантной или биологической активности таких систем, в то время как стабильность и концентрация включенного АСТ не имели решающего значения. Поэтому практически нет публикаций, посвященных оптимизации липидного состава для получения стабильных дисперсных форм АСТ и его эфиров.

Известно, что липосомы интенсивно поглощаются макрофагами печени (клетками Купфера), что сокращает время их пребывания в кровотоке. Для защиты от поглощения макрофагами липосомы модифицируют введением пегилированных липидов. Модификация липосом полиэтиленгликолем позволяет им дольше циркулировать в кровотоке [40], что успешно применяется в клинических испытаниях, например доксорубицина [41] или паклитаксела [42].

Модификация плюрониками приводит к уменьшению скорости высвобождения нагруженного в липосомы активного вещества [43, 44]. Кроме того, плюроники способны стабилизировать H-агрегаты АСТ [45], которые могут обладать повышенной антиоксидантной активностью [46].

Цель настоящего исследования – получение стабильных липосом с высокой концентрацией эфиров АСТ (0.5 мг/мл) и изучение их антиоксидантных свойств. Для реализации поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: подобрать оптимальный состав липосом, содержащих модификаторы полоксамер P188 (Pluronic F68) или пегелированные липиды; оценить стабильность полученных липосом с учетом показателей: гидродинамического диаметра, ζ‑потенциала, а также стабильность встроенных эфиров АСТ при хранении; изучить взаимодействия катион-радикала ${\text{ABT}}{{{\text{S}}}^{{ \bullet + }}}$ с липосомами, а также оценить жизнеспособности мононуклеарных клеток крови человека, инкубированных с полученными липосомами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Растворители. Хлороформ ХЧ, дихлорметан ХЧ, изопропанол ХЧ, (Химмед, Россия). В работе использовали деионизованную воду milli-Q 18.2 MΩ cm, которую получали на системе Merсk (Millipore) Milli-Q Integral 10 (Merck, Германия).

Реактивы. Астаксантин ≥97% (высокоэффективная жидкостная хроматография) из Blakeslea trispora, эфиры астаксантина из Haematococcus pluvialis, Kolliphor P188 (Lutrol F68) (Sigma Aldrich, США), пегилированный дистеарилфосфатидил-этаноламин (DSPE-PEG 2000) и Lipoid S75 (Lipoid, Германия), трипановый синий (Диаэм, Россия).

Методика получения липосом, модифицированных плюроником. Навеску фосфолипида Lipoid S75 растворяли в хлороформе, а затем по каплям впрыскивали в горячий водный раствор плюроника (0.5–2%) (65–70°С) при интенсивном перемешивании. После испарения хлороформа смесь обрабатывали в ультразвуковой (УЗ) ванне в течение 15 мин с периодическим встряхиванием. Образец дважды с перерывом в 1 мин подвергали воздействию УЗ-дезинтегратора Vibra Cell 75043 (Sonics & Materials, США) в режиме импульса 01 : 01 со временем активной работы 1 мин 30 с и амплитудой 40%, энергия – 0.050 Дж.

Для получения липосом с эфирами АСТ использовали упомянутую выше методику без использования УЗ-дезинтегратора на последнем этапе.

Конечная концентрация Lipoid S75 в водном растворе составляет 2 мг/мл, плюроника – от 0.1 до 5%, эфАСТ – от 0.1 до 0.5 мг/мл.

Методика получения липосом, модифицированных пегилированными липидами. Навески фосфолипида Lipoid S75 и пегилированного липида DSPE-PEG 2000 растворяли в хлороформе, а затем выпаривали с использованием центрифужного вакуумного концентратора Eppendorf Concentrator 5301 (Германия) до образования липидной пленки. Соотношение S75 : DSPE-PEG 2000 (М/М) подбирали в широком диапазоне от 100% S75 до 100% DSPE-PEG 2000. К липидной пленке добавляли 2 мл горячей воды (65–70°С), а затем смесь обрабатывали в УЗ-ванне в течение 15 мин с периодическим встряхиванием. Образец дважды с перерывом в 1 мин подвергали воздействию УЗ-дезинтегратора в режиме импульса 01 : 01 со временем активной работы 1 мин 30 с и амплитудой 40%, энергия – 0.05 Дж.

