Нейрохимия, 2019, T. 36, № 3, стр. 179-194

Моделирование болезни Альцгеймера и перспективы ее терапии с использованием индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

Л. Г. Хаспеков

ФГБНУ “Научный центр неврологии”
Москва, Россия

Поступила в редакцию 12.09.2018
После доработки 28.09.2018
Принята к публикации 01.10.2018

Полный текст (PDF)

Аннотация

Разработка технологии индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) открыла новые возможности исследования механизмов патогенеза и поиска эффективных способов терапии острых и хронических форм церебральной патологии. В обзоре обобщены современные данные литературы, касающиеся использования технологии ИПСК для моделирования in vitro болезни Альцгеймера, поиска новых фармакологических препаратов для ее лечения и современных подходов к нейротрансплантации для ее персонализированной клеточной терапии.

Ключевые слова: индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, болезнь Альцгеймера, моделирование in vitro, лекарственный скрининг, нейротрансплантация

ВВЕДЕНИЕ

По последним данным Альцгеймеровской ассоциации США, в мире насчитывается около 50 миллионов человек со старческой деменцией, из них более чем у половины диагностирована болезнь Альцгеймера (БА), заболеваемость которой в первом десятилетии XXI в. выросла почти на 70%. До 2010 г. в мире насчитывалось свыше 30 млн больных, и, поскольку полагают, что их число каждые 20 лет удваивается, к 2030 г. оно может достичь 65–66 млн, а к 2050 г. – более 120–130 млн [1, 2].

Очевидно, что необходимость исследования механизмов патогенеза и поиска способов лечения БА в настоящее время актуальна как никогда ранее.

Различают наследственную (генетическую, семейную) и спорадическую разновидности БА (НБА и СБА). Гистологически для обеих форм характерно накопление в ткани мозга внеклеточных сенильных бляшек, состоящих из бета-амилоидных пептидов (Аβ), и внутриклеточных нейрофибриллярных клубков (танглов), образованных гиперфосфорилированным тау (ассоциированным с микротрубочками фосфопротеином) и вызывающих нарушение аксонального транспорта, а также повреждение нейронов и синапсов в новой коре и ряде подкорковых структур [3, 4]. Эти изменения приводят к атрофии различных областей мозга (в том числе гиппокампа, энторинальной коры, височной, теменной, лобной долей, поясной извилины), сопровождаемой исчезновением клеток и синапсов и практически полной утратой способности запоминать новую информацию в сочетании с потерей, запасенной ранее [5, 6].

Первыми при БА повреждаются пирамидные глутаматергические нейроны гиппокампа и новой коры [7], что обусловлено, по-видимому, нарушением их холинергической иннервации и послужило основой для “холинергической” гипотезы БА [8] и предположения о том, что дефицит холинергических нейронов ее инициирует. Далее тау-патология распространяется на другие структуры, усугубляя тяжесть заболевания. Aβ аккумулируется преимущественно в новой коре и прогрессирование этой патологии менее прогнозируемо. Одной из основных причин аутосомно-доминантной НБА являются мутации в генах амилоидного прекурсорного белка (АРР), локализованного в эндосомах и на поверхности клеток, пресенилина 1 (PSEN1), распределенного по всей клетке, и пресенилина 2 (PSEN2), локализованного в эндосомных и лизосомных компартментах, хотя в 99% случаев имеет место СБА. Однако общие черты, характерные для течения и НБА, и СБА свидетельствуют о том, что результаты исследований на моделях НБА могут экстраполироваться на модели БА в целом.

АРР, PSEN1 и PSEN2 образуют общий путь процессинга АРР, вовлеченный при его нарушении в патогенез БА. АРР – трансмембранный белок с невыясненной функцией. Его последовательное расщепление α- и γ-секретазой или β- и γ-секретазой приводит к формированию растворимого АРР, а под воздействием β- и γ-секретазы образуется Aβ, короткий пептид, основной компонент амилоидных бляшек.

Для НБА характерно раннее развитие (до 65 лет), наследственный характер и встречаемость менее 5%. Эта форма развивается вследствие редких аутосомных доминантных мутаций в гене белка-предшественника β-амилоида (АРР) и в генах пресенилина, PSEN1 и PSEN2. АРР – интегральный трансмембранный синаптический белок с невыясненной функцией, локализованный в эндосомах и на поверхности клеток. Его последовательное расщепление α- и γ-секретазой или β- и γ-секретазой приводит к формированию растворимого АРР, а под воздействием β- и γ-секретазы образуется Aβ, короткий пептид, основной компонент амилоидных бляшек [9]. Для СБА характерно позднее начало (после 65 лет), спорадический характер и она встречается в 95% случаев. Однако наибольшая часть данных о патогенезе БА получена при моделировании ее наследственной формы [10].

Несмотря на важную роль наследственного фактора при БА, исследования, направленные на полногеномный поиск ассоциаций (англ. GWAS, genome-wide association studies) на моделях СБА обнаружили, что ее важнейшим фактором риска является изоформа аполипопротеина Е (АРОЕ) – АПОЕ4 [11]. Следует отметить, что ген АРОЕ, как и некоторые другие генетические локусы (CR1, CD33, TREM2), которые относят к врожденной иммунной системе, активно экпрессируется микроглией, что указывает на важное значение этой системы и возможную роль микроглии в патогенезе БА [12]. Несмотря на то, что другие факторы риска этого заболевания играют, по сравнению с АРОЕ, гораздо меньшую роль, данные GWAS свидетельствуют о мультифакторной природе СБА.

Вследствие мультифакторности и гетерогенности БА, ее этиология далеко не ясна. В то время как мутации пресенилина 1 (PSEN1) и 2 (PSEN2), а также белкового предшественника амилоида (АРР) ответственны за НБА с ранним началом, этиология СБА у оставшихся 95% пациентов намного сложнее вследствие множества факторов, вовлеченных в ее патогенез [2]. К настоящему времени, помимо трех указанных выше достоверно идентифицированных каузативных генов, обнаружены многочисленные гены риска (ABCA7, BIN1, CASS4, CD33, CD2AP, CELF1, CLU, CR1, DSG2, EPHA1, FERMT2 и другие), вовлеченные в патогенез БА [13]. Однако генетические факторы могут лишь отчасти объяснить риск БА. Наиболее широко в настоящее время распространено мнение, согласно которому раннее начало БА является вероятнее всего следствием сложных взаимодействий многочисленных генетических и не генетических факторов. К последним относят половую принадлежность, церебрально-кардиоваскулярную патологию, метаболические заболевания, травматическое повреждение мозга, нарушения сна, хроническую гипоксию, токсины окружающей среды, низкий интеллектуальный уровень. В то же время механизмы патогенеза БА в основном оставались не изученными вследствие отсутствия моделей АД, адекватных и специфических для конкретных пациентов, причем ни одна из трансгенных моделей на животных не может полностью объяснить все патогенетические и клинические особенности БА. Поэтому возникла насущная потребность в разработке стратегии поиска новых лекарственных средств и новых технологий и моделей, отражающих течение БА у пациентов и раскрывающих механизмы ее патогенеза.

В последнее время поводом для оптимизма в поиске способов моделирования и терапии хронических нейродегенеративных заболеваний, в том числе БА, стало поступательное освоение новых клеточных технологий, в частности, технологии индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК), с перспективой ее применения в трансплантационной заместительной терапии БА, а также болезни Паркинсона (БП), бокового амиотрофического склероза (БАС) и других. Так, для моделирования БА можно из ИПСК получить холинергические нейроны, используя комбинацию соединения Е, 2S-2-N-пропанамид (Calbiochem), с соединением W, 3,5-bis(4-нитрофенокси)бензоевой кислотой, чтобы активировать специфические внутриклеточные сигнальные пути, направленные на репрессорный элемент REST (repressor element 1-silencing transcription factor) и его корепрессор (CoREST) [14]. Эти индуцированные нейроны в дальнейшем подвергаются селекции с использованием специфических маркеров, а при трансплантации животным с моделями нейродегенеративных заболеваний нормально функционируют и способствуют восполнению неврологического дефицита. Показана высокая выживаемость in vitro допаминергических нейронов, дифференцированных из ИПСК и пригодных для клеточной терапии БП [15]. В результате направленной дифференцировки ИПСК получена одна из разновидностей двигательных нейронов спинного мозга, дегенерирующих при семейной форме бокового амиотрофическоо склероза [16]. С использованием иммунофенотипирующего скрининга разработаны эффективные способы выделения и дифференцировки глиальных клеток из гетерогенной популяции ИПСК [17].

Спустя 10 лет после первого успешного получения ИПСК, последующее применение этих клеток в фундаментальных биомедицинских исследованиях внесло значительный вклад в раскрытие не известных ранее механизмов патогенеза БА, в том числе, ее наследственной и спорадической форм, а также в разработку новых подходов к ее лечению.

КЛЕТОЧНЫЕ МОДЕЛИ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА НА ОСНОВЕ ТЕХНОЛОГИИ ИНДУЦИРОВАННЫХ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК

Плюрипотентные стволовые клетки (ПСК) играют важную роль в моделировании и исследовании молекулярных основ патогенеза различных заболеваний, поскольку могут дифференцироваться практически в любой тип клеток. ПСК, индуцированные из зрелых соматических клеток и полученные в результате их репрограммирования с использованием ретровирусной трандукции и экспрессии четырех транскрипционных факторов, OCT4, SOX2, KLF4 и c-MYC или OCT4, SOX2, NANOG и LIN28 [18], были названы индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками (ИПСК). Технология ИПСК позволяет на молекулярном уровне изучать патогенез многих, в том числе неврологических, заболеваний человека, и среди них – БА. Важным преимуществом использования ИПСК является возможность их получения от пожилых пациентов, что необходимо для исследования нейродегенеративных заболеваний с поздним началом, таких как БА и БП. Кроме того, поскольку ИПСК для каждого конкретного пациента генетически специфичны, они позволяют исследовать зависимость патогенеза неврологического заболевания от генетического фона этого пациента, что на животных моделях не представляется возможным. Таким образом, технология ИПСК обладает огромным потенциалом для моделирования БА, скрининга специфических лекарственных препаратов и персонализированной клеточной терапии (рис. 1 [19]).

Рис. 1.

