Российские нанотехнологии, 2024, T. 19, № 3, стр. 427-432

ВВЕДЕНИЕ

Состав вина зависит от нескольких факторов, определяющих идентичность вина, включая сорт винограда, географическое происхождение, биофизическую среду виноградника, условия сбора урожая и технологии виноделия [1].

Аналитические методы для сортовой идентификации вин основаны главным образом на определении состава и содержания летучих и фенольных соединений с использованием различных хроматографических методов, которые требуют высококвалифицированного персонала, сложных и дорогих аналитических инструментов [2–5].

Классические методы, в частности газовая хроматография и высокоэффективная жидкостная хроматография, постоянно совершенствуются [6]. Однако в последнее время первостепенное значение приобрели такие аспекты анализа вин, как быстрота, удобство для пользователя и экономичность [7]. Одним из возможных решений в этом направлении могут быть спектроскопические методы (спектроскопия ближнего и среднего ИК-диапазона, УФ-спектроскопия, спектроскопия комбинационного рассеяния, методы ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и флуоресцентная спектроскопия), характеризующиеся простотой подготовки образцов и высокой скоростью анализа [8].

Одним из аналитических методов с высоким потенциалом для сортовой идентификации вин является трехмерная флуоресцентная спектроскопия – быстрый, неинвазивный, чувствительный и доступный метод, включающий в себя последовательное получение спектров возбуждения и/или излучения на нескольких длинах волн. Преимущество данного метода в том то, что вся информация может быть получена путем одновременного изменения длин волн возбуждения и излучения. Полный ландшафт флуоресценции можно представить в виде матрицы, состоящей из графиков зависимости возбуждения от длин волн излучения. Эта матрица называется матрицей возбуждения–излучения (EEM) [9].

EEM состоит из сигналов, полученных от флуорофоров (флуоресцентных молекул), присутствующих в вине, различающихся по интенсивности в зависимости от типа и концентрации. Из-за широкого спектра флуоресцентных соединений, присутствующих в вине, специфическая EEM представляет собой перекрывающийся сигнал индивидуального вклада флуорофоров.

Основными флуорофорами в составе вина являются фенольные кислоты, стильбены, антоцианы, флавоноиды и дубильные вещества.

Фенольные соединения представляют собой основную группу веществ, влияющих на органолептические характеристики (цвет, вкус, терпкость и мягкость) и качество вина. Кроме того, данные соединения важны для сохранности пищевых продуктов благодаря их антиоксидантному и бактерицидному действиям [10]. Фенольный состав вина зависит, во-первых, от содержания фенолов в исходном сырье – винограде, на что влияют сорт, год урожая, климатические условия во время созревания и тип почвы, а во-вторых, от методов, применяемых в процессе виноделия, и условий выдерживания/старения [11].

Полифенолы делятся на два семейства: флавоноидные и нефлавоноидные соединения. Наиболее важными нефлавоноидами, содержащимися в вине, являются фенольные кислоты (производные бензойной или коричной кислоты) и соединения, подобные стильбену. Фенольные кислоты представлены в основном катаровой, кутаровой и фертаровой кислотами, которые обычно встречаются в виде сложных эфиров. Гидроксикоричные эфиры являются одной из самых распространенных групп фенольных соединений, содержащихся в винограде [12]. Стильбеноподобные соединения включают в себя ресвератрол, его глюкозид пицеид, астрингин и виниферины. Среди флавоноидов важны три подгруппы: флавонолы, флаван-3-олы и антоцианы. Флавонолы содержатся в кожице винограда в виде гликозидов мирицетина, кверцетина, кемпферола, изорамнетина, сирцитина и ларицитрина. Флаван-3-олы (мономерные катехины и полимерные проантоцианидины) представляют собой еще одно большое семейство полифенольных соединений, состоящее в основном из катехина, эпикатехина, галлокатехина, эпигаллокатехина и соответствующих им полимеров, содержащихся в кожице и косточках винограда [13].

