Нейрохимия, 2019, T. 36, № 1, стр. 78-83

ВВЕДЕНИЕ

В патогенезе цереброваскулярных заболеваний, являющихся одной из основных причин инвалидизации и смертности населения, решающая роль отводится оксидативному стрессу, включая свободнорадикальное и перекисное окисление, приводящее к повреждению клеточных мембран и гибели клеток [1]. Ишемия мозга, независимо от патогенеза, сопровождается каскадом патобиохимических реакций или ишемическим каскадом, который при недостаточной коррекции кровоснабжения мозга приводит к необратимым повреждениям нервной ткани [2]. Согласно литературным данным, ишемический каскад развивается с первых же минут ишемического инсульта и способствует развитию оксидативного стресса, характеризующегося, интенсивным генерированием активных форм кислорода (АФК), активацией свободнорадикальных процессов, повышением синтеза NO [3]. Этим обусловлена довольно высокая эффективность антигипоксантов и антиоксидантов, включая соединения, улучшающие локальную гемодинамику, синтетические переносчики кислорода, ГАМК-ергические соединения, агонисты дофаминовых рецепторов, стимуляторы энергетического обмена, регуляторы кислотно-щелочного баланса и др. в профилактике и лечении ишемических инсультов [4–6].

Ввиду накопления избыточного количества АФК развитие оксидативного стресса сопровождается повреждением липидов, нуклеиновых кислот, белков, углеводов, приводя к гибели нервных клеток. В молекулярных механизмах оксидативного стресса основная роль отводится перекисному окислению липидов (ПОЛ), продукты которого, наряду с другими индукторами окисления (АФК, свободное железо и др.), индуцируют окислительную модификацию белков (ОМБ) и нуклеиновых кислот [4, 6, 7].

Продукт ПОЛ – малоновый диальдегид (МДА), являющийся одним из наиболее ранних маркеров оксидативного стресса [8], повышает уровень других маркеров оксидативного стресса – продуктов ОМБ [7, 9].

ОМБ лежит в основе нарушений, а порой и полной потери специфических функций белка [10], в связи с чем окислительная модификация ферментов и структурных белков может играть важную роль в этиологии ряда патологий [11].

Таким образом, активация свободнорадикального и перекисного окисления липидов и ОМБ при патологических состояниях позволяет рассматривать указанные процессы в качестве фармакологической мишени антигипоксантов и антиоксидантов [12].

Все вышеизложенное явилось основой для исследования влияния синтезированного в Институте тонкой органической химии им. А.Л. Мнджояна НАН РА α₂-адреноблокатора меседина (2-(2-метиламино-4-тиазолил)-1,4-бензодиоксана гидрохлорид) [13], обладающего антигипоксантной активностью, на уровень маркеров гипоксии [11, 14].

Ранее проведенными нами исследованиями установлено, что меседин в условиях экспериментального нарушения кровоснабжения мозга улучшает локальный корковый мозговой кровоток [15], предотвращает развитие морфологических сдвигов, и устраняет нейроповеденческие последствия локальной ишемии [16, 17].

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проводились на белых беспородных крысах-самцах (n = 56) весом 170–220 г. Ишемия мозга моделировалась односторонней перевязкой правой общей сонной артерии (ПОСА) в условиях хлоралгидратной анестезии (400 мг/кг, в/б) [18–20]. Оксидативный стресс у животных оценивался интенсивностью процесса ПОЛ определением уровня МДА в аскорбатзависимой системе и оценкой ОМБ по содержанию карбонильных производных белков.

В основе метода определения интенсивности процесса ПОЛ в аскорбатзависимой системе окисления лежит реакция взаимодействия МДА с тиобарбитуровой кислотой, которая протекает при высокой температуре в кислой среде и приводит к образованию цветного триметинового комплекса [21].