Пациент-специфические клетки кожи или любых других соматических клеток репрограммируют в ИПСК, которые затем можно использовать для моделирования клеточных патогенетических механизмов заболевания и скрининга лекарств, специфических для данного пациента. Для коррекции в ИПСК мутаций в генах APP, PSEN1, PSEN2 или APOЕε4 используют методы генной инженерии, после чего скорректированные ИПСК дифференцируют в нейроны и глиальные клетки, пригодные для трансплантации в мозг того же пациента по [19].

Впервые ИПСК для моделирования БА были получены от пациентов, несущих семейные мутации в генах, ответственных за начало заболевания: PSEN1 (А246Е) и PSEN2 (N1411) [14]. В результате дифференцировки ИПСК от этих пациентов были получены холинергические нейроны. Были проанализированы продукция Aβ-пептидов и аккумуляция фосфорилированного тау. В нейронах, экспрессирующих мутацию А246Е в PSEN1 и N141I в PSEN2 обнаружено повышенное, по сравнению с контролем, соотношение Aβ42/Aβ40, однако оно было очень низким, указывая на то, что секреция Aβ-пептидов во время дифференцировки варьирует. В то же время, аккумуляции тау в нейронах этого типа не происходило. В фибробластах, а также в нейральных прогениторных клетках (НПК) и молодых нейронах, полученных из ИПСК от пациентов с БА с мутациями A246E или M146L в PSEN1, было обнаружено повышенное соотношение Aβ42/Aβ40 [20]. В этой работе было идентифицировано 14 генов, дифференциально регулируемых в PSEN1 молекулярного профиля НПК. Среди этих генов на поздней или промежуточной стадии БА дифференциальной экспрессией обладали GFRA3, ISL1, DLX1, SEMA3B и ERBB3.

Затем были созданы линии ИПСК от двух пациентов с СБА (названные sAD1/sAD2) и от двух с дупликацией АРР (АРРDp) [10] и обнаружено, что в нейронах из ИПСК-линий АРРDp и sAD2 значительно увеличено содержание Aβ40 (но не Aβ42, содержание которого так же, как и Aβ38, было довольно низким), усилено формирование фосфорилированного тау (Thr 231) и повышен уровень активной гликоген-синтазы киназы-3β (aGSK-3β), а нейроны из тех же ИПСК от пациентов с БА накапливают ранние крупные RAB5-позитивные эндосомы, что соответствовало данным анализа нативных нейронов пациентов с БА и указывало на то, что эти эндосомы могут регулировать процессинг АРР, усиливая формирование фосфо-тау, нейрофибриллярных клубков, повреждение синапсов и апоптоз. Кроме того, обработка ИПСК-производных нейронов ингибиторами β- (но не γ-) секретазы значительно уменьшала содержание Thr 231 и aGSK-3β, в то время как ингибиторы γ-секретазы снижали только уровень Aβ40, что указывало на то, что протеолиз АРР, а не Aβ40, имеет у нейронов человека прямое отношение к активации GSK-3β и фосфорилированию тау.

В одной из работ было получено 7 линий ИПСК: 3 линии от пациента, несущего делецию Е693 в АРР (АРР Е693d), 2 – от пациента с мутацией в АРР V717L (АРР V717L) и 2 – от пациента с СБА [21]. Олигомеры Aβ накапливались в нейронах из линии ИПСК АРР Е693d, а их повышенный уровень снижался под воздействием ингибиторов β‑секретазы. В то же время ингибиторы β-секретазы и докозагексаеновая кислота (ДГК) усиливали стрессовые реакции у клеток от пациентов с БА. Эти данные указывают на возможность использования пациент-специфических ИПСК для скрининга средств против БА.

От двух пациентов с НБА, несущих мутацию АРР V717I, были получены 4 линии ИПСК, дифференцированных в клетки, экспрессирующие маркеры нейронов переднего мозга [22]. Эта мутация нарушала расщепление АРР как β-, так и γ‑секретазой. Усиление расщепления АРР β-секретазой повышало содержание и sAPPβ, и Aβ, тогда как при альтерации первичного сайта расщепления γ-секретазы уровни Aβ42 и Aβ38 возрастали. В нейронах из ИПСК от пациентов с БА было повышено содержание общего и фосфорилированного тау, а антитела к Aβ снижали в них повышенный уровень этого белка. Таким образом, изменения тау имеют непосредственное отношение к Aβ-фенотипу, а повышение содержания тау может быть следствием накопления Aβ, что соответствует гипотезе амилоидного каскада БА [23].

Известно, что повреждение холинергических нейронов переднего мозга (ХНПМ) имеет прямое отношение к нарушению памяти и когнитивных функций при БА. Поэтому получение этих нейронов из пациент-специфических ИПСК важно для моделирования заболевания in vitro и для разработки новых терапевтических подходов к БА. Показано, что ХНПМ, полученные из ИПСК пациентов с НБА, обладают типичными для БА биохимическими свойствами, в частности, повышенным соотношением Aβ42/Aβ40 и высокой чувствительностью к токсическому действию глутамата [24].

Для пациентов с синдромом Дауна (СД), у которых развивается деменция с ранним началом, характерны признаки нейродегенерации, сходные с наблюдаемой у пациентов с БА. Обнаружено, что в нейронах из ИПСК пациентов с СД происходит быстрое накопление амилоидных депозитов, а также гиперфосфорилирование тау и его внутриклеточное перераспределение [25]. Следовательно, эти нейроны являются перспективной клеточной моделью СД и БА и позволяют осуществлять эффективный лекарственный скрининг.

С помощью активированного флуоресценцией клеточного сортинга было выделено более 95% чистой культуры индуцированных нейронов, содержавших повышенные уровни фосфорилированного тау (Thr 231) и активной GSK-3β. В ИПСК и в нейронах, несущих мутацию V717I в АРР, вдвое повышалась продукция Aβ42 и незначительно – Aβ40, а уровень Aβ38 и соотношение Aβ38/Aβ40 существенно, по сравнению с контролем, возрастали. Кроме того, в нейронах от пациентов с НБА было снижено соотношение APPα/APPβ, причем продукция APPβ превышала контрольную в 1.4 раза, что указывало на возможность первичного изменения начального эпсилон-сайта расщепления внутри АРР с участием мутации V717I [22]. В нейронах и астроцитах, полученных из ИПСК от пациентов с НБА с мутацией АРР Е693Δ, скапливались олигомеры Aβ [21]. В этих нейронах были повышены уровни всех маркеров стресса эндоплазматического ретикулума (ЭПР) и окислительного стресса, в том числе BiP, расщепленная каспаза 4, PRDX4-кодирующий антиоксидантный белок пероксиредоксин-4, АФК. Таким образом, можно предположить, что внутриклеточные Aβ-олигомеры индуцируют окислительный стресс, который вызывает повышение внутриклеточного уровня АФК, участвуя в патогенезе БА.

Модели, имитирующие неврологические заболевания, довольно сложны, что особенно актуально в отношении БА, фенотип которой, в отличие от других нейродегенеративных форм церебральной патологии, воспроизводится гораздо труднее. Поскольку БА является заболеванием центральной нервной системы, прижизненное получение тканей мозга пациентов является трудно выполнимой задачей. Кроме того, мутации, внедренные в гены животных, не воспроизводят мутаций, наблюдаемых у больных, что делает трансгенные модели in vivo недостаточно информативными и вынуждает моделировать БА преимущественно in vitro. С другой стороны, отсутствие стабильных генетических нарушений при СБА создает трудности ее моделирования, поэтому ИПСК используются преимущественно для моделирования НБА [26].

Для выяснения адекватности ИПСК-моделей патологии НБА со специфическими точечными мутациями в генах PSEN1, PSEN2 или APP часто используют показатели соотношения пептидов Aβ40 и Aβ42 (см. выше). Согласно гипотезе амилоидного каскада, с заболеванием ассоциируется повышенное соотношение в плазме Aβ42/40, обусловленное либо усилением продукции Aβ42, либо снижением продукции Aβ40 [27]. В моделях in vitro с мутациями PSEN1 и PSEN2 показана повышенная секреция Aβ42, что согласуется с представлениями о патогенезе БА. В других моделях с мутацией PSEN1, таких как мутация L116P, ответственная за агрессивную разновидность БА, после гиперэкспрессии PSEN1 соотношение Aβ42/40 повышается, вероятно, за счет значительного снижения уровня пептидов Aβ40 в нейронах с этой мутацией [20].

В той же работе исследование эндосомальных и синаптических маркеров в АРР-мутантных ИПСК выявило повышение в них содержания эндосом Rab5+, что характерно для СБА-фенотипа, однако уровень синаптического маркера синапсина 1 уменьшен не был, хотя в исследовании in situ он был снижен. При сравнении 7 типов APP-мутаций, в том числе, делеции APP E693Δ и мутации APP V717L, обнаружено, что клеточные линии не всегда реплицируют одни и те же фенотипы, что может быть связано с различными периодами дифференцировки клеток [21]. Кроме того, оказалось, что Е693Δ препятствует формированию амилоида, а у трансгенных мышей, экпрессирующих Е693Δ, внеклеточные скопления амилоида и танглы тау не образуются [28]. Поэтому не все существующие модели воспроизводят БА-патологию, так же, как и не все пригодны для получения линий специфических ИПСК.

На культивированных нейронах новой коры, дифференцированных из нормальных ИПСК, была исследована токсичность белков, вовлекаемых в патогенез БА. Так, Аβ взаимодействовал с глутамат- и ГАМК-ергическими нейронами – производными ИПСК, но погибали преимущественно глутаматергические нейроны [29]. Обработка ИПСК олигомерным Аβ в течение 8 дней была токсичной для синапсов [30], на что указывали нарушения кластеров синаптических пузырьков и постсинаптической АМРА-рецепции, сопровождавшиеся индукцией фосфорилированного тау и повреждением ЭПР. При этом токсическая концентрация Аβ (1–5 мкМ) превышала его низкий физиологический уровень, достигающий 50 нМ в ткани мозга пациентов с БА [31]. Эти результаты, указывающие на утрату синапсов и кальциевый дисбаланс у нормальных нейронов человека под воздействием специфических белков, вовлекаемых в БА, способствуют раскрытию ее патогенетических механизмов.