Для получения липосом с эфирами АСТ использовали упомянутую выше методику без использования УЗ-дезинтегратора на последнем этапе. Конечная концентрация S75 во всех образцах составила 2 мг/мл, DSPE-PEG 2000 – от 0.63 до 3.77 мг/мл, эфАСТ – от 0.1 до 1 мг/мл. Концентрация DSPE-PEG 2000 в таблицах указана в мольном соотношении к Lipoid S75, для пересчета в мг/мл можно использовать молярную массу M (DSPE-PEG 2000) = 2700 г/моль.

Определение размеров и ζ-потенциала липосом методом динамического рассеяния света (ДРС). Гидродинамический диаметр (d, нм), ζ-потенциал (мВ) и индекс полидисперсности (PdI) липосом определяли на приборе Zetasizer Nano (Malvern, Англия) методом ДРС при температуре кюветы 25°С. Размер рассчитывали в режиме измерения “по интенсивности”. Использовали следующие условия: показатель преломления был принят равным 1.590, показатель поглощения – 0.01. При определении размеров липосом для каждого образца проводили три повтора по 20 измерений в каждом. ζ-потенциал определяли в рамках трех повторов по 12–20 измерений в каждом (максимальное число повторов могло доходить до 100 в некоторых образцах). Количество точек корреляционной функции – 30–50 точек в каждом накоплении. Скорость счета для разных образцов находилась в диапазоне от 15 000 до 200 000 счетов в секунду ×1000.

Оценка стабильности приготовленных липосом. Для оценки стабильности липосом измеряли размеры липосом, ζ-потенциал и индекс полидисперсности до и после хранения в темноте при 5°С в течение одной недели. Липосомы, показавшие наилучший результат в течение недели, повторно изучали на стабильность при тех же условиях в течение одного месяца с момента приготовления.

Стабильность эфиров АСТ оценивали по изменению оптической плотности (ОП) на полосе поглощения 480 нм в день получения и спустя 7 дней хранения.

Криогенная просвечивающая электронная микроскопия (крио-ПЭМ). Для подготовки образцов использовали медные поддерживающие сетки с отверстиями в аморфной пленке углерода (Lacey C only, 01895-F, Ted Pella, США), гидрофилизованные в тлеющем разряде на установке PELCO easiGlow (Ted Pella, США) при условиях: время обработки образца – 25 с, сила тока – 0.20 мА, остаточное давление в камере – 0.26 мбар. На сетку наносили 3 мкл образца и с помощью автоматизированной системы Vitrobot Mark IV (Thermo Fisher Scientific, США) обрабатывали для удаления излишков раствора в течение 2.5 с путем двустороннего промакивания фильтровальной бумагой при влажности в камере 95–100% и температуре 4°С, затем проводили витрификацию. Образцы исследовали с помощью криогенного просвечивающего электронного микроскопа Titan Krios 60-300 (Thermo Fisher Scientific, США), оборудованного устройством прямого детектирования электронов Falcon II (Thermo Fisher Scientific, США) и корректором сферических аберраций (Cs image corrector, CEOS GmbH, Германия), работающего под управлением программы EPU (Thermo Fisher Scientific, США). Основные параметры получения изображений: ускоряющее напряжение 300 кВ, номинальное увеличение ×18 000, время экспозиции 4 с, дефокусировка от –2 до –5 мкм.

Жизнеспособность мононуклеарных клеток (МНК) крови человека определяли при инкубировании с исследуемыми липосомами:

– S75;

– S75+ F68 0.5%;

– S75 : DSPE-PEG 2000 10 : 4;

– S75 + эфАСТ 0.2 мг/мл;

– S75 + F68 0.5% + эфАСТ 0.2 мг/мл;

– S75 : DSPE-PEG 2000 10 : 4 + эфАСТ 0.2 мг/мл.

МНК выделяли из периферической крови здоровых добровольцев в одноступенчатом градиенте плотности фиколла (плотность 1.077). Клетки культивировали в 24-луночном культуральном планшете в течение 24 ч при 37°С в атмосфере CO₂ (5%) в среде RPMI 1640, содержащей 2.0 мМ глутамина и 100 мкг/мл гентамицина. МНК распределяли по лункам из расчета 4 × 10⁵ клеток/в лунке (8 × 10⁵ кл/мл) и добавляли исследуемые липосомы в количестве 50 мкл (общий объем 0.5 мл).

