Нейрохимия, 2020, T. 37, № 3, стр. 271-279

ВВЕДЕНИЕ

Ангиогенин впервые был выделен в 1985 г. из культуральной среды линии клеток человеческой аденокарциномы кишечника НТ-29, где был обнаружен в связи со своей ангиогенной активностью. Зрелый ангиогенин представляет собой основный одноцепочечный белок, состоящий из 123 аминокислот и имеющий молекулярную массу около 14.4 кДа [1]. С момента окрытия ангиогенина были выявлены и другие его функции, такие как участие в нейрогенезе [2], нейропротекция [3], иммунорегуляция [4]. Ангиогенин относится к суперсемейству рибонуклеаз [1], способен к транслокации в ядро и активации транскрипции рибосомальной РНК [5], может стимулировать деградацию базальной мембраны [6], активировать сигнальную трансдукцию [5, 7], что связано с секрецией ряда биологически активных факторов. Показана также роль ангиогенина в патогенезе некоторых заболеваний, среди которых опухоли [8], болезнь Паркинсона [9], боковой амиотрофический склероз (БАС).

БАС представляет собой фатальное прогрессирующее нейродегенеративное заболевание с избирательным поражением двигательных нейронов. Заболевание имеет высокую гетерогенность в отношении темпов прогрессирования, но в среднем приводящее к гибели в течение 3–5 лет [10]. Патогенетические механизмы, лежащие в основе БАС, несмотря на активное изучение, во многом не ясны. К ним относят мутации, нарушение процессинга РНК, образование агрегатов патологических белков, дисфункцию митохондрий, окислительный стресс, воспаление и др., однако значение каждого из них до конца не определено [10]. По этой причине к настоящему моменту не существует эффективных методов лечения БАС, не разработаны биомаркеры для выявления предрасположенности, ранней диагностики и прогнозирования течения заболевания.

О возможной роли ангиогенина при БАС стало известно с 2004 г., когда у пациентов впервые были выявлены мутации в гене ANG, приводящие к ингибированию функции ангиогенина [11]. Мутации в гене ANG описаны как при семейных, так и при спорадических формах БАС. В результате мутаций описано снижение рибонуклеазной активности, способности ангиогенина к его транслокации в ядро, нарушение формирования стресс-гранул и снижение ангиогенной активности [12].

Экзосомы представляют собой класс внеклеточных везикул, по данным разных исследователей имеющих размеры 30–200 нм [13, 14]. Экзосомы имеют характерные особенности белкового, липидного и нуклеотидного состава, на основании которого возможно их распознавание. Среди молекул-маркеров экзосом описаны флотиллины, тетраспанины (CD63, CD81), белки теплового шока, некоторые липиды и др. [15]. Основной функцией экзосом является обеспечение коммуникации различных типов клеток, часто в отдаленных участках организма за счет транспорта биологически активных молекул к клеткам-мишеням. Показана роль экзосом в развитии патологического процесса при многих заболеваниях, в том числе болезнях центральной нервной системы, среди которых, в первую очередь, онкологические и нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Гентингтона и БАС. При БАС в экспериментах на клеточных линиях, животных моделях было показано, что экзосомы могут участвовать в распространении патологических белков, способствуя развитию их нейротоксического эффекта [16]. В то же время выявлялись свидетельства возможной протективной роли экзосом при БАС, связанной с очищением клеток от белков с нарушенной упаковкой и переносом протективных факторов [17].

Предположительно существенная роль экзосом в патогенезе БАС позволяет их рассматривать в качестве возможных носителей биомаркеров прогрессирования и распространения патологического процесса при БАС. В настоящей работе представлено исследование ангиогенина в биологических жидкостях пациентов с БАС (плазма и ЦСЖ), и полученных из них экзосомальных фракциях, проанализированы взаимосвязи определяемых уровней ангиогенина с клиническими характеристиками заболевания.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Пациенты. В исследование были включены 30 пациентов с БАС с вероятным или достоверным диагнозом согласно критериям El Escorial [18]. среди которых 6 пациентов с семейными формами и/или с мутациями в генах, ассоциированных с БАС, и 24 пациента со спорадическими формами заболевания. Среди вошедших в группу исследования пациентов с БАС было 16 мужчин и 14 женщин. Медиана возраста составила 55.5 лет [48; 65]. Группу здоровых добровольцев составили 26 практически здоровых человек, соответствующих по полу и возрасту группе пациентов: 12 мужчин и 14 женщин, медиана возраста 56 лет [45; 60 ] .