Для дифференцировки ИПСК в корковые нейроны требуется длительный период времени, в то время как экспрессия АРР и уровень Aβ-пептидов возрастают постепенно, с 30 до 100 дней in vitro [32]. Относительно сроков культивирования ИПСК существуют различные мнения. Так же, как и в целом мозге, нейрогенез in vitro до установления стабильной функциональной активности нейронов происходит в течение длительного периода [33]. В случае тау-патологии экспрессия зрелых изоформ тау низка даже через 90 дней дифференцировки некоторых линий ИПСК с мутацией МАРТ (microtubule-associated protein tau-гена) [34]. Это вызывает сомнения в адекватности моделей ИПСК с небольшим периодом культивирования.

В целом приведенные выше данные отражают изменчивость линий ИПСК и указывают на необходимость дальнейшего совершенствования моделей НБА in vitro. В первую очередь речь идет об исследованиях, касающихся продолжительности культивирования ИПСК, с целью определения оптимальных временных параметров старения нейронов, сопровождающегося аксональной дегенерацией.

Для генерации дифференцированных кортикальных холинергических нейронов использовали ИПСК, полученные от пациентов с синдромом Дауна и культивированные до 100 дней [35]. Нейроны, дифференцированные из таких ИПСК, используют для моделирования ранней НБА, поскольку пациенты с синдромом Дауна склонны к БА-патологии, а эти нейроны несут 3 копии APP. Нейрональные ИПСК мыши и человека с повышенной экспрессией APP секретируют Aβ, формируют амилоидные бляшки, а тау-белок в них меняет локализацию и уровень фосфорилирования. Кроме того, с этим фенотипом можно работать в течение длительного времени и в нем не происходит спонтанных мутаций, связанных с репрограмированием.

Моделирование пациент-специфических нейродегенеративных заболеваний в относительно физиологических условиях окружающей среды возможно при трансплантации нейронов, дифференцированных из ИПСК пациентов, в мозг экспериментальных животных. Например, мозг мыши обеспечивает адекватный клеточный каркас, позволяющий исследовать аксональную пластичность нейронов, полученных из ИПСК здоровых индивидов и пациентов с БА. Такие химерные модели могут воспроизводить нейропатологические состояния, более или менее соответствующие ситуации in vivo, и пригодны для поиска новых лекарственных средств, тем более что нейроны, дифференцированные из ИПСК, способны после трансплантации переживать в мозге хозяина в течение месяцев и даже лет, а также функционально интегрироваться в его нейрональную сеть [3639].

Несмотря на трудности в получении нейронов, содержащих набор изоформ тау, ИПСК-модели мутаций в гене MAPT, находящихся в различных экзонах, дают определенное механистическое представление о патогенезе БА. Нейрональная мутация R406W совместно с мутацией IVS10+14 вовлечена в усиленную агрегацию тау, обнаруживаемую методом дот-блот анализа и с помощью конформационно-специфических антител к неправильно свернутому тау. Кроме того, нейроны с мутациями R406W и IVS10+14 высоко чувствительны к перегрузке ионами кальция [40].

Несмотря на преобладание тау-изоформы 3R, была успешно смоделирована мутация P301L. У нейронов с этой мутацией отмечено раннее функциональное развитие, сходное с наблюдаемым у нейронов с мутацией N279K [41]. Моделирование агрегации тау-белка in vitro является сложной задачей, в частности, вследствие его высокой растворимости в физиологических условиях. Тау-агрегацию в ИПСК-нейронах индуцировали трансфекцией заранее сгруппированных фибрилл [42]. Кроме того, нерастворимые тау-агрегаты, содержащие серебро, были получены в 3D-модели БА в условиях оверэкспрессии АРР и PSEN1 [43].

Тау-мутацию А152Т связывают с редким вариантом, повышающим риск таупатий в группе FTD [44]. Молекулярные механизмы, опосредующие это вариант нейродегенерации, исследован с использованием гетеро- и гомозиготных ИПСК, полученных непосредственно от пациентов или путем генной инженерии. С использованием вестерн-блоттинга и масс-спектрометрии обнаружены разновидности клеточных фенотипов (в том числе апрегуляция тау-протеина, опосредуемая мутацией А152Т), сопутствующие усилению тау-фосфорилирования в многочисленных эпитопах, ассоциированных с заболеванием, и снижению растворимости тау [45]. Вследствие этих изменений ИПСК-нейроны лишались тиофлавина-S, взаимодействующего с амилоидными фибриллами, что указывает на возможность моделирования на этих нейронах изменений тау, предшествующих формированию клубков. Кроме того, показано, что в А152Т- и в 10+16 FTD-нейронах в результате активации ERK-пути повышено содержание матричных металлопротеаз ММР2 и ММР9. Наряду с этим, ингибирование МЕК, активатора ERK, снижало экспрессию ММР9 и усиливало нейрональную гибель [46].

Создавать in vivo модели, воспроизводящие формирование бляшек, клубков тау и гибель нейронов при БА, достаточно сложно, хотя и необходимо. В то же время ИПСК-технология дает возможность исследовать in vitro взаимоотношения тау и Aβ в нервной системе человека. Так, для ИПСК-нейронов с повышенным содержанием фосфорилированного тау от пациентов с НБА характерна тесная корреляция между АРР-мутациями и высоким уровнем тау-белка, что указывает на связь между метаболизмом АРР и гомеостазом тау [47]. Несмотря на то, что ИПСК-нейронам присуще гиперфосфорилирование тау, его слабая растворимость и анормальная локализация, развитие аргирофильных тау-филаментов обусловливают повышенную экспрессию мутантных АРР и PSEN1 [43].

С целью выявления подверженности нейронов человека токсичности Aβ, были созданы химерные модели этих нейронов, с последующей их трансплантацией в мозг мыши с моделью БА. Пересаженные нейроны дегенерировали, в то время как нейроны мыши оставались неповрежденными. При этом были выявлены ранние маркеры тау-патологии, такие как иммунореактивность к антителам МС1, специфических для патологических конформаций тау, хотя формирования клубков тау обнаружено не было, что указывает на отсутствие прямой корреляции между их наличием и гибелью нейронов [39, 48].

Остается неясным, какие механизмы предохраняют незрелые нейроны от развития патологий, связанных с тау-белком, необходимым для нормального развития нервной системы. Ответу на этот вопрос могут способствовать технологии редактирования генома (например, CRISPR, см. ниже), которые позволят создать ИПСК, нокаутные по тау, и, таким образом, определить, насколько он вовлечен в токсическое действие амилоида на нейроны человека, как это было показанное ранее на нейронах животных с моделью БА [49].

В патогенезе БА участвуют не только нейроны и астроциты, но и другие клетки ЦНС. Так, мутации гена, кодирующего синтезируемый клетками микроглии белок TREM2, повышает в несколько раз риск заболеть БА. В ткани, окружающей амилоидные бляшки, обнаружено повышенное содержание активированной микроглии, а ее удаление ограничивает распространение тау-клубков. Поэтому для исследования роли микроглии в патогенезе БА были разработаны соответствующие модели, полученные из ИПСК человека, дифференцированных в микроглиальные клетки, которые реагировали на Aβ и олигомерный тау апрегуляцией генов, ассоциированных с БА (TREM2, CD33, MS4A и APOE) [50, 51].

Поскольку в патогенез БА вовлекается гемато-энцефалический барьер, важное значение имеет разработка технологии ИПСК относительно его клеточных компонентов. В последние годы разработаны протоколы получения из ИПСК сосудистых эндотелиальных клеток и перицитов. Вследствие различных источников формирования микроглии, перицитов и эндотелиальных клеток, их линии не могут быть одновременно включены в 3D-культуры органоидов из ИПСК. Однако при добавлении к органоидам только микроглиальных клеток, дифференцированных из ИПСК, они интегрировались в них, мигрировали и созревали [51].

“Трансмиссивная” тау-гипотеза БА моделировалась с использованием контрольных ИПСК-нейронов и экзогенных разновидностей тау [52]. Олигомерные экзогенные тау, наподобие эндогенных, формировали нерастворимые агрегаты, вызывая ретракцию нейритов, повреждение синапсов и дисбаланс кальциевой сигнализации. Важно отметить, что эти свойства были присущи олигомерным (но не мономерным) тау, сходным с его токсичными разновидностями in vivo. Содержание тау в питательной среде, кондиционированной ИПСК-нейронами, зависело от их функциональной активности, а внеклеточный тау захватывался ими, что указывало на способность тау передаваться от нейрона к нейрону [53].

В моделировании БА in vitro важное значение приобретают трехмерные (3D) культуры ИПСК, которые способствуют унификации разных гипотез патогенеза БА, позволяя в единой трехмерной модели совместить исследования Aβ-патологий и таупатий [5456]. Трехмерная конструкция культуры создает, по сравнению в двухмерной, более оптимальные условия окружающей среды, характерные для клиники БА, например, такие, как повышенный уровень Aβ-42, а также приближается к условиям моделирования БА in vivo [57]. В отличие от двухмерных (2D), 3D-культуры содержат внутренние желудочки и многочисленные межклеточные пространства, где удерживаются белки, секретируемые клетками, в том числе Аβ-пептиды, удаление которых при смене среды в двухмерных культурах снижает вероятность формирования скоплений пептидов. В то же время органоиды или встроенные в матрикс трехмерные культуры создают условия для повышения локальной концентрации белков и формирования патологических агрегатов.

В одной из недавних работ [58] обнаружено, что в трехмерных органоидах из ИПСК от пациентов с дупликацией АРР и мутациями M146I и A264E в PSEN1 формирование амилоидных депозитов происходит к 60 дню in vitro и усиливается к 90 дню. После этого срока в органоидах от пациентов с НБА становился заметным повышенный, по сравнению с контролем, уровень гиперфосфорилированного тау (pS396). При обработке органоидов ингибиторами β- и γ-секретазы количество амилоидных депозитов и уровень pS396 снижались.

