Нейрохимия, 2020, T. 37, № 2, стр. 183-187

ВВЕДЕНИЕ

Среди белков мозга доля цитоскелетных белков является наибольшей. Одним из главных компонентов цитоскелета являются микротрубочки (МТ), в состав которых входит белок тубулин и ассоциируемые с ним белки.

Тубулин представляет собой димер из 2-х субъединиц: альфа и бета [1, 2]. Основным свойством альфа-, бета-димеров тубулина является их полимеризация в МТ, которые способны к деполимеризации. Эти два процесса находятся в динамическом равновесии [3, 4].

МТ, кроме цитоскелетной функции, выполняют и другие важные функции, а именно обеспечивают клеточную миграцию, образование новых синапсов, транспорт через аксоплазму белков, нейромедиаторов, фактора роста нервов и органелл, выброс нейромедиаторов, активность внутриклеточных ферментных систем, функции и экспрессию различных мембранных рецепторов, активность клеток иммунной системы [1, 3–5].

Повреждение микротубулярной системы может способствовать развитию широкой картины внутриклеточных нарушений, приводящих к развитию патологических процессов в клетке, что дает повод для изучения тубулина и МТ при различных заболеваниях, в том числе нервных и психических.

В настоящей работе проводилось сравнительное исследование связывания колхцина с тубулином в префронтальной (поле 10), лимбической (поле 23/24) и височной (поле 21) коре головного мозга в норме и при шизофрении. Известно, что тубулин связывается с митотическим ядом колхицином в эквимолярном соотношении и поэтому по связыванию с колхицином можно составить представление о количестве тубулина [6].

Цель исследования – определить уровень связывания колхицина (колхицинсвязывающую активность тубулина) в различных структурах головного мозга: префронтальной (поле 10), височной (поле 21), лимбической коре (поле 23/24) и таламусе – в норме и при шизофрении.

Выбранные области коры наиболее часто изучаются при шизофрении в связи с выявлением в них аномального функционирования некоторых биохимических систем [7–9]. Выбор таламуса обусловлен данными о нарушении его связей с корой головного мозга и структурным изменениям при шизофрении [10–12].

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В настоящем исследовании использовались образцы аутопсийного мозга из коллекции лаборатории нейрохимии ФГБНУ НЦПЗ, собранной на базе Психиатрической клинической больницы № 1 им. Н.А. Алексеева. У госпитализированных пациентов (n = 7) с хроническим течением заболевания шизофрения была диагностирована по критериям МКБ-10 при жизни F 20.0 (приступообразно-прогредиентная форма). В контрольную группу включались образцы аутопсийного мозга, полученные из московских больниц (отделений травматологии) от лиц без психических, неврологических и наркологических расстройств (n = 15). Не все зоны мозга от каждого испытуемого были доступны для анализа. В обеих группах причинами смерти были острая сердечно-сосудистая недостаточность или тромбоэмболия легочной артерии. Образцы коры мозга — префронтальной коры (поле 10), височной коры (поле 21), лимбической коры (поля 23/24) и таламуса выделяли по картам полей по Бродману при температуре 4°С и использовали для выделения тубулина.

Группа больных шизофренией состояла из 6 мужчин и 1 женщины в возрасте 42–76 лет (медиана 59 лет). Контрольную группу составляли 12 мужчин и 3 женщины без психической патологии в возрасте 46–90 лет (медиана 58 лет).

Колхицинсвязывающую активность тубулина определяли в обогащенных тубулином экстрактах белков из образцов структур мозга человека (проводилась однократная сборка–разборка) [13].

В полученных растворах тубулинового препарата измеряли концентрацию белка и разливали по аликвотам, которые замораживали в жидком азоте и хранили при –80°С.

Концентрацию белка определяли спектрофотометрическим методом Лоури с использованием набора реагентов Bio-Rad DC Protein Assay (США) и с использованием БСА в качестве белкового стандарта.

Колхицинсвязывающую активность тубулина определяли по методу Sherline [6] с небольшими модификациями как описано в статье [13] по следующей схеме:

1) 40 мкл ³H-колхицина (4.9 Кю/ммоль) Amersham (Англия) высушивали под струей газообразного азота и добавляли к нему 100 мкл свежеприготовленного 0.11 мМ водного раствора немеченного колхицина (фирма Sigma, С9754).

2) В пробирки разливали по 100 мкл 50 мM К-Na-фосфатного буферa /1 мМ MgCl₂, pH 6.7, затем добавляли в контрольную и стандартную пробирку 100 мкл того же буфера, а в тестируемые по 100 мкл белкового раствора в концентрации от 1.4 до 7 мг/мл в 50 мM К-Na-фосфатном буфере /1 мМ MgCl₂, pH 6.7

3) В каждую пробирку добавляли по 10 мкл смеси меченого и немеченого колхицина.

4) Пробирки инкубировали в течении 90 мин при 37°С.

5) После инкубации во все пробирки, кроме стандарта, добавляли 1 мл водно-угольной суспензии (3 мкг/мл) (активированный уголь, фирма Sigma, С9157) для остановки реакции. В пробирку со стандартом добавляли 1 мл деионизованной воды.

6) Пробы перемешивали и инкубировали в течении 20 мин при комнатной температуре.