После инкубации клетки суспендировали и считали жизнеспособоность методом окрашивания трипановым синим. 0.2%-ный раствор трипанового синего в фосфатно-солевом буфере смешивали с суспензией клеток 1 : 1, подсчет окрашенных (мертвых) клеток проводили в камере Горяева. Подсчитывали клетки в трех–пяти полях зрения, в каждом поле зрения находилось до 200 клеток.

Определение антиоксидантной активности липосом при удалении ABTS катион-радикала. Антиоксидантную активность полученных липосом определяли при их инкубации с радикалом 2,2'-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфоновой кислоты (ABTS) по методике, предложенной в [47]. Раствор ${\text{ABT}}{{{\text{S}}}^{{ \bullet + }}}$-радикала готовили при смешивании водных растворов 1.5 мМ ABTS и 2.5 мМ K₂S₂O₈ в соотношении 4.7 : 1 с дальнейшей инкубацией при комнатной температуре в течение 16 ч в темноте. Образовавшийся раствор темно-зеленого цвета разбавляли водой в 5 раз. К 50 мкл приготовленного раствора ABTS-радикала добавляли 50 мкл липосом. Смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 90 мин и регистрировали ОП при 734 нм. Все измерения были выполнены в триплетах. Процент удаления ABTS-радикала вычисляли по формуле

где A_{контроль} – поглощение раствора ABTS при 734 нм, A_{образец} – поглощение раствора ABTS с липосомами, ${{{\text{А}}}_{{{\text{базовая линия}}}}}$ – поглощение базовой линии раствора ABTS с липосомами.

Статистический анализ проводили с помощью программ Excel (Microsoft, 2010) и STATISTICA 10 (Stat Soft, 2010). Для значений ОП ${\text{ABT}}{{{\text{S}}}^{{ \bullet + }}}$ указаны средние значения ± стандартная ошибка среднего. Для липосом указаны средние значения ± стандартное отклонение. Статистические различия для каждой пары сравниваемых величин рассчитывали с применением алгоритма ANOVA, различия считались достоверными при величине достоверности p < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Получение липосом, не содержащих эфиры АСТ. Для получения липосом использовали смесь фосфолипидов сои S75, состоящую из 75% фосфатидилхолина (ФХ) и 8% фосфатидилэтаноламина (ФЭ). Получение пегилированных липосом и липосом, модифицированных плюроником, проводили по методикам, которые различались первой стадией. В случае плюроника использовали медленное введение раствора хлороформа с растворенными в них липидами в водную фазу, содержащую плюроник, с последующим выпариванием растворителя (метод инжекции). В другом случае применяли классический метод выпаривания органического растворителя (хлороформа), содержащего смесь природных фосфолипидов S75 и пегилированного ФЭ, до образования липидной пленки с последующей гидратацией в водной фазе. Контролем служили немодифицированные липосомы, далее обозначаемые как “пустые” липосомы, которые не содержали эфиры АСТ.

Физико-химические показатели (размер липосом, ζ-потенциал и индекс полидисперсности) измеряли в день получения и после хранения при 5°С в темноте.

Приготовленные пустые липосомы (табл. 1) были полностью прозрачными и сохраняли свой внешний вид без изменения более двух месяцев. Образцы с плюроником содержали две фракции липосом: маленького размера (меньшая фракция, 10–70 нм) и большего (большая фракция, 100–300 нм). В табл. 1 приведены средние гидродинамические размеры, рассчитанные прибором по параметру “интенсивность”. Для повышения точности определения все липосомы разбавляли в 4 раза.

Из данных табл. 1 видно, что пустые липосомы с модифицированной поверхностью по размерам не отличаются от контроля как при получении, так и после хранения. Можно лишь отметить, что ζ-потенциал всех липосом находился в отрицательной области, причем использование модификаторов приводило к сильному снижению потенциала в случае присутствия пегилированных липидов, в которых ζ-потенциал равнялся –55 ± ± 20 по сравнению с –25 ± 10 в контроле. Высокие отрицательные значения ζ-потенциалов для липосом являются показателем устойчивого двойного электрического слоя и стабильности системы в целом.