В 3D- (но не в 2D-) культурах ИПСК под влиянием экзогенного Aβ происходило фосфорилирование и активация P21-активированных киназ (PAKs), что сопровождалось патологическими изменениями цитоскелета. Эти данные создают представление о том, что Aβ может локально накапливаться в 3D-культурах и вызывать более достоверные патологические изменения [59]. Для получения in vitro 3D-моделей БА использовали ИПСК от пациентов не только с НБА, но и с СБА. В этих моделях ингибиторы γ- и β-секретазы снижали уровень секреции Аβ. В то же время при одинаковых концентрациях ингибитора его эффективность в 2D- и 3D-культурах была различной, что необходимо учитывать при скрининге лекарственных препаратов с использованием этих двух моделей [54]. Эти данные указывают на актуальность 3D-моделей БА, поскольку не только подтверждают результаты, полученные на 2D-моделях, но и создают условия для получения in vitro агрегированного тау-белка. Органоиды также могут быть использованы для исследования сложных процессов, таких как пространственные взаимоотношений между тау-белком и амилоидом и распределение белковых конформаций внутри 3D-структуры.

До настоящего времени нет сведений о развитии in vitro истинных нейрофибриллярных клубков тау в отсутствие оверэкспрессии одного или более мутированных генов. Отчасти это возможно вследствие того, что клубки образуются в течение очень длительного периода и не успевают сформироваться во время культивирования. Необходимо также иметь в виду, что различные модели клеточных культур могут не содержать разнообразные изоформы тау, характерные для взрослого мозга, и что условия, необходимые для развития тау-патологии, неизвестны. Кроме того, несмотря на то, что гиперфосфорилирование тау является признаком патологии, этот белок в норме активно фосфорилируется во время раннего развития, и фетальные стволовые клетки могут быть толерантны к формированию тау-клубков [60].

Важный шаг вперед заключается в дальнейшей разработке моделей БА in vitro, которые наиболее достоверно воспроизводят бляшки Аβ и скопления тау-протеина, наблюдаемые посмертно в мозге пациентов с БА. С другой стороны, моделирование ранних стадий БА дают возможность исследовать наиболее ранние патологические изменения тау и определить последовательность событий, приводящих к формированию его клубков. Кроме того, есть данные о возможном отсутствии тесной взаимосвязи между образованием тау-клубков и нейродегенерацией [48], поэтому задержка в их развитии не является препятствием к изучению механизмов патогенеза заболеваний, ассоциируемых с тау-патологией.

Одним из важных преимуществ нейронов из ИПСК является их способность воспроизводить сложные процессы экспрессии и сплайсинга Тау, происходящие в центральной нервной системе взрослого человека и не воспроизводимые в моделях БА на животных. Однако применение такого моделирования in vitro затруднено из-за относительной незрелости нейронов, полученных из ИПСК. Полногеномные транскриптомные исследования показали, что нейроны из ИПСК по профилям экспрессии генов довольно точно соответствуют фетальным нейронам, что также справедливо относительно сплайсинга тау и экспрессии его фетальной изоформы 0N3R, которая преобладает в ИПСК-нейронах [61]. Для экспрессии нескольких изоформ тау в ИПСК-нейронах требуются длительные сроки in vitro (от 5 мес. до года), что затрудняет их экспериментальное применение. Несколько кодирующих мутаций, таких как P301L и P301S, обычно используемых для моделирования заболевания in vitro и in vivo, локализуются в пределах альтернативно сплайсированного экзона 10. Поскольку для экспрессирования достаточного количества мутантного белка необходим длительный период культивирования, предложен метод, сокращающий период дифференцировки ИПСК в корковые нейроны со 100 до 16 дней [62], использование которого ускоряет старение последних, хотя не ясно, ускоряется ли при этом сплайсинг тау.

Трансплантация ИПСК-нейронов человека в мозг мыши вызывало через 8 мес. быстрое созревание и экспрессию изоформ тау 3R/4R в соотношении 1 : 1, наблюдаемом в мозге взрослого человека [39]. В таких химерных моделях ИПСК-нейроны специфически подвержены токсическому действию Aβ, однако неизвестно, принимает ли в этом участие тау. Несмотря на эти трудности, успешное моделировании таупатий с использованием ИПСК-нейронов с мутациями в МАРТ оказалось вполне возможным. Так, показано, что интронные мутации в гене МАРТ, такие как IVS 10+14 и 10+16, наряду с кодирующими мутациями, влияющими на тау-сплайсинг (например, N279K), препятствуют регуляции тау-сплайсинга, индуцируя экспрессию 4R-изоформ тау на ранних сроках культивирования кортикальных нейронов, дифференцированных из ИПСК, и способствуя ускорению их функционального развития [61]. Химерные модели приобретают важное значение для скрининга лекарственных средств и терапии БА.

Сказанное выше свидетельствует о том, что ИПСК, полученные от пациентов с НБА и СБА, воспроизводят ряд патологических признаков БА, в том числе продукцию Aβ, фосфорилирование тау и мн.др. Поэтому ИПСК-технология является перспективной для моделирования БА и скрининга новых лекарственных препаратов (см. ниже). Тем не менее, в использовании моделей БА на основе ИПСК еще существуют серьезные трудности.

Прежде всего, вследствие вариабельности от донора к донору и внутриклеточной гетерогенности, молекулярные основы ИПСК-технологии, особенно в отношении клеток человека, остаются слабо изученными. Так, в одной из работ только одна из двух линий ИПСК от пациента с НБА принадлежала к тому же фенотипу, что и линия APPDp [10]. В другой работе показано, что семь линий ИПСК от пациента с БА с делецией Е693 или мутацией V717L в АРР не всегда воспроизводят один и тот же фенотип [21]. Таким образом, несмотря на сходство в механизмах патогенеза НБА и СБА, существует необходимость более глубоких исследований причин гетерогенности фенотипов БА. Кроме того, хотя нейроны от пациентов с БА содержат токсические уровни Aβ и фосфорилированного тау, в них не обнаруживаются бляшки Aβ и клубки тау, возможно, потому, что в культуре не полностью воспроизводятся условия in vivo, которые способствуют патологической аккумуляции Aβ, происходящей в мозге пациентов и трансгенных мышиных моделей БА. Большего соответствия этим условиям можно достичь, используя трехмерные культуры нейронов из ИПСК человека.

У нейронов, дифференцированных из ИПСК от пациентов с БА, характерные признаки патологии появляются менее чем за 2 мес. in vitro, что означает более выраженную тенденцию, по сравнению с нативными клетками самого пациента, проявлять признаки БА. Однако остается неясным, могут ли один или два клеточных типа, дифференцированных из ИПСК, представлять собой все сложные фенотипы БА. Кроме того, несмотря на патологические изменения этих клеток, у них редко отсутствуют синаптические контакты или наблюдаются признаки дегенерации. Необходимо также иметь в виду, что БА – сложное заболевание, которое нарушает функционирование и нейронов, и глии, а последняя при БА участвует в клиренсе Aβ и в воспалении [63]. Таким образом, исследования глиальных клеток, полученных из ИПСК пациентов с БА, будут способствовать дальнейшему раскрытию механизмов ее патогенеза.

Следует подчеркнуть, что ИПСК здоровых доноров, используемые как контрольные, могут иметь генетический базис, отличающийся от ИПСК пациентов с БА, и такой способ контроля – не самый оптимальный при работе с клеточными моделями БА. В этом отношении более приемлемыми представляются изогенные ИПСК, в которых мутации скорректированы до дикого типа. В настоящее время изогенные контрольные клеточные линии со скорректированными мутациями получают с использованием технологий редактирования генома, таких как TALENs (transcription activator-like effector nucleases) или CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/CRISPR-associated protein (Cas), применяемых при моделировании заболеваний человека, в том числе БАС и опухолей [64, 65].

В целом изолированные соматические клетки претерпевают несколько этапов репрограммирования и нейрональной дифференцировки, что приводит к созданию большого количества индуцированных нейронов, специфичных для пациентов с БА и предназначенных для исследовательских целей и нейротрансплантации. Однако для клинического применения ИПСК необходимо преодолеть ряд трудностей. Так, несмотря на то, что ИПСК и индуцированные нейроны сохраняют оригинальный пациент-специфический геном, некоторые нарушения ДНК и эпигенетические изменения во время как репрограммирования, так и дифференцировки исключить нельзя. Потенциальные изменения сплайсинга ДНК или экспрессии генов могут индуцировать клональную гетерогенность среди ИПСК и привести к клеточным функциональным нарушениям. Кроме того, в индукцию иммунных ответов и клиренс пептида Aβ вовлекаются нейроглиальные клетки, и участие астроцитов и микроглии может оказывать существенное влияние на интерпретацию данных о клеточных фенотипах, специфических для БА, и об эффективности лекарственных средств. В настоящее время поиску закономерностей общих внутриклеточных путей, вовлеченных в патогенез БА у пациентов, несущих некоторые варианты ее риска, способствует GWAS. Следует отметить, что в будущем для более адекватного моделирования БА необходимо широкое применение трехмерных моделей культур клеток человека [43]. Очевидно и то, что до клинического применения требуется постоянное совершенствование протоколов получения и дифференцировки нейронов из ИПСК, потому что многие из этих протоколов требуют использования интегративных вирусов, а также культуральных сред и фидерных клеточных субстратов, содержащих животные компоненты, которым свойственны неожиданные иммунные реакции и туморогенез.

Серьезным недостатком в использовании ИПСК-нейронов для исследования БА (как в 2D-, так и в 3D- культурах) является небольшой срок развития нейронов. Поскольку степень дифференцировки прямо коррелирует с длительностью периода развития, 100-дневная генерация корковых нейронов человека in vitro соответствует их развитию на стадии плода, тогда как наибольший риск БА связан со старением и болезнь обычно начинается после 50 лет. Кроме того, из-за более позднего глиогенеза in vivo сроки развития нейронов и глии по времени не совпадают и культуры не являются полноценным аналогом мозга, прежде всего, из-за меньшего количества астроцитов, что отрицательно влияет на созревание нейронов, так же, как и на неклеточные автономные механизмы патогенеза БА [66].

Для ускоренного “состаривания” ИПСК-нейронов использовали мутацию гена белка ламина А, LMNA, вызывающую болезнь преждевременного старения, прогерию. Допаминергические нейроны из ИПСК с усиленной экспрессией прогерина (мутированной версией ламина А) генерировали эпигенетические маркеры старения, отсутствующие у контрольных клеток [67]. В другой работе применили технику прямого репрограммирования, когда фибробласты трансдифференцируют в нейроны, минуя пролиферативную стадию [68]. Таким способом устраняется стадия плюрипотентности и удаления эпигенетических маркеров не происходит. Полученные нейроны, по сравнению с ИПСК-нейронами, сохраняют генетические признаки старения, и в них наблюдается ассоциируемое со старением снижение ядерно-цитоплазматического транспорта. Чтобы ускорить процесс старения и индуцировать появление в нейронах из ИПСК его признаков, таких как уменьшение числа дендритов, усиленное повреждение ДНК, повышенная генерация активных форм кислорода, во время культивирования и ранней дифференцировки ИПСК применялось фармакологическое ингибирование теломеразы [69].