Забор и хранение биологического материала. У всех пациентов и здоровых добровольцев производился забор крови из кубитальной вены в пробирки с цитратом, у 8 пациентов с БАС дополнительно производился забор цереброспинальной жидкости (ЦСЖ). Кровь центрифугировали при темпепатуре 4°С в течение 10 мин на скорости 3000 об./мин, отбирали плазму и центрифугировали последнюю в течение 15 мин при ускорении 3000 g. ЦСЖ центрифугировали при температуре 4°С и ускорении 13000 g в течение 30 мин. Подготовленный материал хранили в виде аликвот при температуре –80°С.

Выделение экзосом. Выделение экзосом проводили с помощью набора реактивов ExoEasy Maxi Kit (Qiagen). Данный набор используется для быстрой очистки и выделения экстраклеточных везикул из плазмы, из сыворотки и среды из-под клеточных культур. Принцип работы набора основан на аффинном связывании сорбентом колонки мембран внеклеточных везикул, находящихся в материале. Выделение экзосом проводили согласно инструкции производителя. Образец плазмы объемом 4 мл размораживали и смешивали с буфером для нанесения на колонку в равных объемах. Держали при комнатной температуре 5 мин. Затем наносили на колонку, центрифугировали при 500 g 2 мин, промывали сорбент буфером для промывки объемом 10 мл центрифугированием при скорости 5000 g 10 мин. На этапе элюирования колонку с сорбентом переносили с чистую пробирку, наносили на сорбент элюирующий буфер объемом 500 мкл инкубировали при комнатной температуре 1 мин и центрифугировали при 500 g 10 мин. Собранный элюат повторно наносили на колонку и центрифугировали при 5000 g 10 мин. Препараты экзосом сохраняли в виде аликвот по 100 мкл при –80°С.

Электронная микроскопия. Аликвоту препарата экзосом фиксировали в равном объеме буфера Ито–Карновского – смеси тринитрофенола и альдегида – в течение ночи при температуре 4°С. Затем наносили материал на никелевые сетки (SPI, 30 Mesh). На каплю (20–30 мкл) фиксированных экзосом устанавливали сетку и инкубировали в течение часа при комнатной температуре. Затем сетку снимали и удаляли избыток жидкости фильтровальной бумагой. Негативное контрастирование проводили раствором 2% уранил-ацетата в течение 1 мин, избыток раствора удаляли и сетки высушивали. Контрастирование уранилацетатом позволяет окрасить белки, в результате чего окружение экзосомы или везикулы, связанной с белками, приобретает большую электронную плотность. Исследование препарата осуществляли на просвечивающем электронном микроскопе Jeol JEM-100SX при напряжении 80 кВ.

Детекция маркерных белков экзосом. Для подтверждения наличия экзосом в материале, полученном с помощью набора реактивов ExoEasy Maxi Kit (Qiagen), было проведено исследование таких наиболее распространенных маркеров экзосом, как CD63, CD81 и Flotillin-1. Определение маркеров экзосом проводилось методом вестерн-блот. В качестве положительного контроля были использованы стандарты экзосом Exosome Standards (Human Plasma) (NBP2-49838, Novus Biologicals), Purified Exosomes from Human CSF (Healthy Donors) (EXOP-530A-1, SBI), рекомбинантные белки-маркеры экзосом CD63 (11271-H08H, Sino Biological Inc.), CD81 (14244-H07H, Sino Biological Inc.), Flotillin-1 (H00010211-Q01-10ug Novus Biologicals). Электрофорез образцов проводили на гелях Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Precast Gels 4–20% при напряжении 250 В в течение 15 мин. Проводился полусухой перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану в системе для быстрого блоттинга Trans Turbo Blot (25 В, 1.3А, 7 мин (режим “mixeo”)). После переноса белков производили блокировку мембраны 4% раствором обезжиренного молока на фосфатно-солевом буфере (PBS) с добавлением детергента Tween 20 (0.1%) в течение часа. Затем проводили инкубацию с первичными антителами (mouse anti-Human CD63 sc-5275, mouse anti-Human CD81 sc-166029, mouse anti-Human Flotillin-1 sc-74566, SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC.) в разведении 1 : 100 в течение 2 ч. После промывки осуществляли инкубацию со вторичными антителами, специфичными к антителам мыши (ECL Anti-mouse IgG, peroxidase-linked whole antibody (from sheep) NXA931, Amersham) в разведении 1 : 5000. Затем проводили детекцию с использованием набора для хемилюминесцентной детекции Clarity™ Western ECL Substrate (1705060, Bio-Rad). Чтобы исключить неспецифическое связывание вторичных антител с образцами и человеческими иммуноглобулинами, адсорбированными на мембране, был проведен вестерн-блот без инкубации с первичными антителами.

