Российские нанотехнологии, 2024, T. 19, № 4, стр. 537-541

ВВЕДЕНИЕ

Изучение экспрессии генов – один из основных столпов современной молекулярной биологии. В комбинации с протеомным анализом это позволяет выяснить молекулярно-генетические механизмы, протекающие в клетке как в норме, так и при патологии. “Золотым стандартом” при изучении экспрессии генов является анализ относительных уровней транскриптов с помощью реакции обратной транскрипции и последующей ПЦР в реальном времени. В последние десятилетия был разработан целый свод рекомендаций для планирования таких экспериментов [1]. Особое внимание уделяют так называемым референсным генам [2]. Основное требование, предъявляемое к таким генам, заключается в том, что их экспрессия должна быть постоянна вне зависимости от условий эксперимента или иметь очень низкий уровень вариабельности во всех изучаемых образцах. К сожалению, не найдено универсальных референсных генов, и в каждом случае необходимо подбирать специфичные референсные гены, стабильно экспрессирующиеся в условиях конкретного эксперимента.

В настоящее время ведутся активные исследования молекулярных механизмов возникновения и развития различных патологий сердца, поскольку знание патогенеза заболевания на клеточном и молекулярном уровнях позволяет разрабатывать более эффективную терапию. Особую актуальность представляет изучение заболеваний, приводящих к сердечной недостаточности, например ишемическая болезнь сердца (ИБС) и различные кардиомиопатии, в частности гипертрофическая кардиомиопатия (ГКМП). К сожалению, в силу малой доступности тканей сердца человека при жизни, очень ограничено количество работ, освещающих изменения экспрессии генов в сердце при жизни человека [3–5]. В связи с этим до сих пор существует проблема выбора адекватных референсных генов для подобного рода исследований [4]. Поэтому целью настоящей работы стал поиск наиболее стабильно экспрессирующихся потенциально референсных генов в прижизненных образцах миокарда пациентов с тяжелой сердечной недостаточностью, обусловленной ГКМП или ИБС.

МЕТОДЫ

Пациенты были отобраны в кардиохирургическом отделении лечения дисфункций миокарда и сердечной недостаточности ФГБНУ “РНЦХ им. академика Б.В. Петровского”. Выборка состояла из 15 неродственных друг другу пациентов из России. Пяти пациентам был поставлен диагноз ИБС, у остальных десяти была тяжелая форма ГКМП. Критерии отбора пациентов с ГКМП описаны в [6]. У двоих пациентов с ГКМП выявлен патогенный вариант rs397516037 в гене MYBPC3, приводящий к формированию стоп-кодона в 1233-м положении в белке. Средний возраст пациентов составил 56.5 ± 13.2, соотношение полов было 9 : 6 (М : Ж). Клиническая характеристика исследованной выборки пациентов представлена в табл. 1. Письменное информированное согласие на участие в исследовании было получено от всех пациентов и членов их семей в соответствии с Хельсинкской декларацией. Исследование одобрено этическим комитетом Института молекулярной генетики Национального исследовательского центра “Курчатовский институт”.

Образцы миокарда получены в ходе септальной миэктомии в случае ГКМП и аорто-коронарного шунтирования в случае ИБС. Сразу после иссечения образцы помещали в консервирующий раствор DNA/RNA-Shield (Zymo Research Corp., Irvine, CA, USA), выдерживали сутки при +4°С и замораживали при –20°С для транспортировки. После транспортировки образцы хранили при –80°С.

Выделение тотальной РНК из миокарда проводили с помощью с помощью реагента TRIzol (Invitrogen, USA) и набора Direct-zol™ RNA MiniPrep (Zymo Research Corp., Irvine, CA, USA). Измерение концентрации, оценку качества тотальной РНК, реакцию обратной транскрипции проводили, как описано в [7]. ПЦР проводили с использованием прибора QuantStudio 3 (Thermo Fisher Scientific) и реактивов для ПЦР (“Синтол”, “Евроген”, “ДНК-Синтез”). В состав смеси для ПЦР входили: 0.2 мкл Taq-полимеразы (5 е.а./мкл), 3 мкл буферного раствора (×10), 3 мкл смеси дНТФ (по 2 нмоль/мкл каждого), 1.5 мкл MgCl₂ (25 нмоль/мкл), 1 мкл праймеров (10 пмоль/мкл), 1 мкл зондов (5 пмоль/мкл), 5 мкл кДНК (0.02 нг/мкл), до 30 мкл доводили ультрачистой водой. Условия амплификации следующие:

– 180 с при 95°C;

– 45 циклов по 5 с при 95°C, 20 с при 60°C.