Наряду с индукцией старения, в культурах ИПСК можно регулировать клеточную пролиферацию. Так, ингибирование Notch-сигнализации тормозит деление клеток и инициирует терминальную дифференцировку, а также уменьшает ее длительность. В 3D-культурах Notch-ингибирование также способствовало созреванию нейронов, хотя работа с такими культурами осложняется тем, что внутри них не все клетки доступны обработке.

Серьезным затруднением в технологии ИПСК остается вариабельность между клонами ИПСК от одного и того же человека и от разных людей. Проблематична генерация требуемого количества клеточных линий. Очень важна тщательная селекция контрольных линий, с которыми будут сравниваться культуры клеток пациентов. Стабилизировать в какой-то мере переменный генетический ландшафт между клеточными линиями может использование в качестве контроля клеток от здоровых братьев и сестер или членов их семей, что позволит уменьшить расхождения аллельных генов.

Дальнейшему совершенствованию технологии ИПСК, применяемой при исследовании и поиске способов терапии нейродегенеративных заболеваний, в том числе БА, призваны служить банки ИПСК. Хотя банк пуповинной крови имеется во многих странах, его создание стоит дорого, а получение исходного материала для него возможно только при родах. С другой стороны, банк ИПСК составляет ему перспективную альтернативу, поскольку позволяет использовать клетки больных БА с различными фенотипами и мутациями и получать самообновляемую стабильную популяцию предшественников нейронов. Публичные банки фибробластов от пациентов с генетическими мутациями, ответственными за некоторые нейродегенеративные заболевания, уже существуют и позволяют проводить для задач персонализированной медицины категоризацию их спорадических и наследственных форм с различными мутациями и исследовать типичные фенотипы отдельных индивидов с уникальной генетической основой, выбирая возможные подходы к терапии.

ПОИСК ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ НА КЛЕТОЧНЫХ МОДЕЛЯХ БА, СОЗДАННЫХ НА ОСНОВЕ ИПСК

В настоящее время для применения в клинике БА рекомендовано очень небольшое количество препаратов, оказывающих симптоматический эффект. Современные лекарственные средства лечения БА сводятся к ингибированию ацетилхолинестеразы и усилению ХЭ-нейротрансмиссии в мозге. Эти средства могут улучшить когнитивные функции, поведение, функциональное и общее состояние пациента, переведя заболевание из средней в умеренную стадию, но отдаленные положительные результаты такой терапии практически отсутствуют. Технология ИПСК предоставляет уникальную возможность для поиска лекарств. Поскольку ИПСК сохраняют генотип пациента и позволяют воспроизвести БА in vitro, нейроны, полученные из ИПСК, специфичных для БА конкретного пациента, можно использовать для тестирования кандидатов в лекарственные средства, таких, например, как ингибиторы γ- и β-секретазы и антитела к Аβ. В экспериментах на моделях БА с использованием ИПСК от пациентов с БА, несущих мутации в PSEN1, PSEN2 и точечную мутацию в АРР, а также дупликацию АРР, показано снижение содержания Аβ-пептидов в нейронах из этих ИПСК, обработанных ингибитором γ-секретазы, антителами к Аβ и докозагексаеновой кислотой (ДГК). В нейронах под воздействием ингибитора β-секретазы снижались уровни фосфорилированного тау и GSK-3β. Нестероидное противовоспалительное средство (NSAID) сулиндак сульфид может определить новую стратегию в лечении БА, так как ингибирует продукцию Аβ в нейронах из ИПСК [70]. В нейронах, дифференцированных из ИПСК и экспрессирующих дикий тип PSEN1, снижался уровень Аβ42. В то же время в клетках, несущих в PSEN1 мутацию L166P, терапевтический эффект отсутствовал [71].

Использование ИПСК в сочетании с высокопроизводительным и мультипараметрическим скринингами (High-Throughput Screening, HTS, и High Content Screening, HCS, соответственно) позволяет быстро анализировать эффективность и токсичность лекарственных средств и обнаруживать на клеточном уровне признаки заболевания, например, такие как повышение содержания Аβ-пептидов или фосфорилированного тау. Предварительное применение метода высокопроизводительного скрининга исключает дорогостоящие и требующие длительного времени доклинические испытания на животных и уменьшает число неудачных клинических испытаний. После выбора лекарства или их идентификации с помощью HTS, для последующего анализ путей внутриклеточной сигнализации используют HCS [2]. Высокоэффективный скрининг на основе ИПСК-технологии может в перспективе стать рутинным методом поиска новых лекарственных средств.

Одно из важных преимуществ ИПСК-технологии перед экспериментами на животных заключается в том, что она представляет собой модель, специфическую для человека. Так, взаимосвязь между повышенным соотношением Aβ42/Aβ40 и прогрессированием деменции может послужить основой платформы для будущих открытий новых лекарств для терапии БА. Например, показано, что ингибиторы γ-секретазы снижают общий уровень Aβ и уменьшают Aβ42/Aβ40, а ингибиторы β-секретазы не только снижают уровень Aβ, но и напрямую влияют на активность киназы GSK3β и фосфорилирование тау. Прямое ингибирование GSK3β, которое сопровождается активацией сигнального пути Wnt, снижает уровень фосфорилированного тау, не влияя на аккумуляцию Aβ [43]. Сходным действием на тау обладают фталиды, которые наряду с этим уменьшают содержание Aβ в нейронах из ИПСК от пациентов с Даун-синдромом [25]. Длительная обработка ингибитором β-секретазы в трехмерной модели ИПСК препятствует накоплению фосфорилированного тау и Aβ [58]. При скрининге лекарственных препаратов показано, что специфический ингибитор Aβ42, а также нестероидные противовоспалительные средства (NSAIDs) уменьшают соотношение Aβ42/Aβ40 в нейронах, дифференцированных из ИПСК от пациентов с НБА, хотя некоторые PSEN1-мутации не устраняются NSAIDs [14, 70]. Эти исследования указывают на перспективность использования нейрональной платформы на основе ИПСК для скрининга лекарственных препаратов в клинике БА. Однако следует принимать во внимание, что эксперименты in vitro не позволяют определить побочные эффекты этих препаратов и их проходимость через гемато-энцефалический барьер.

На моделях НБА и СБА, создаваемых на основе ИПСК-технологии, тестируются новые лекарственные средства, направленные на коррекцию амилоидного каскада, АРР-процессинга, стресса ЭПР. Некоторые из них обладают высокой эффективностью на клеточных моделях и могут в будущем оказаться перспективными в лечении пациентов с БА. Первыми на ИПСК и нейронах, несущими мутации А246Е на PSEN1 и N141I на PSEN2, были скринированы ингибиторы γ-секретазы [14]. В присутствии одного из них, соединения Е, в нейронах от пациентов с НБА быстро и дозозависимо снижались уровни Aβ42 и Aβ40. Уровень другого субстрата γ-секретазы, внутриклеточного домена Notch, также дозозависимо снижался под воздействием ингибитора, свидетельствуя о том, что нейроны из ИПСК, содержащих мутации PSEN1 и PSEN2, реагируют на обработку ингибиторами фермента. При обработке другим ингибитором γ-секретазы, DAPV717IT (5 мкМ в течение 48 ч), в нейронах от пациентов с НБА с мутацией V717I в АРР замедлялась продукция Aβ38, 40 и 42 [22]. В этих нейронах антитела к Aβ, которые связывают и секвестрируют Aβ-пептиды, препятствовали повышению общего уровня тау, свидетельствуя о взаимосвязи между амилоидным каскадом и гиперфосфорилированием тау в мозге пациентов с БА. Однако в условиях клиники, несмотря на то, что эти антитела способствовали снижению уровня Aβ-пептидов, они не препятствовали прогрессированию когнитивных нарушений. Показано, что ДГК в астроцитах при ишемии in vitro облегчает стресс ЭПР и тормозит генерацию АФК [72].

В нейронах из ИПСК с мутацией E693Δ в АРР ДГК значительно снижала содержание BiP-белка и пероксиредоксина-4, расщепляла каспазу-4, снижала продукцию АФК и маркеров окислительного стресса, ослабляла стресс ЭПР. В результате эти нейроны переживали значительно дольше контрольных и нейронов от пациентов с СБА [21]. В то же время, содержание Aβ-олигомеров, запускающих ЭПР- и окислительный стресс, не изменялось, поэтому ДКГ может лишь облегчать симптоматику, но не является профилактическим и эффективным лечебным средством. Тем не менее, приведенные результаты свидетельствуют о том, что модели БА на основе ИПСК открывают возможность выбора стратегии лечения специфических геномных нарушений.

В одной из последних работ [73] на культурах нейронов почти 100%-ной чистоты, полученных из ИПСК от 13 пациентов с НБА и СБА, с целью снижения уровня и степени кластеризации Aβ были скринированы новые соединения и получены стабильные и воспроизводимые результаты. Для усиления защитного действия из множества тестированных соединений было выбрано 6 наиболее эффективных и из трех из них (бромокриптина, кромолина и топирамата) составлен коктейль, который оказывал выраженный анти-Aβ-эффект.

Корковые нейроны, дифференцированные из ИПСК, были использованы для исследования биохимических механизмов, опосредующих изменения в соотношении Aβ42/Aβ40. Ранее было показано, что мутация A673T в гене APP приводит к пониженному образованию Aβ в мозге и значительно снижает риск БА по сравнению с риском в общей популяции [74]. В экспериментах с ИПСК и их изогенными контрольными клетками обнаружено, что эта мутация снижает эффективность расщепления АРР β-секретазой, с последующим нарушением способности Aβ формировать агрегаты [75], что говорит в пользу его важной роли в патогенезе БА. С другой стороны, в нейронах из ИПСК мутация V7171 в АРР повышала вероятность его более активного расщепления β-секретазой, по сравнению с α-секретазой, и, следовательно, возможность его аккумуляции [22]. В этих клетках блокирование антител к Аβ предотвращало ассоциированное с внеклеточным Аβ патологическое тау-фосфорилирование.