После хранения пустых липосом в течение одного месяца при 5°С в холодильнике мелкие фракции исчезли в системах S75 2 мг/мл и S75 2 мг/мл + DSPE-PEG 2000 (10 : 4 М/М), что связано с Оствальдским созреванием. В то же время липосомы с плюроником сохранили обе фракции: 33 ± 5 и 110 ± 50 нм, что свидетельствует о стабилизации плюроником липосом низких размеров (табл. 1, рис. 1).

Получение липосом с эфирами АСТ. Известно, что АСТ и его эфиры нестабильны на свету и достаточно интенсивно подвергаются деградации и окислению [48]. Кроме того, в предварительных экспериментах было установлено, что обработка на УЗ-дезинтеграторе приводит к разрушению каротиноида. Так, после озвучивания на дезинтеграторе в течение 3 мин концентрация эфАСТ снижается на 30–40% при начальной 0.5 мг/мл и на 20–30% при начальной 0.2 мг/мл. Поэтому предприняли попытку получить липосомы не более 200 нм, содержащие модификаторы и эфиры АСТ, без использования УЗ.

Липосомы с добавлением плюроника F68. Как правило, для приготовления наносистем с плюроником используют концентрации 0.5–1%. В таком случае снижается риск аллергических реакций. Были приготовлены липосомы с различной концентрацией эфАСТ – от 0.1 до 0.5 мг/мл в 0.5- или 1%-ном водном растворе плюроника (табл. 2). Было выявлено, что липосомы, приготовленные с добавлением 0.5% плюроника, имели значительно более низкий PdI, чем с 1% (0.27 против 0.52 для 0.2 мг/мл эфАСТ и 0.36 против 0.47 для 0.3 мг/мл эфАСТ) (табл. 2).

Для оптимизации состава липосом были приготовлены системы с различным содержанием плюроника (от 0.1 до 4%, табл. 3) и высокой концентрацией эфАСТ – 0.5 мг/мл, при которой контрольные липосомы без модификаторов выпадали в осадок в течение недели, а их средний размер составлял 500 ± 200 нм.

В результате при добавлении плюроника в небольших концентрациях (0.1%) образуется прозрачный раствор, стабильный как минимум в течение недели. В диапазоне 0.3–2% плюроника липосомы имеют высокий PdI (от 0.391 до 0.529) и более низкую стабильность, о чем свидетельствует формирование масляного остатка эфАСТ на границе раздела фаз воздух–вода, а также снижение максимума поглощения раствора на 480 нм, характерного для АСТ и его эфиров.

Среди рассмотренных систем только с использованием 0.5%-ного раствора плюроника получались стабильные липосомы, а эфАСТ не отслаивались даже спустя 2 нед хранения при 5°С в холодильнике. В растворах с содержанием 2 и 4% плюроника образовывались крупные липосомы (500 ± 200 и 275 ± 20 нм соответственно), из-за чего эфАСТ в течение недели частично отслаивались на поверхности.

Как видно из табл. 3, в растворах с содержанием плюроника 0.1 и 4% концентрация эфАСТ снижается на 15–20% в течение недели, что свидетельствует о низкой стабильности таких систем. Концентрация эфАСТ в растворе в образце 3 с 0.5% плюроника для сравнения снизилась всего на 2%. По-видимому, в слабоустойчивых растворах каротиноид выходит из состава липосом и сорбируется на поверхности пробирки.

Так как средний диаметр рассчитывали по интенсивности, вклад крупных липосом выше, чем маленьких, поэтому считаем, что основной фракцией во всех системах являются фракции липосом ниже 100 нм, что согласуется с изображениями, полученными с использованием крио-ПЭМ (рис. 2). ζ-потенциал липосом с плюроником находился в диапазоне –35 ± 15 мВ, где –15 мВ показали наименее стабильные системы.

Липосомы с добавлением DSPE-PEG 2000. Для изучения оптимального соотношения ФХ : PEG-липид было приготовлено 10 составов образцов без/с эфАСТ, измерены размеры липосом, ζ-потенциалы таких систем, а также стабильность при хранении в течение недели при 5°С в холодильнике (табл. 4).