Анализ литературных данных показал, что в последнее время при исследовании вин широко используется флуоресцентная спектрометрия, например для количественного определения полифенолов в красном вине [14], изменения содержания антоциановых пигментов в процессе выдержки вина [15], при мониторинге потемнения игристых вин [16], для определения географического происхождения [17] и производителей вин [18, 19].

При сортовой идентификации вин исследования были сосредоточены главным образом на сортах красных вин [20]. Для дифференциации красных вин полученные результаты подвергали многомерному анализу, включая анализ основных компонентов, анализ независимых компонентов, параллельный факторный анализ, факторный дискриминантный анализ и частичный дискриминантный анализ наименьших квадратов [21]. В случае белых вин для создания простой и эффективной модели идентификации сортов Шардоне, Совиньон Блан и Торронтес использовали алгоритм последовательной проекции с последующим линейным дискриминантным анализом [22].

Таким образом, трехмерная флуоресцентная спектроскопия является одним из аналитических методов с высоким потенциалом для сортовой идентификации вин; типы и количество флуоресцентных молекул варьируются в зависимости от сорта и зрелости винограда; обработка и выдержка вина также влияют на состав данных соединений. Полный ландшафт флуоресценции включает в себя информацию о нескольких флуорофорах в его составе и может рассматриваться как характерный “отпечаток пальца”, который позволит идентифицировать сортовую принадлежность вина.

Цель исследования – оценка возможностей идентификации вин в зависимости от сорта винограда с применением флуоресцентной спектроскопии.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Объекты исследования. В данной работе проанализировали по шесть образцов коммерчески доступных белых (Ркацители, Алиготе) и красных вин (Саперави, Мерло). Описание вин приведено в табл. 1.

После вскрытия бутылок образцы исследуемых вин отбирали в стеклянные флаконы объемом 4 мл с тефлоновыми крышками и хранили в холодильнике при температуре +4°С. Непосредственно перед анализом аликвоты анализируемых образцов центрифугировали (4000 об./мин, 15 мин).

Измерения флуоресценции. Измерения проводили на многофункциональном устройстве для считывания микропланшетов Thermo Scientific™ Varioskan™ LUX с ксеноновой лампой (программное обеспечение Thermo Scientific™ SkanIt™). Образцы вина объемом 200 мкл помещали в лунки микропланшета (Thermo Scientific™ Nunc™ F96 MicroWell™ Black Polystyrene Plate (Thermo Scientific 237108)) и регистрировали спектры при температуре 25.5 ± 1.0°С в трех повторах. Щели монохроматоров возбуждения и эмиссии были установлены на 5 нм. Скорость сбора данных – 500 нм/мин. Диапазон длин волн возбуждения (λ_ex) и испускания (λ_em) составлял 250–500 и 275–600 нм соответственно с шагом длины волны 5 нм. Поверхности регистрировались как множественные эмиссионные спектры. Общее время сканирования одного образца составляло ~30 мин.

Для каждого образца спектры объединяли в одну матрицу, в результате чего были получены как 3D-поверхности, так и контурные карты в программе Origin (OriginLab, США), версия 9.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

На рис. 1 представлены типичные поверхности каждого из исследованных вин различных сортов винограда. Поверхности флуоресценции EEM исследуемых образцов обеспечивают общий профиль интенсивности в диапазоне сканируемых длин волн возбуждения и испускания, который можно использовать в качестве спектрального отпечатка каждого вина.

Рис. 1.

3D-поверхности исследуемых вин: белые – Ркацители (а), Алиготе (б); красные – Саперави (в), Мерло (г).

Отметим, что флуорофоры разных сортов вин вызывают сложную картину возбуждения–испускания и каждый из исследованных сортов имеет свою уникальную форму поверхности (характеризуется специфическим профилем), что в свою очередь позволяет выявить характеристические максимумы и провести дифференциацию в отношении сорта винограда.