Мутации в АРР, в отличие от мутаций в PSEN1, непосредственно приводили к повышению общего уровня и фосфорилирования тау в нейронах, полученных из ИПСК [47]. При длительной модуляции γ-секретазы эти процессы становятся обратимыми, что указывает на возможность влияния процессинга АРР на тау независимо от Аβ. Использование технологии редактирования генома в ИПСК выявило, что мутации в Δ-экзоне 9 (ΔE9) у PSEN1 снижает активность γ-секретазы, что сопровождается аккумуляцией интактных С-концевых фрагментов АРР и измененным соотношением Aβ42/Aβ40 [76].

Показано аберрантное набухание первичных эндосом в соме нейронов от больных БА. Позднее было обнаружено накопление Аβ в ЭПР и эндосомальных и лизосомальных компартментах, что приводило к стрессу ЭПР и его повреждению реактивными формами кислорода [21, 22]. Эти данные указывают на важную роль внутриклеточного Аβ, как модулятора заболевания, и эндосом, как центральных компартментов протеолиза АРР. Сходные нарушения внутриклеточных сигнальных путей были выявлены у нейронов от пациентов с СБА. Наблюдались ингибирование реакции несвернутых белков, оксидативное повреждение и активация путей клеточной гибели, общих для других нейродегенеративных заболеваний, на фоне индукции Wnt-сигнального пути [21]. В то же время сформированные ранее агрегаты Аβ при ингибировании β-секретазы распадались, что свидетельствует о не известной ранее способности клеток самостоятельно избавляться от агрегированного Аβ. Такая особенность может иметь важное значение для выяснения способности ингибиторов β-секретазы индуцировать обратимость реакции клеток на стрессовые воздействия и расширения представлений о механизмах патогенеза и способах лечения БА.

Обнаружено, что нейральные предшественники из ИПСК от пациентов с НБА содержат ряд дифференциально экспрессированных генов, отсутствующих в предшественниках от здоровых индивидов. Пять таких генов были найдены посмертно в мозге пациентов с БА. Это сходство указывает на адекватность моделей БА in vitro, а также помогают выявить молекулярные пути, лежащие в основе патологических процессов в нейронах до их старения. В один из этих путей (Wnt-сигнализация) вовлечен норрин, белок, экспрессируемый мюллеровской глией, мутация в гене которого тормозит нейрогенез в головном мозге при БА [20].

РЕДАКТИРОВАНИЕ ГЕНОМА И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ПОДХОДЫ К НЕЙРОТРАНСПЛАНТАЦИИ ПРИ БА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИПСК

Клеточная заместительная терапия БА предполагает трансплантацию в мозг пациентов нейронов или их предшественников, дифференцированных из ИПСК, полученных от этих пациентов. Естественно, что эти клетки несут патологические мутации, присущие фенотипу БА конкретного пациента. Для того, чтобы трансплантируемые клетки были лишены этих мутаций, т.е. стали изогенными, геном этих клеток должен быть отредактирован.

В настоящее время широко используется недавно разработанная система CRISPR–Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPR-associated protein 9), позволяющая последовательно и специфически проводить генетическую коррекцию в клеточных линиях, органах и целом организме, а также создавать модели генетических заболеваний человека и их новые модели на животных, наблюдая динамические биопроцессы при БА [77].

С использованием системы CRISPR/cas9 оказалась возможной коррекция аутосомно-доминантных мутаций в генах PSEN1 и PSEN2 в нейронах из ИПСК пациентов с НБА. Так, в базальных холинергических нейронах, дифференцированных из ИПСК пациента с НБА, была скорректирована мутация N141I в гене PSEN2, что привело к нормализации у этих нейронов соотношения Aβ42/40 и восстановлению максимального количества спайков и их амплитуд, близких к регистрируемым в контроле [78, 79]. Ранее была показана возможность коррекции с помощью системы CRISPR/cas мутаций A79V и L150P в гене PSEN1 в ИПСК пациента с НБА. Для коррекции точечных мутаций A79V [80] и L150P [81] они были заменены точечными мутациями с последовательностями дикого типа.

ИПСК, полученные из собственных соматических клеток пациентов, могут обеспечить достаточное количество материала для трансплантации с целью клеточной заместительной терапии, не вызывающей иммунной реакции и не связанной с этическими проблемами, существующими при использовании ЭСК, и обладают высоким потенциалом для клеточной трансплантационной терапии нейродегенеративных заболеваний. Предназначенные для трансплантации нейральные клетки-предшественники (НКП), полученные из ИПСК, после редактирования генома можно дифференцировать в нейроны, астроциты или олигодендроциты, с перспективой клеточной заместительной терапии при различных нейродегенеративных заболеваниях (в том числе, БА), или при их моделировании на животных [82].

В одной из работ [83] для получения ИПСК, не обладающих туморогенными свойствами, фибробласты кожи мышей были обработаны белковыми экстрактами эмбриональных стволовых клеток. Эти ИПСК (т.н. “protein-ИПСК”), дифференцированные в глиальные клетки, при нейротрансплантации препятствовали формированию депозитов из амилоидных бляшек в мозге трансгенных мышей 5xFAD с моделью БА. Кроме того, трансплантированные protein-ИПСК улучшали у этих животных когнитивные функции. Протеомный анализ обнаружил вызванное трансплантацией усиление экспрессии генов, свойственных олигодендроцитам, что создает новое представление о потенциальных возможностях protein-ИПСК и перспективе их терапевтического использования при БА.

Как сказано выше, одними из основных признаков БА является падение активности холинергических нейронов (ХЕН) и продукции ими ацетилхолина (АХ), что сопровождается снижением модуляции α7-никотиновых АХ-рецепторов. К гистопатологическим изменениям в мозге человека при БА относят массивную нейрональную дегенерацию в базальных ядрах, которая приводит к дефициту АХ в новой коре и гиппокампе, возрастающему по мере усиления тяжести заболевания. Трансплантация ХEН из нейральных стволовых клеток, активно экспрессирующих холин ацетилтрансферазу (ХАТ), в мозг животных с моделью БА нормализовало их поведение в лабиринте Морриса, указывая на улучшение когнитивных функций при БА под влиянием ХАТ [84].

У PDAPP-трансгенных мышей с моделью БА по мере увеличения возраста до 5 мес. в мозге формировались депозиты Аβ и происходило прогрессивное нарушение пространственной памяти. В гиппокамп этих мышей билатерально трансплантировали предшественники нейронов холинергического фенотипа, дифференцированные из ИПСК человека. После трансплантации показатели пространственной памяти в течение 8 нед. значительно улучшались, причем уже через 45 дней в гиппокампе обнаруживались ХЕН человека, позитивные по ХАТ, а в них – пузырьки с ГАМК-транспортером [85].

Эти нейроны, а также клетки, позитивные по α7 никотиновому ацетилхолиновому рецептору (α7nAChR), в значительном количестве были диффузно распределены по новой коре реципиента. Кроме того, трансплантированные нейроны человека и нейроны реципиента, позитивные по везикулярному ГАМК-транспортеру (VGAT), локализовались в основном в гиппокампе и в незначительном количестве – в новой коре, а число нейронов, позитивных по ГАМК-рецептору (GABAR), после трансплантации возрастало. Нейроны, позитивные по α7nAChR и GABAR, экспрессировали фосфорилированную протеинкиназу Akt и c-fos-протеин, указывая на возможную активацию GABAR-позитивных нейронов нейромедиаторами, секретируемыми тансплантированными клетками, которые могут формировать с нейронами хозяина положительную обратную связь, опосредуемую секрецией нейромедиатора в коре головного мозга и гиппокампе и приводящую к снижению когнитивной дисфункции у мышей с моделью БА [86].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Разработка технологии ИПСК позволила значительно расширить перспективу моделирования, исследования механизмов патогенеза и поиска способов фармакологической коррекции хронических нейродегенеративных заболеваний, в том числе, БА. Анализ in vitro различных типов пациент-специфических клеток, релевантных заболеванию, дает возможность наиболее эффективно адаптировать эксперимент к их конкретным функциональным свойствам и выявить участие каждого типа клеток в патогенезе БА. Получение нейронов из ИПСК от пациентов с НБА и СБА позволяет анализировать специфический для каждого пациента генетический фон экспрессии генов и ее фенотипические последствия. Раскрытие на основе технологии ИПСК механизмов возникновения известных генетических мутаций, ассоциируемых с БА, способствует получению новых лекарственных препаратов. Применение технологии ИПСК в нейротрансплантации создает уникальную перспективу персонализированной клеточной заместительной терапии БА.

БЛАГОДАРНОСТИ

Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда (грант № 14-15-0147-П).

Список литературы

  1. Devineni A., Tohme S., Kody M.T., Cowley R.A., Harris B.T. Am. // J. Stem Cells. 2016. V. 5. P. 99–106.

  2. Zhang W., Jiao B., Zhou M., Zhou T., Shen L. // Stem Cells Int. 2016. V. 2016. P. 7828049.

  3. Selkoe D.J. // Science. 2002. V. 298. P. 789–791.

  4. Goldstein L.S. // Prog. Neurobiol. 2012. V. 99. P. 186–190.

  5. Pen A.E., Jensen U.B. // Acta Neurol. Scand. 2017. V. 135. P. 57–72.

  6. Sullivan S.E., Young-Pearse T.L. // Brain Res. 2017. V. 1656. P. 98–106.

  7. Mann D.M. // Neurodegeneration. 1996. V. 5. P. 423–427.

  8. Francis P.T., Palmer A.M., Snape M., Wilcock G.K. // J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. 1999. V. 66. P. 137–147.

  9. Takasugi N., Tomita T., Hayashi I., Kim S.H., Nestor M.W., Navarro-Sobrino M., Santa-Maria I., Zimmer M., Aubry S., Steele J.W., Kahler D.J., Dranovsky A., Arancio O., Crary J.F., Gandy S., Noggle S.A. // Nature. 2003. V. 422. P. 438–441.