Было выявлено, что добавление DSPE-PEG 2000 снижает PdI образованных липосом, причем наиболее низкие значения PdI наблюдаются в системах S75 : DSPE-PEG 2000 в диапазоне от 10 : 4 до 10 : 10 соответственно. При увеличении доли пегилированного липида размеры липосом увеличиваются на 100–200 нм (до 300–400 нм), а PdI достигает 0.51 с эфАСТ. Во всех липосомах с DSPE-PEG 2000 при хранении в течение недели эфАСТ на поверхности воды практически не отслаивается, однако в образцах 2 (10 : 1, табл. 4) и 3 (10 : 2, табл. 4) выпал оранжевый осадок, предположительно липид со встроенными эфАСТ. Важно отметить, что в липосомах с низким содержанием DSPE-PEG 2000 (образцы 10 : 1–10 : 3, табл. 4) и высоким (10 : 10–0 : 10 (табл. 4) значительно снижается ОП спустя одну неделю хранения (например, с 1.60 до 1.48 на 480 нм), в то время как в системах 10 : 4, 10 : 5 и 10 : 7 концентрация не меняется.

эфАСТ отлично встраиваются в липосомы с пегилированным липидом, благодаря чему впервые удалось получить стабильную систему с концентрацией эфАСТ более 0.5 мг/мл. Например, концентрация эфАСТ достигала 1 мг/мл в липосомах состава S75 : DSPE-PEG 2000 10 : 4 (2.5 мг/мл DSPE-PEG 2000). Система оказалась устойчивой в течение недели, концентрация эфАСТ снизилась всего на 3%. В растворе присутствовали три фракции липосом с PdI = 0.59: основные – 530 ± 80 и 105 ± 15 нм, а также незначительное количество с размером более 5 мкм. Фракцию размером более 5 мкм считали несущественной из-за завышенного вклада крупных липосом.

ζ-потенциалы липосом с DSPE-PEG 2000 варьировались в диапазоне –20…–70 мВ. Наиболее стабильные липосомы имели ζ-потенциал в диапазоне –60 ± 10 мВ.

Показано, что при использовании DSPE-PEG 2000 в липосомах с концентрацией эфАСТ 0.5 мг/мл, которая считается очень высокой для данного каротиноида (предельная растворимость для истинного раствора 1 мг/мл в диметилсульфоксиде (ДМСО)), образуются монодисперсные липосомы по сравнению с липосомами с добавлением плюроника (рис. 3). Это утверждение справедливо для составов S75 : DSPE-PEG 2000: от 10 : 3 до 10 : 10 М/М (табл. 4).

Липосомы, содержащие DSPE-PEG 2000, при добавлении 0.5 мг/мл эфАСТ значительно более прозрачны, чем контрольные, не содержащие пегилированных липидов, и липосомы с добавлением плюроника.

Липосомы, нагруженные пегилированными липидами, широко используются для увеличения растворимости гидрофобных биологически активных соединений (стелс-липосомы). В то же время существует единственная публикация о приготовлении таких липосом с АСТ [49], причем в работе используется одна концентрация: ФХ : PEG-липид – 95 : 5 (моль. %).

Так же как у липосом с добавлением плюроника, при изучении липосом S75 : DSPE-PEG 2000 методом крио-ПЭМ было выявлено, что основная фракция имеет диаметр ниже 100 нм (рис. 4).

Выживаемость мононуклеарных клеток крови. Жизнеспособность МНК оценивали через 24 ч после инкубирования с модифицированными липосомами методом окрашивания трипановым синим. При 82 ± 2% выживаемости контрольных образцов без липосом процент выживших клеток, инкубированных с липосомами разного состава, – 84 ± 4%. При этом не было статистических различий липосом в зависимости от модификатора или наличия эфАСТ. Исследуемые липосомы не оказывают цитотоксического действия.

Антиоксидантную активность полученных липосом изучали при инактивации катион-радикала ABTS. Катион-радикал образуется при инкубации ABTS с персульфатом калия K₂S₂O₈ в течение суток и сопровождается изменением окраски раствора с бледно-желтой до темно-изумрудной. При этом катион-радикал имеет несколько максимумов поглощения, самые интенсивные при 405 и 734 нм. Поскольку спектр поглощения АСТ и его эфиров перекрывается с полосой 405 нм для катион-радикала ABTS, тушение определяли на длине волны 734 нм.