7) Для осаждения угля растворы центрифугировали при 1200 g 30 мин при 4°С.

8) Из каждой пробирки отбирали по 100 мкл супернатанта и переносили во флакон с 4 мл сцинтилляционной жидкости.

9) Проводили измерение на счетчике 1211 Rackbeta (LKB, Швеция).

10) Связывание колхицина (в %) определяли по формуле:

Для статистической обработки данных использовался непараметрический анализ (поиск статистически значимых различий между группами – тест Манна–Уитни, корреляционный анализ – поиск ранговых корреляций и определение коэффициента корреляции Спирмена).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Величины связывания колхицина (в %) в префронтальной (поле 10), височной (поле 21), лимбической коре (поле 23/24) и в таламусе в норме и при шизофрении представлены на рис. 1. Можно видеть, что во всех исследуемых областях коры головного мозга при шизофрении в сравнении с контрольными случаями наблюдалось с высокой степенью достоверности снижение колхицинсвязывающей активности. В то же время в таламусе таких изменений не происходило – как в норме, так и при шизофрении колхицинсвязывающая активность оставалась низкой.

Рис. 1.

Колхицинсвязывающая активность в препаратах тубулина, выделенных из префронтальной (поле 10), височной (поле 21), лимбической коры (поле 23/24) и таламуса в контроле и у больных шизофренией. Данные представлены в процентах связывания меченого колхицина. Ромбы – префронтальная (поле 10), квадраты – височная (поле 21), круги – лимбическая кора (поле 23/24) и треугольники – таламус. Не закрашенные символы – контрольные случаи, закрашенные символы – больные шизофренией, горизонтальные черные линии – медианы для групп. Достоверные изменения между контрольной группой и группой больных шизофренией: * р < 0.05, ** р < 0.01.

Далее было проведено сравнение колхицинсвязывающей активности в исследуемых структурах мозга между собой как в контрольной группе, так и при шизофрении. Уровни достоверности, полученные при этом анализе, приведены в табл. 1.

В обеих группах колхицинсвязывающая активность в поле 10 и в поле 21, а также в поле 21 и в поле 23/24 между собой не различалась, в то же время активность в поле 10 достоверно отличалась от таковой в поле 23/24 только в контрольной группе. Как в контрольной группе, так и при шизофрении колхицинсвязывающая активность значительно снижена в таламусе по сравнению с этим показателем во всех исследуемых областях коры головного мозга.

ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование тубулина и МТ активно развивается при шизофрении: получены экспериментальные данные, указывающие на аномалии цитоскелета нервных клеток; выявлено изменение иммунореактивности ассоциированного с тубулином белка МАР-2; обнаружено, что дигидропироминидазы, входящие в семейство тубулин-ассоциированных белков, могут быть связаны с повышенным риском развития шизофрении; показано значительное снижение количества первичной цилии – органеллы с высоким содержанием МТ [14–17].

В настоящей работе исследовалось связывание колхицина с тубулином в различных структурах мозга в норме и при шизофрении.

Полученные результаты определения колхицинсвязывающей активности тубулина указывают на ее относительно равномерное распределение в исследованных областях коры в контрольной группе и при шизофрении, кроме выявления достоверных различий между полем 10 и полем 23/24 в контрольной группе, но не при шизофрении.

При сопоставлении колхицинсвязывающей активности тубулина в полях коры лиц контрольной группы и соответствующих полях коры больных шизофренией наблюдается ее достоверное снижение.

Выявленное уменьшение колхицинсвязывающей активности в областях коры при шизофрении не зависело от возраста, пола и постмортального интервала (ПМИ), так как сравниваемые группы были подобраны с учетом этих факторов. По данным литературы не выявлено значимых корреляций между возрастом и экспрессией белка для изоформ тубулина [2].

Ранее нами было показано, что психотропные препараты в терапевтических дозах не влияли на колхицинсвязывающую активность тубулина как in vitro, так и in vivo [13]. Moehle et al. [2] не обнаружили влияние антипсихотиков на экспрессию тубулина.

В таламусе колхицинсвязывающая активность в норме и при шизофрении остается на том же уровне, но при этом она ниже, чем в полях коры.

Так как колхицин связывается с тубулином в эквимолярном соотношении, то снижение колхицинсвязывающей активности, по-видимому, указывает на уменьшение количества тубулина. Однако, данные литературы об экспрессии тубулина в мозге при шизофрении весьма противоречивы.

В ряде работ показано не только снижение [14] уровня тубулина в отдельных структурах мозга при шизофрении, но и его увеличение [15]. Эти трудно сопоставимые результаты могут быть связаны с различиями в используемой коллекции структур мозга, в применяемых методах и методологическом подходе.

Результаты этих работ, как и нашего исследования, показывают, что экспрессия тубулина и его изоформ [16–18] может быть изменена в отдельных структурах мозга при шизофрении.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Показано уменьшение при шизофрении колхицинсвязывающей активности тубулина в префронтальной (поле 10), лимбической (поле 23/24) и височной (поле 21) коре головного мозга. Поскольку уровень связывания колхицина зависит от количества тубулина, то можно предположить, что и содержание тубулина в исследуемых областях коры снижено, что согласуется с данными литературы об изменении цитоскелета именно в этих регионах шизофрении [15, 19].