  10. Israel M.A., Yuan S.H., Bardy C., Reyna S.M., Mu Y., Herrera C., Hefferan M.P., Van Gorp S., Nazor K.L., Boscolo F.S., Carson C.T., Laurent L.C., Marsala M., Gage F.H., Remes A.M., Koo E.H., Goldstein L.S. // Nature. 2012. V. 482. P. 216–220.

  11. Avramopoulos D. // Genome Med. 2009. V. 1. 3:34.

  12. Prokop S., Miller K.R., Heppner F.L. // Acta Neuropathol. 2013. V. 126. P. 461–477.

  13. Yang J., Li S., He X.B., Cheng C., Le W. // Mol. Neurodegener. 2016. V. 11. P. 39.

  14. Yagi T., Ito D., Okada Y., Akamatsu W., Nihei Y., Yoshizaki T., Yamanaka S., Okano H., Suzuki N. // Hum. Mol. Genet. 2011. V. 20. P. 4530–4539.

  15. Doi D., Samata B., Katsukawa M., Kikuchi T., Morizane A., Ono Y., Sekiguchi K., Nakagawa M., Parmar M., Takahashi J. // Stem Cell Reports. 2014. V. 2. P. 337–350.

  16. Dimos J.T., Rodolfa K.T., Niakan K.K., Weisenthal L.M., Mitsumoto H., Chung W., Croft G.F., Saphier G., Leibel R., Goland R., Wichterle H., Henderson C.E., Eggan K. // Science. 2008. V. 321. P. 1218–1221.

  17. Yuan S.H., Martin J., Elia J., Flippin J., Paramban R.I., Hefferan M.P., Vidal J.G., Mu Y., Killian R.L., Israel M.A., Emre N., Marsala S., Marsala M., Gage F.H., Goldstein L.S., Carson C.T. // PLoS One. 2011. V. 6. e17540.

  18. Takahashi K., Yamanaka S. // Cell. 2006. V. 126. P. 663–676.

  19. Hunsberger J.G., Rao M., Kurtzberg J. // Lancet Neurol. 2016. V. 15. P. 219–230.

  20. Sproul A.A., Jacob S., Pre D., Kim S.H., Nestor M.W., Navarro-Sobrino M., Santa-Maria I., Zimmer M., Aubry S., Steele J.W., Kahler D.J., Dranovsky A., Arancio O., Crary J.F., Gandy S., Noggle S.A. // PLoS One. 2014. V. 9. e84547.

  21. Kondo T., Asai M., Tsukita K., Kutoku Y., Ohsawa Y., Sunada Y., Imamura K., Egawa N., Yahata N., Okita K., Takahashi K., Asaka I., Aoi T., Watanabe A., Watanabe K., Kadoya C., Nakano R., Watanabe D., Maruyama K., Hori O., Hibino S., Choshi T., Nakahata T., Hioki H., Kaneko T., Naitoh M., Yoshikawa K., Yamawaki S., Suzuki S., Hata R., Ueno S., Seki T., Kobayashi K., Toda T., Murakami K., Irie K., Klein W.L., Mori H., Asada T., Takahashi R., Iwata N., Yamanaka S., Inoue H. // Cell Stem Cell. 2013. V. 12. P. 487–496.

  22. Muratore C.R., Rice H.C., Srikanth P., Callahan D.G., Shin T., Benjamin L.N., Walsh D.M., Selkoe D.J., Young-Pearse T.L. // Hum. Mol. Genet. 2014. V. 23. P. 3523–3536.

  23. Hardy J.A., Higgins G.A. // Science. 1992. V. 256. P. 184–185.

  24. Duan L., Bhattacharyya B.J., Belmadani A., Pan L., Miller R.J., Kessler J.A. // Mol. Neurodegener. 2014. V. 9. P. 3.

  25. Chang C.Y., Chen S.M., Lu H.E., Lai S.M., Lai P.S., Shen P.W., Chen P.Y., Shen C.I., Harn H.J., Lin S.Z., Hwang S.M., Su H.L. // Sci. Rep. 2015. V. 5. P. 8744.

  26. Tong L.M., Fong H., Huang Y. // Exp. Mol. Med. 2015. V. 47. e151.

  27. Xia D., Watanabe H., Wu B., Lee S.H., Li Y., Tsvetkov E., Bolshakov V.Y., Shen J., Kelleher R.J. // Neuron. 2015. V. 85. P. 967–981.

  28. Tomiyama T., Matsuyama S., Iso H., Umeda T., Takuma H., Ohnishi K., Ishibashi K., Teraoka R., Sakama N., Yamashita T., Nishitsuji K., Ito K., Shimada H., Lambert M.P, Klein W.L., Mori H.J. // Neurosci. 2010. V. 30. P. 4845–4856.

  29. Vazin T., Ball K.A., Lu H., Ataeijannati Y., Head-Gordon T., Poo M.M., Schaffer D.V. // Neurobiol. Dis. 2014. V. 62. P. 62–72.

  30. Nieweg K., Andreyeva A., van Stegen B., Tanriöver G., Gottmann K. // Cell Death Dis. 2015. V. 6. e1709.

  31. Kuo Y.-M., Emmerling M.R., Lampert H.C., Hempelman S.R., Kokjohn T.A., Woods A.S., Cotter R.J., Roher A.E. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999. V. 257. P. 787–791.

  32. Bergström P., Agholme L., Nazir F.H., Satir T.M., Toombs J., Wellington H., Strandberg J., Bontell T.O., Kvartsberg H., Holmström M., Boreström C., Simonsson S., Kunath T., Lindahl A., Blennow K., Hanse E., Portelius E., Wray S., Zetterberg H. // Sci. Rep. 2016. V. 6. P. 29200.

  33. Nicholas C.R., Chen J., Tang Y., Southwell D.G., Chalmers N., Vogt D., Arnold C.M., Chen Y.J., Stanley E.G, Elefanty A.G., Sasai Y., Alvarez-Buylla A., Rubenstein J.L., Kriegstein A.R. // Cell Stem Cell. 2013. V. 12. P. 573–586.

  34. Iovino M., Agathou S., González-Rueda A., Del Castillo Velasco-Herrera M., Borroni B., Alberici A., Lynch T., O’Dowd S., Geti I., Gaffney D., Vallier L., Paulsen O., Káradóttir R.T., Spillantini M.G. // Brain. 2015. V. 138 (Pt 11). P. 3345–3359.

  35. Livesey R. J. // Alzheimer’s Assoc. 2012. V. 8. № 4. P. 724.

  36. Kikuchi T., Morizane A., Doi D., Onoe H., Hayashi T., Kawasaki T., Saiki H., Miyamoto S., Takahashi J. // J. Parkinsons Dis. 2011. V. 1. P. 395–412.

  37. Hallett P.J., Deleidi M., Astradsson A., Smith G.A., Cooper O., Osborn T.M., Sundberg M., Moore M.A., Perez-Torres E., Brownell A.L., Schumacher J.M., Spealman R.D., Isacson O. // Cell Stem Cell. 2015. V. 16. P. 269–274.

  38. Espuny-Camacho I., Michelsen K.A., Gall D., Bilheu A., Acosta-Verdugo S., Herpoel A., Giugliano M., Gaillard A., Vanderhaeghen P. // Neuron. 2013. V. 77. P. 440–456.

  39. Espuny-Camacho I., Arranz A.M., Fiers M., Snellinx A., Ando K., Munck S., Bonnefont J., Lambot L., Corthout N., Omodho L., Vanden Eynden E., Radaelli E., Tesseur I., Wray S., Ebneth A., Hardy J., Leroy K., Brion J.P., Vanderhaeghen P., De Strooper B. // Neuron. 2017. V. 93. P. 1066–1081.

  40. Imamura K., Sahara N., Kanaan N.M., Tsukita K., Kondo T, Kutoku Y., Ohsawa Y, Sunada Y., Kawakami K., Hotta A., Yawata S., Watanabe D., Hasegawa M., Trojanowski J.Q., Lee V.M., Suhara T., Higuchi M., Inoue H. // Sci. Rep. 2016. V. 6. P. 34904.

  41. Iovino M., Agathou S., González-Rueda A., Del Castillo Velasco-Herrera M., Borroni B., Alberici A., Lynch T., O’Dowd S., Geti I., Gaffney D., Vallier L., Paulsen O., Káradóttir R.T., Spillantini M.G. // Brain. 2015. V. 138 (Pt 11). P. 3345–3359.

  42. Verheyen A., Diels A., Dijkmans J., Oyelami T., Meneghello G., Mertens L., Versweyveld S., Borgers M., Buist A., Peeters P., Cik M. // PLoS One. 2015. V. 10. e0146127.

  43. Choi S.H., Kim Y.H., Hebisch M., Sliwinski C., Lee S., D’Avanzo C., Chen H., Hooli B., Asselin C., Muffat J., Klee J.B., Zhang C., Wainger B.J., Peitz M., Kovacs D.M., Woolf C.J., Wagner S.L., Tanzi R.E., Kim D.Y. // Nature. 2014. V. 515. P. 274–278.

  44. Kara E., Ling H., Pittman A.M., Shaw K., de Silva R., Simone R, Holton J.L, Warren J.D., Rohrer J.D., Xiromerisiou G., Lees A., Hardy J., Houlden H., Revesz T. // Neurobiol. Aging. 2012. V. 33. P. 2231.

  45. Silva M.C., Cheng C., Mair W., Almeida S., Fong H., Biswas M.H.U., Zhang Z., Huang Y., Temple S., Coppola G., Geschwind D.H., Karydas A., Miller B.L., Kosik K.S., Gao F.B., Steen J.A., Haggarty S.J. // Stem Cell Rep. 2016. V. 7. P. 325–340.

  46. Biswas M.H.U., Almeida S., Lopez-Gonzalez R., Mao W., Zhang Z., Karydas A., Geschwind M.D., Biernat J., Mandelkow E.M., Futai K., Miller B.L., Gao F.B. // Stem Cell Rep. 2016. V. 7. P. 316–324.

  47. Moore S., Evans L.D.B., Andersson T., Portelius E., Smith J., Dias T.B., Saurat N., McGlade A., Kirwan P., Blennow K., Hardy J., Zetterberg H., Livesey F.J. // Cell Rep. 2015. V. 11. P. 689–696.