Для количественного определения МДА в мозговой ткани животных отдельно отбиралось каждое полушарие, для гомогенизации добавлялся Трис HCl буфер в пересчете 10 мл на 1 г ткани. 0.1 мл гомогената добавляли в инкубационную смесь, содержащую 0.3 мл 40 мМ Трис HCl буфера (pH 7.4), 0.3 мл соли Мора (Fe(NH₄)₂(SO₄)₂ · 6H₂O 10^–6 M) и 0.3 мл 0.8 мМ аскорбиновой кислоты. Инкубация, при которой протекал процесс ПОЛ, осуществлялась в течение 30 мин на водяной бане при 37°C в условиях постоянного встряхивания пробирок [22]. После этого реакция прекращалась добавлением 1 мл 30% трихлоруксусной кислоты, а осадок отделялся центрифугированием в течение 10 мин при 3000 об./мин. К 1 мл надосадочной жидкости добавляли 0.2 мл 0.6 М HCl и 0.8 мл 0.12 M тиобарбитуровой кислоты, после чего смесь нагревали при 100°C в течение 10 мин. Интенсивность окрашивания оценивалась спектрофотометрически при длине волны 535 нм. Расчет количества МДА производился по общепринятой формуле с использованием коэффициента молярнoй экстинкции ε = 1.56 × 10⁵ моль^–1 см^–1.

Для осуществления вышеупомянутого метода животные (n = 28) были разделены на 3 группы:

I – животные контрольной (ложнооперированной) группы (n = 6), не подвергшиеся ПОСА до декапитации.

II – группа ишемизированных животных (n = 11), получавших физиологический раствор непосредственно после ПОСА и декапитированных через 60 мин.

III – группа животных (n = 11), получавших меседин в/б сразу после ПОСА в дозе 10 мг/кг и подвергнутых декапитации через 60 мин.

Для оценки окислительной модификации белков опрелялся уровень карбонильных производных белков по методу R.L. Levine в модификации Е.Е. Дубининой [23]. Метод оценки ОМБ основан на реакции взаимодействия карбонильных производных окисленных аминокислотных остатков белков с 2,4-динитрофенилгидразином (2,4-ДНФГ) с образованием 2,4-динитрофенилгидразонов [10, 24].

Для количественного определения 2,4-динитрофенилгидразонов в мозговой ткани животных отдельно отбиралось каждое полушарие и для гомогенизации добавлялся 0.25 М раствор сахарозы в пересчете 5 мл на 0.5 г ткани. Во избежание искажения показателей уровня карбонильных производных белков из полученных гомогенатов удалялись нуклеиновые кислоты путем осаждения добавлением к 0.5 мл гомогената 4.5 мл 10% раствора стрептомицина сульфата, оставляя при комнатной температуре в течение 15 мин. Затем смесь центрифугировалась в течение 10 мин при 800 g. К 0.1 мл надосадочной жидкости добавляли 0.9 мл 20% трихлоруксусной кислоты (для осаждения белков), 1 мл 0.1 М раствора 2.4-ДНФГ и 1 мл 2 М HCl. Далее смесь инкубировалась при комнатной температуре в течение 1 часа после чего центрифугировалась 15 мин при 3000 об./мин. Полученный осадок трижды промывался 0.5 мл смесью этанола (96%) и этилацетата в соотношении 1 : 1 для экстракции липидов и 2.4-ДНФГ, не прореагировавших с карбонильными производными окисленных белков, а затем центрифугировался 15 мин при 3000 об./мин. Промытый осадок высушивался для удаления остатков этанол-этилацетата, затем растворялся в 2.5 мл 8 М раствора мочевины с добавлением 1 капли HCl. Раствор помещался в водяную баню на 10 мин, после чего охлаждался до комнатной температуры. Карбонильные производные окисленных белков регистрировались спектрофотометрически: альдегид-динитрофенилгидразоны нейтрального характера (АДНФГuv) и кетон-динитрофенилгидразоны нейтрального характера (КДНФГuv) в ультрафиолетовой области спектра при длинах волн 356 и 370 нм сответственно, а альдегид-динитрофенилгидразоны основного характера (АДНФГvs) и кетон-динитрофенилгидразоны основного характера (КДНФГvs) в области видимого света при 430 и 530 нм, соответственно. Количество полученных в результате карбонилирования продуктов выражалось в условных единицах оптической плотности (е. о. п) в расчете на 1 г ткани [25].