Все реакции повторяли троекратно для каждой кДНК.

Праймеры и зонды были подобраны на основе последовательности генома человека в базе данных NCBI (первичная сборка GRCh38.p13). Последовательности праймеров и зондов описаны в [7]. Оценку экспрессии референсных генов проводили с использованием параметра “пороговый цикл” (Ct) и программного обеспечения MS Excel 2010 (Microsoft), Statistica 12 (StatSoft) и RefFinder tool [8, 9].

РЕЗУЛЬТАТЫ

В настоящей работе проведены поиск и анализ стабильности экспрессии потенциальных референсных генов в образцах миокарда человека, полученных в ходе хирургического лечения дисфункций миокарда и сердечной недостаточности у пациентов с ИБС и ГКМП.

Первым этапом работы по поиску оптимальных референсных генов-кандидатов для исследования их уровней экспрессии стал анализ литературы. Для этого в базе данных National Library of Medicine (NCBI) провели поиск по ключевым словам “Heart”, “Gene Expression Profiling”, “reference genes”, “normalization genes”, “housekeeping genes” с использованием фильтра “вид: человек”. Было сформировано несколько запросов. По запросу (“Heart” [Mesh]) AND “Gene Expression Profiling” [Mesh] AND (“reference genes” [tiab] OR “normalization genes” [tiab] OR normalization[tiab]) было получено 24 результата, по запросу (“Heart” [Mesh]) AND (“reference genes” [tiab] OR “normalization genes” [tiab]) – 19, по запросу “Heart” [Mesh] AND “housekeeping genes” [tiab] – 14. Всего было проанализировано 42 источника литературы. Кроме того, в анализ включили результаты подобного поиска, полученные в [7]. На данном этапе было отобрано 30 генов: ACTB [10], GAPDH [5, 10–13], UBC [10], TPT1 [14], SRP14 [14], GUSB [5], IPO8 [4, 5], POLR2A [4, 5, 7, 15], PPIA [3, 5, 11, 16], RPLP0 [5, 11], YWHAZ [3, 5], RPL13A [3], (GPS1, PSMB2) [15], (RPL32, PGK1) [17], (RPL5, PSMB4, REEP5, RAB7A) [12], (TBP, HMBS, SDHA) [16], (BCAT2, SARS1, HPRT1, AARS1, PSMD6, PSMD7, POLR2F, PSMA5) [7]. При этом учитывали минимальную вовлеченность белков, кодируемых этими генами, в непосредственное функционирование миокарда/саркомера. Особое внимание уделяли генам, принимающим участие в самых общих клеточных процессах.

Для отобранных генов оценивали наличие псевдогенов, поскольку при их существовании в геноме сложно гарантировать достаточную специфичность праймеров и зондов для анализа экспрессии этих генов с помощью ПЦР в реальном времени. Поэтому из дальнейшего анализа были исключены гены ACTB, GUSB, PPIA, YWHAZ, RPL30, GAPDH, RPLP0, TPT1, IPO8, RPL13A, GPS1, RPL32, PGK1, RPL5 и SDHA.

Для оставшихся генов с помощью базы данных https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/ был оценен уровень мРНК этих генов в сердце. Для анализа отбирали те гены, чей уровень экспрессии был сходным. Так, уровни мРНК генов UBC, PSMB4, RAB7A, PGK1, SDHA оказались слишком высоки, а уровни мРНК генов IPO8, PSMB2, TBP, HMBS – слишком низки. При оценке относительной экспрессии генов интереса важно, чтобы уровни экспрессии генов интереса и референсных генов были близки, так как слишком большая разница (более чем в 10 раз) может искажать результаты расчетов относительных уровней экспрессии генов интереса.

В итоге был проведен анализ уровней мРНК генов PSMD6, PSMD7, SARS1, HPRT1, PSMA5, POLR2A, AARS1, BCAT2. На рис. 1 показаны данные усредненных пороговых циклов для индивидуальных образцов по анализируемым генам.