Согласно спектрам, представленным на рис. 1, между исследованными сортами вин существуют различия в количестве пиков/плеч. Так, белые сорта вин характеризуются четырьмя максимумами и одним плечом, тогда как красные – тремя и одним плечом. Отметим, что помимо дифференциации по количеству пиков и общей форме спектров, которая существует среди исследованных сортов, был отмечен специфический отпечаток каждого сорта по индивидуальной интенсивности характеристических сигналов и их соотношению в зависимости от года сбора урожая.

На рис. 2 поверхности EEM образцов вина представлены в виде контурных карт.

Рис. 2.

Контурные карты исследуемых вин: белые – Ркацители (а), Алиготе (б); красные – Саперави (в), Мерло (г).

Известно, что 3D-спектры флуоресценции стандартных фенольных соединений обладают характерными спектральными областями с максимумами λ_ex в диапазоне 260–360 нм. В [11] были обобщены данные о флуоресцентных свойствах (λ_ex/λ_em) флуорофоров, присутствующих в составе вина. Например, для фенольных кислот и альдегидов в области 260–320/320–440 нм, флавонолов – 260–270/370–420 нм, мономерных и полимерных флаван-3-олов – 280–290/310–360 нм.

Сравнение образцов белых вин Ркацители и Алиготе выявило, с одной стороны, некоторое сходство общих форм – наличие максимумов I–III (табл. 2), с другой стороны, наличие сдвигов основных пиков максимумов, что обусловлено существующими естественными различиями с точки зрения их общего состава.

При рассмотрении красных вин сортов Саперави и Мерло было выявлено четкое различие, а именно, наличие пика при 265/380–390 нм для Мерло, который отсутствовал при анализе всех прочих сортов вин. При этом максимальная интенсивность пика в случае Саперави была при λ_ex/λ_em 280–285/335–355, а в случае Мерло – 280/315.

Более детально [23] в области 260–315/315–345 нм были идентифицированы метилсирингат, катехин, а также галловая, протокатеховая, сиреневая, ванилиновая и гомогентизиновая кислоты. При 300–360/380–450 нм наблюдали присутствие кемпферола, а также гидроксикоричных кислот: кофейной, кафтаровой, хлорогеновой, п-кумаровой, феруловой, синапиновой. Некоторые фенольные соединения, такие как эллаговая и гентизиновая кислоты, флуоресцируют в более широкой области спектра – 280–380/400–480 нм.

Вариации, проявляющиеся в конкретных парах λ_ex/λ_em, могут способствовать сортовой идентификации вин: вариации флуорофоров в вине определяют различия в молекулярных “отпечатках пальцев”, что позволит использовать эти химические маркеры (без обязательной идентификации индивидуальных флуорофоров) для верификации вина.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Аналитические методы для сортовой идентификации вин основаны главным образом на определении состава и содержания летучих и фенольных соединений с использованием различных хроматографических методов, требующих высококвалифицированного персонала, сложных и дорогих аналитических инструментов. В последнее время первостепенное значение приобрели такие аспекты анализа вин, как быстрота, удобство для пользователя и экономичность.

Анализ литературных данных показал, что спектроскопические методы анализа ввиду их простоты, высокой скорости и точности активно используются при определении подлинности вин и их географического происхождения. Одним из таких методов является трехмерная флуоресцентная спектроскопия – быстрый, неинвазивный, чувствительный и доступный метод.

Для оценки возможности классификации вин в зависимости от сорта винограда было проведено исследование четырех сортов вин (Ркацители, Алиготе, Саперави, Мерло) с применением спектроскопии возбуждения – эмиссионной флуоресцентной матрицы.

Простая визуальная характеристика типичной поверхности EEM выявила специфические профили, характерные для каждого сорта. EEM уникальны для каждого отдельного вина и отражают его молекулярный “отпечаток”, а особенности данных EEM могут применяться при идентификации вин по сортам винограда.

Авторы выражают благодарность генеральному директору ООО “Инкерманский завод марочных вин” (г. Севастополь) Ларисе Петровне Шимчук за предоставленные для исследования верифицированные сортовые образцы вин.

Работа проведена в рамках выполнения государственного задания НИЦ “Курчатовский институт”.