Для осуществления вышеупомянутого метода животные (n = 28) были разделены на 3 группы:

I – животные контрольной (ложнооперированной) группы (n = 8), не подвергшиеся ПОСА до декапитации.

II – группа ишемизированных животных (n = 10), получавших физиологический раствор непосредственно после ПОСА и декапитированных через 60 мин.

III – группа животных (n = 10), получавших меседин в/б сразу после ПОСА в дозе 10 мг/кг и подвергнутых декапитации через 60 мин.

Статистическая обработка данных производилась с использованием программы Microsoft Excel 2010, с помощью однокомпонентного аналитического метода ANOVA, достоверность полученных отклонений оценивалась по t-критерию Стъюдента. Данные представлены M ± σ_x.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изучение процесса ПОЛ в условиях экспериментальной ишемии показало, что нарушения кровообращения мозга сопровождаются повышением уровня МДА в гомогенатax мозгoвой ткани. Количество МДА у контрольных животных при аскорбатзависимом ПОЛ составило 1.86 ± 0.21 мкмоль/г ткани в правом и 1.86 ± 0.25 мкмоль/г ткани в левом полушариях. По сравнению с контрольными животными у ишемизированных особей через 1 час после перевязки правой общей сонной артерии был зарегистрирован более высокий уровень МДА, равный 3.95 ± 0.33 мкмоль/г ткани в правом и 3.52 ± 0.28 мкмоль/г ткани в левом полушарии (p < 0.0005).

Результаты исследования показали, что внутрибрюшинное введение меседина в дозе 10 мг/кг ишемизированным животным непосредственно после ПОСА, в течение часа достоверно (p < < 0.0005) снижает количество МДА в обоих полушариях мозга: на 45.45% – в правом и на 45.18% – в левом полушариях по сравнению с ишемизированными животными, не получавшими меседин (рис. 1).

Рис. 1.

Влияние меседина на содержание МДА в мозговой ткани. * p < 0.0005 по сравнению с контрольной группой, # p < 0.0005 по сравнению с группой ишемизированных животных (M ± σ_x). I – животные контрольной (ложнооперированной) группы (n = 6), не подвергшиеся ПОСА до декапитации, II – группа ишемизированных животных (n = 11), получавших физиологический раствор непосредственно после ПОСА и декапитированных через 60 мин, III – группа животных (n = 11), получавших меседин в/б сразу после ПОСА в дозе 10 мг/кг и подвергнутых декапитации через 60 мин.

Исследование процесса ОМБ в условиях экспериментальной ишемии показало, что цереброваскулярные нарушения, вызванные ПОСА, сопровождаются статистически достоверным (p < 0.005) повышением основных показателей, характеризующих окисление белков, в гомогенатах мозговой ткани по сравнению с контрольной группой.

Как видно из табл. 1, у контрольных животных в обоих полушариях уровни исследуемых показателей (АДНФГuv, АДНФГvs, КДНФГuv и КДНФГvs) не отличались.

В группе ишемизированных животных через 60 мин после ПОСА в правом и левом полушариях отмечалось более чем 4-х кратное превышение содержания АДНФГuv по сравнению с контрольной группой. Регистрировалось также и повышение уровня АДНФГvs почти в 4 раза (табл. 1).

Аналогичные изменения, но менее выраженные, отмечались и в содержании КДНФГuv и КДНФГvs. Так, в обоих полушариях уровень КДНФГuv возрос более, чем в 3 раза, а уровень КДНФГvs – в 2.8 раза (табл. 1).

Как показали эксперименты, внутрибрюшинное введение меседина в дозе 10 мг/кг непосредственно после ПОСА, в течение часа предотвращает повышение интенсивности окисления белков, о чем свидетельствует понижение уровня АДНФГuv в 3 раза, АДНФГvs – в 2, КДНФГuv – в 2 и КДНФГvs – в 1.6 раза в обоих полушариях по сравнению с группой ишемизированных животных (табл. 1).