Анализ проводили для пустых и нагруженных эфАСТ (0.2 мг/мл) липосом трех составов:

– S75 2 мг/мл;

– S75 2 мг/мл + плюроник 0.5%;

– S75 2 мг/мл + DSPE-PEG 2000 10 : 4 М/М.

Измерение ОП проводили в течение 90 мин инкубации липосом с катион-радикалом ABTS. В течение этого времени максимум поглощения на 734 нм постоянно снижался. На рис. 5 представлены значения после 90 мин инкубации, когда наблюдается достоверное снижение ОП липосом, нагруженных эфАСТ, по сравнению с липосомами, не содержащими эфАСТ. В качестве контроля использовали раствор катион-радикала ABTS без добавления липосом.

Как видно из рис. 5, все липосомы, как пустые, так и нагруженные эфАСТ, удаляют радикал, что может быть связано с наличием в препарате липидов продуктов окисления. Например, молекула липида LH или гидроперекиси LOOH взаимодействует с радикалом, превращая его в молекулу ABTS, что и проявляется в снижении поглощения на 734 нм. Кроме того, сам плюроник снижает ОП, однако его вклад очень низкий – около 6% от контрольного значения. Это объяснят лучший эффект пустых липосом с плюроником.

Важно отметить, что процент удаления радикала ABTS в липосомах, содержащих 0.2 мг/мл эфАСТ, выше, чем без эфАСТ. Это является прямым доказательством антиоксидантных свойств эфАСТ, включенных в липосомальную форму. Так, в нагруженных эфАСТ липосомах без модификаторов антиоксидантный эффект составляет ~17%, с плюроником F68 – 25%, а с DSPE-PEG 2000 – более 45%. По-видимому, такой эффект связан с лучшим распределением эфАСТ в липосомах с модификаторами, особенно с DSPE-PEG 2000, что подтверждается более высокой концентрацией каротиноида в пегелированных липосомах, определяемой по ОП растворов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе была приготовлена стабильная липосомальная форма эфиров астаксантина, позволившая повысить его растворимость в воде и биодоступность. В качестве модификаторов для улучшения стабильности разработанных систем использовали плюроник F68 или DSPE-PEG 2000. Липосомы хорошо диспергировались и имели сферическую форму, что было выявлено методом крио-ПЭМ. Подобраны оптимальные составы: S75 + плюроник 0.5% и S75 : DSPE-PEG 2000 10 : 4 М/М для липосом с плюроником и пегилированным липидом соответственно. Сравнение показателей размера, индекса полидисперсности и концентрации эфАСТ до и после хранения липосом в течение 1 нед позволяет сделать вывод, что липосомы сохраняют свою форму и стабильны как минимум в течение 1 нед хранения. Применение УЗ-дезинтегратора приводит к уменьшению размера липосом до 100 нм, но при этом разрушает АСТ. Поэтому липосомы с эфАСТ были получены без дезинтегрирования УЗ.

Анализ тушения радикала ABTS показал, что липосомы с эфАСТ проявляют высокую антиоксидантную активность, а проверка выживаемости МНК показала 84 ± 4% выживаемости клеток при инкубации их с липосамами в течение 24 ч. Данное исследование показывает, что липосомы с эфАСТ могут стать ценной системой для их использования в адресной доставке, однако для защиты эфАСТ от окислительной деструкции под действием света и улучшения стабильности имеет смысл добавлять в липосомы антиоксиданты.

Работа выполнена в рамках тематического плана НИЦ “Курчатовский институт” 1ф.4.1: “Изучение процессов генерации, передачи и распределения энергии в живых организмах, направленное на поиск новых подходов к созданию терапевтических средств, новых биоэнергетических устройств и систем искусственного фотосинтеза” и договора № 07-1-21 МГУ им. М.В. Ломоносова “Физико-химические свойства биомембран в норме, при патологии и воздействии факторов окружающей среды”.

В работе использовалось оборудование ресурсного центра “Зондовой и электронной микроскопии” НИЦ “Курчатовского института”.

Авторы выражают благодарность представительству Lipoid AG и его главе А.В. Сымону за предоставленные липиды.