Рис. 1.

Средние индивидуальные значения пороговых циклов ПЦР в реальном времени по каждому образцу для исследуемых генов. Ct – пороговый цикл, Median – медиана, 25–75% – квартили, Min–Max – минимальное и максимальное значения, Raw data – усредненные по трем повторам индивидуальные значения, Outliers – выбросы.

Затем данные усредненных пороговых циклов для индивидуальных образцов были проанализированы с помощью ресурса RefFinder. Результаты представлены в табл. 2. Как видно из таблицы, наиболее стабильно экспрессирующимися генами в данных условиях оказались PSMD6, PSMD7, SARS1 и AARS1. Последовательности ген-специфичных праймеров и зондов для детекции транскриптов методом ПЦР в реальном времени представлены в табл. 3.

ОБСУЖДЕНИЕ

Несмотря на многолетние исследования, проблема выбора адекватных референсных генов для анализа относительной экспрессии генов интереса в самых разных экспериментах остается очень актуальной.

К сожалению, во многих работах по изучению экспрессии различных генов в миокарде до сих пор используют в качестве референсных такие гены, как ACTB, YWHAZ или GAPDH [3, 5, 10, 12, 13], даже несмотря на то, что для них многократно показана нестабильная экспрессия в различных экспериментальных условиях [4, 14, 18–21]. Кроме того, наличие большого количества псевдогенов у этих генов ставит под сомнение качество нормализации таких экспериментов, поскольку ни один из методов выделения РНК не гарантирует полного отсутствия геномной ДНК в образце тотальной РНК. Поэтому из анализа намеренно исключили целый ряд генов, для которых было показано большое количество псевдогенов в геноме.

Еще одним критерием отбора генов для анализа стал уровень мРНК генов в различных тканях. Внимание решили сконцентрировать на генах со средним и сходным в большинстве тканей уровнем экспрессии, поскольку такие гены с большей вероятностью могут оказаться “универсальными” референсными генами. Кроме того, данный подход частично решает проблему тканеспецифичной экспрессии потенциального референсного гена [22].

Также важным критерием отбора потенциальных референсных генов для анализа относительной экспрессии генов интереса является анализ их вовлеченности в специфичные для тканей, отобранных в эксперимент, клеточные процессы. Например, было показано, что ACTB может принимать участие в патогенезе сердечной недостаточности [4], поскольку данный белок участвует в формировании цитоскелета [23]. Аналогично из выполненного анализа был исключен ген REEP5, поскольку белок, кодируемый им, расположен в канальцевой сети эндоплазматического ретикулума и непосредственно участвует в регуляции организации сарко-эндоплазматического ретикулума и клеточных стрессовых реакциях в кардиомиоцитах [24].

С другой стороны, гены белков, катализирующих перенос аминокислот на тРНК, экспрессируются во всех тканях организма, где проходит активный синтез белка. В связи с этим такие гены, как SARS1 и AARS1, могут оказаться наиболее стабильно экспрессирующимися в подавляющем большинстве тканей. То же самое может быть применимо к генам PSMD6, PSMD7, PSMA5, POLR2A, поскольку PSMD6, PSMD7, PSMA5 кодируют субъединицы протеасом, а POLR2A – субъединицу РНК-полимеразы.

Тем не менее не все гены “домашнего хозяйства” могут оказаться достаточно стабильно экспрессирующимися в выбранных экспериментальных условиях. Так, изученные гены HPRT1, POLR2A и BCAT2 в использованных образцах оказались менее стабильными. Это также было продемонстрировано в работах [3–5, 11, 16, 17]. Более того, для BCAT2 показано участие в патологических процессах в миокарде [25].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенный анализ стабильности экспрессии ряда потенциальных референсных генов показал, что наиболее стабильно в миокарде человека при сердечной недостаточности экспрессируются гены PSMD6, PSMD7, SARS1 и AARS1. Более того, продемонстрировано, что при планировании экспериментов по изучению изменений экспрессии генов всегда нужно проводить поиск и тщательно отбирать адекватные референсные гены для нормализации экспрессионных данных.

Работа выполнена при частичной финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 22-15-00243) и частично в рамках выполнения государственного задания НИЦ “Курчатовский институт”.