  48. Spires T.L., Orne J.D., SantaCruz K., Pitstick R., Carlson G.A., Ashe K.H., Hyman B.T. // Am. J. Pathol. 2006. V. 168. P. 1598–1607.

  49. Roberson E.D., Scearce-Levie K., Palop J.J., Yan F., Cheng I.H., Wu T., Gerstein H., Yu G.Q., Mucke L. // Science. 2007. V. 316. P. 750–754.

  50. Guerreiro R., Wojtas A., Bras J., Carrasquillo M., Rogaeva E., Majounie E., Cruchaga C., Sassi C., Kauwe J.S., Younkin S., Hazrati L., Collinge J., Pocock J., Lashley T., Williams J., Lambert J.C., Amouyel P., Goate A., Rademakers R., Morgan K., Powell J., St George-Hyslop P., Singleton A., Hardy J.; Alzheimer Genetic Analysis Group. // N. Engl. J. Med. 2013. V. 368. P. 117–127.

  51. Abud E.M., Ramirez R.N., Martinez E.S., Healy L.M., Nguyen C.H.H., Newman S.A., Yeromin A.V., Scarfone V.M., Marsh S.E., Fimbres C., Caraway C.A., Fote G.M., Madany A.M., Agrawal A., Kayed R., Gylys K.H., Cahalan M.D., Cummings B.J., Antel J.P., Mortazavi A., Carson M.J., Poon W.W., Blurton-Jones M. // Neuron. 2017. V. 94. P. 278–293.

  52. Usenovic M., Niroomand S., Drolet R.E., Yao L., Gaspar R.C., Hatcher N.G., Schachter J., Renger J.J., Parmentier-Batteur S. // J. Neurosci. 2015. V. 35. P. 14234–14250.

  53. Wu J.W., Hussaini S.A., Bastille I.M., Rodriguez G.A., Mrejeru A., Rilett K., Sanders D.W., Cook C., Fu H., Boonen R.A., Herman M., Nahmani E., Emrani S., Figueroa Y.H., Diamond M.I., Clelland C.L., Wray S., Duff K.E. // Nat. Neurosci. 2016. V. 19. P. 1085–1092.

  54. Lee H.-K., Velazquez Sanchez C., Chen M., Morin P.J., Wells J.M., Hanlon E.B., Xia W. // PLoS One. 2016. V. 11. e0163072.

  55. Jorfi M., D’Avanzo C., Tanzi R.E., Kim D.Y., Irimia D. // Sci. Rep. 2018. V. 8. P. 2450.

  56. Centeno E.G.Z., Cimarosti H., Bithell A. // Mol. Neurodegener. 2018. V. 13. №1. P. 27.

  57. Kim Y.H., Choi S.H., D’Avanzo C., Hebisch M., Sliwinski C., Bylykbashi E., Washicosky K.J., Klee J.B., Brüstle O., Tanzi R.E., Kim D.Y. // Nat. Protoc. 2015. V. 10. P. 985–1006.

  58. Raja W.K., Mungenast A.E., Lin Y.-T., Ko T., Abdurrob F., Seo J., Tsai L.H. // PLoS One. 2016. V. 11. e0161969.

  59. Zhang D., Pekkanen-Mattila M., Shahsavani M., Falk A., Teixeira A.I., Herland A. // Biomaterials. 2014. V. 35. P. 1420–1428.

  60. Hanger D.P, Anderton B.H., Noble W. // Trends Mol. Med. 2009. V. 15. P. 112–119.

  61. Sposito T., Preza E., Mahoney C.J., Setó-Salvia N., Ryan N.S., Morris H.R., Arber C., Devine M.J., Houlden H., Warner T.T., Bushell T.J., Zagnoni M., Kunath T., Livesey F.J., Fox N.C., Rossor M.N., Hardy J., Wray S. // Hum. Mol. Genet. 2015. V. 24. P. 5260–5269.

  62. Qi Y., Zhang X.-J., Renier N., Wu Z., Atkin T., Sun Z., Ozair M.Z., Tchieu J., Zimmer B., Fattahi F., Ganat Y., Azevedo R., Zeltner N., Brivanlou A.H., Karayiorgou M., Gogos J., Tomishima M., Tessier-Lavigne M., Shi S.H., Studer L. // Nat. Biotechnol. 2017. V. 35. P. 154–163.

  63. Solito E., Sastre M. // Front. Pharmacol. 2012. V. 3. P. 14.

  64. Chen H., Qian K., Du Z., Cao J., Petersen A., Liu H., Blackbourn L.W., Huang C.L., Errigo A., Yin Y., Lu J., Ayala M., Zhang S.C. // Cell Stem Cell. 2014. V. 14. P. 796–809.

  65. Chen S., Sanjana N.E., Zheng K., Shalem O., Lee K., Shi X., Scott D.A., Song J., Pan J.Q., Weissleder R., Lee H., Zhang F., Sharp P.A. // Cell. 2015. V. 160. P. 1246–1260.

  66. Arber C., Lovejoy C., Wray S. // Alzheimers Res. Ther. 2017. V. 9. № 1. P. 42.

  67. Miller J.D., Ganat Y.M., Kishinevsky S., Bowman R.L., Liu B., Tu E.Y., Mandal P.K., Vera E., Shim J.W., Kriks S., Taldone T., Fusaki N., Tomishima M.J., Krainc D., Milner T.A., Rossi P.D.J., Studer L. // Cell Stem Cell. 2013. V. 13. P. 691–705.

  68. Mertens J., Paquola A.C.M., Ku M., Hatch E., Böhnke L., Ladjevardi S., McGrath S., Campbell B., Lee H., Herdy J.R., Gonçalves J.T., Toda T., Kim Y., Winkler J., Yao J., Hetzer M.W., Gage F.H. // Cell Stem Cell. 2015. V. 17. P. 705–718.

  69. Vera E., Bosco N., Studer L. // Cell Rep. 2016. V. 17. P. 1184–1192.

  70. Yahata N., Asai M., Kitaoka S., Takahashi K., Asaka I., Hioki H., Kaneko T., Maruyama K., Saido T.C., Nakahata T., Asada T., Yamanaka S., Iwata N., Inoue H. // PLoS One. 2011. V. 6. e25788.

  71. Koch P., Tamboli I. Y., Mertens J., Wunderlich P., Ladewig J., Stüber K., Esselmann H., Wiltfang J., Brüstle O., Walter J. // Am. J. Pathol. 2012. V. 180. P. 2404–2416.

  72. Begum G., Kintner D., Liu Y., Cramer S.W., Sun D. // JNeurochem. 2012. V. 120. P. 622–630.

  73. Kondo T., Imamura K., Funayama M., Tsukita K., Miyake M., Ohta A., Woltjen K., Nakagawa M., Asada T., Arai T., Kawakatsu S., Izumi Y., Kaji R., Iwata N., Inoue H. // Cell Rep. 2017. V. 21. P. 2304–2312.

  74. Jonsson T., Atwal J.K., Steinberg S., Snaedal J., Jonsson P.V., Bjornsson S., Stefansson H., Sulem P., Gudbjartsson D., Maloney J., Hoyte K., Gustafson A., Liu Y., Lu Y., Bhangale T., Graham R.R., Huttenlocher J., Bjornsdottir G., Andreassen O.A., Jönsson E.G., Palotie A., Behrens T.W., Magnusson O.T., Kong A., Thorsteinsdottir U., Watts R.J., Stefansson K. // Nature. 2012. V. 488. P. 96–99.

  75. Maloney J.A., Bainbridge T., Gustafson A., Zhang S., Kyauk R., Steiner P., van der Brug M., Liu Y., Ernst J.A., Watts R.J., Atwal J.K. // J. Biol. Chem. 2014. V. 289. P. 30990–31000.

  76. Woodruff G., Young J.E., Martinez F.J., Buen F., Gore A., Kinaga J., Li Z., Yuan S.H., Zhang K., Goldstein L.S. // Cell Rep. 2013. V. 5. P. 974–985.

  77. Giau V.V., Lee H., Shim K.H., Bagyinszky E., An S.S.A. // Clin. Interv. Aging. 2018. V. 13. P. 221–233.

  78. Ortiz-Virumbrales M., Moreno C.L., Kruglikov I., Marazuela P., Sproul A., Jacob S., Zimmer M., Paull D., Zhang B., Schadt E.E., Ehrlich M.E., Tanzi R.E., Arancio O., Noggle S., Gandy S. // Acta Neuropathol. Commun. 2017. V. 5. P. 77.

  79. Rohn T.T., Kim N., Isho N.F., Mack J.M. // J. Alzheimers Dis. Parkinsonism. 2018. V. 8. pii 439.

  80. Pires C., Schmid B., Petræus C., Poon A., Nimsanor N., Nielsen T.T., Waldemar G., Hjermind L.E., Nielsen J.E., Hyttel P., Freude K.K. // Stem Cell Res. 2016. V. 17. P. 285–288.

  81. Poon A., Schmid B., Pires C., Nielsen T.T., Hjermind L.E., Nielsen J.E., Holst B., Hyttel P., Freude K.K. // Stem Cell Res. 2016. V. 17. P. 466–469.

  82. Sareen D., Gowing G., Sahabian A., Staggenborg K., Paradis R., Avalos P., Latter J., Ornelas L., Garcia L., Svendsen C.N. // J. Comp. Neurol. 2014. V. 522. P. 2707–2728.

  83. Cha M.Y., Kwon Y.W., Ahn H.S., Jeong H., Lee Y.Y., Moon M., Baik S.H., Kim D.K., Song H., Yi E.C., Hwang D., Kim H.S., Mook-Jung I. // Stem Cells Transl. Med. 2017. V. 6. P. 293–305

  84. Suzuki N., Shimizu J., Fujiwara N., Arimitsu N.J. // Alzheimers Dis. Parkinsonism. 2016. V. 6. P. 219.

  85. Fujiwara N., Shimizu J., Takai K., Arimitsu N., Saito A., Kono T., Umehara T., Ueda Y., Wakisaka S., Suzuki T., Suzuki N. // Neurosci. Lett. 2013. V. 557. Pt B. P. 129–134.

  86. Fujiwara N., Shimizu J., Takai K., Arimitsu N., Ueda Y., Wakisaka S., Suzuki T., Suzuki N. // Exp. Neurol. 2015. V. 271. P. 423–431.

Дополнительные материалы отсутствуют.