Итак, применение меседина в условиях экспериментальной ишемии мозга приводит к значительному снижению уровня основных показателей, характеризующих ОМБ: АДНФГuv (на 88.84 и 86.07%), АДНФГvs (на 67.37 и 62.92%) КДНФГuv (на 77.08 и 74.29%) и КДНФГvs (на 59.46 и 59.71%) в правом и левом полушариях соответственно, по сравнению с ишемизированными животными, не получавшими препарат.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Выявленная эффективность лекарств с антигипоксантным и антиоксидантным действием диктует необходимость дальнейшего поиска средств коррекции церебральных ишемических нарушений среди соединений с подобной активностью [2, 6]. В указанном плане исследование меседина было обосновано полученными ранее данными относительно его антигипоксантной активности [13], превосходящей аналогичные эффекты не только α₂-адреноблокаторов идазоксана и бетидина [26], но и хорошо известных антигипоксантов, какими являются винпоцетин и пирацетам [27, 28].

Все вышеизложенное явилось основой для исследования влияния меседина на уровень маркеров гипоксии.

Результаты экспериментального исследования свидетельствуют о том, что в условиях церебральных ишемических нарушений, вызванных перевязкой правой общей сонной артерии, в мозговой ткани отмечается повышение количества МДА, причем направленность отмеченных изменений особо не отличается в правом (с перевязкой) и контралатеральном полушариях. Одновременно с накоплением конечного продукта перекисного окисления липидов в исследуемой модели ишемии мозга индуцируется также и процесс карбонилирования белков, о чем свидетельствует повышение количества динитрофенилгидразонов, причем преимущественно за счет первичных маркеров оксидативного стресса – альдегидных производных, что указывает на персистенцию фрагментов белков, нарушенных в результате активации процессов окисления в мозговой ткани. Хотя отмечается также и повышение количества вторичных маркеров – кетоновых производных, степень выраженности карбонилирования с образованием кетоновых агрегантов модифицированных белков уступает их изменению по типу концевого окисления, что согласуется с данными, ранее полученными другими авторами [29].

Таким образом, проведенные исследования свидетельствуют о том, что выявленная ранее антигипоксантная активность меседина проявляется также в условиях цереброваскулярных нарушений, вызванных перевязкой общей сонной артерии. Доказательством этого является способность меседина значительно предотвращать повышение уровня МДА, а также АДНФГuv, АДНФГvs, КДНФГuv и КДНФГvs, что объясняет возможные механизмы антигипоксантного действия – предотвращение перекисного окисления липидов и окислительной модификации белков.

Все это свидетельствует о том, что применение меседина в качестве потенциального средства, корригирующего цереброваскулярные ишемические нарушения обосновано, так как наряду с выявленной способностью улучшать мозговое кровообращение, предотвращать развитие ишемических структурных изменений и нейроповеденческих расстройств [30], исследованное соединение смягчает агрессивное влияние оксидативного стресса, защищая мозговую ткань в условиях гипоксии.

ВЫВОДЫ

1. Односторонняя перевязка правой общей сонной артерии сопровождается повышением уровня малонового диальдегида почти в 2 раза в правом и на 89.25% в левом полушарии.

2. Внутрибрюшинное введение меседина в дозе 10 мг/кг способствует снижению уровня малонового диальдегида в условиях ишемических нарушений мозга на 45.45% в правом и 45.18% в левом полушарии.

3. В условиях ишемизации мозга отмечается усиление процесса окислительной модификации белков: повышение содержания АДНФГuv более чем в 4 раза, АДНФГvs почти в 4 раза, КДНФГuv более чем в 3 раза и КДНФГvs – в 2.8 раза в правом и левом полушариях.

4. Внутрибрюшинное введение меседина в дозе 10 мг/кг снижает уровень основных показателей, характеризующих окислительную модификацию белков: АДНФГuv (на 88.84 и 86.07%), АДНФГvs (на 67.37 и 62.92%) КДНФГuv (на 77.08 и 74.29%) и КДНФГvs (на 59.46 и 59.71%) в правом и левом полушариях, соответственно.

5. Вышеперечисленные эффекты меседина указывают на выраженную антигипоксантную активность соединения.