Определение концентрации ангиогенина. Определение ангиогенина проводили с помощью коммерческого набора Human Angiogenin Immunoassay (DAN00, R&D Systems) для количественного ИФА согласно инструкции производителя. В результате проведения вычислений исходные данные оптической плотности преобразовывались в концентрации ангиогенина в проанализированных в образцах, выраженные в пг/мл. Для сопоставления полученных данных проводили расчет количества ангиогенина по отношению к общему количеству белка в образце, результат выражали в пг/мг. Измерение концентрации белка в образцах производили с помощью прибора Nanodrop 2000 (Thermo Fisher Scientific).

Статистическая обработка данных. Статистическая обработка данных проводилась с помощью программы GraphPad Prism 8 (GraphPad Software, США). Данные по клиническим характеристикам пациентов и содержанию ангиогенина представлены в виде медиан [Ме] и межквартильного размаха [Q1; Q3], на графиках отображены медианы и 95% доверительный интервал. Нормальность распределения данных внутри одной группы определяли в тесте на нормальность Д’Агостина–Пирсона. Попарные сравнения между группами исследования проводили с помощью непараметрического критерия Манна–Уитни. Анализ корреляций уровней ангиогенина в различном материале с клиническими параметрами заболевания проводился с помощью коэффициента ранговой корреляции Спирмена. Статистически значимыми считались различия при p < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Клиническая характеристика пациентов с БАС. У 11 (36.7%) пациентов была бульбарная форма заболевания, у 9 (30%) – шейно-грудная, у 10 (33.3%) – пояснично-крестцовая. У основной части пациентов имелись клинические симптомы поражения двигательных нейронов на 2 или 3 анатомических уровнях (стадия 2 и 3): 11 и 13, соответственно, у 5 пациентов дополнительно к 3 уровням поражения имели место дыхательные нарушения, корректирующиеся проведением вентиляции легких (стадия 4В), у 1 пациента – выраженные нарушения глотания, требующие установки гастростомы (стадия 4А). Медиана длительности заболевания составила 24 мес. Медиана значений по шкале ALS-FRS-R, характеризующей функциональное состояние при БАС и включающей оценку речи, глотания, функции рук, ходьбы, дыхательной функции, равнялась 39 (максимальное значение, соответствующее норме, – 48 баллов). Медиана значений жизненной емкости легких (ЖЕЛ) составила 80%, индекса массы тела (ИМТ) – 26.2. В группу исследования вошли преимущественно пациенты с относительно быстрыми (снижение балла по шкале ALS-FRS-R на 8 и более единиц в год) или медленными темпами прогрессирования заболевания (снижение балла по шкале ALS-FRS-R на 3 и менее в год) примерно в равном соотношении. Более подробная характеристика групп исследования представлена в табл. 1.

Характеристика экзосомальной фракции

Трансмиссионная электронная микроскопия (ЭМ) была проведена для исследования экзосомальной фракции плазмы шести пациентов (3 здоровых добровольцев и 3 пациентов с диагнозом БАС), результаты оказались относительно однородными и представлены на рис. 1. Мембранные везикулы обладают сферической морфологией, характерной для экзосом. С помощью програмного обеспечения ImageJ (NIH) были проведены измерения размеров экзосом, представленных на снимках. Было выявлено, что диаметр везикул варьирует от 16 до 94 нм, средний диаметр составил 31.35 ± 11.45 нм. Существенных различий между препаратами экзосом, выделенных из плазмы здоровых добровольцев и больных с БАС, не определялось. В препаратах экзосом встречаются крупные везикулы – от 50 до 100 нм, также характерным является наличие в препаратах агрегатов экзосом и белков плазмы (рис. 1б).

Рис. 1.

ЭМ экзосомальной фракции здоровых добровольцев и пациентов с БАС (а и б соответственно). Простыми стрелками указаны типичные для данного препарата везикулы, фигурными – агрегаты везикул и белков плазмы.

В образцах экзосом, выделенных из плазмы крови как пациентов с БАС, так и здоровых добровольцев, а также ЦСЖ, с помощью набора ExoEasy Maxi Kit были выявлены все три маркера экзосом (CD63, CD81, Flotillin-1). Таким образом, наличие экзосом в исследованном материале было подтверждено с помощью двух методов.

Определение ангиогенина в плазме, ЦСЖ и экзосомальных фракциях. Содержание ангиогенина в плазме у пациентов с БАС равнялось 6368.76 [5302.41; 7800.83] пг/мг белка, в экзосомальной фракции плазмы – 1869.22 [1235.59; 2373.60] пг/мг белка, что в 3.4 раза ниже. У здоровых добровольцев уровень ангиогенина в плазме составил 7657.30 [6592.24; 8569.09] пг/мг белка, в экзосомальной фракции плазмы – 2900.73 [2202.86; 3968.40] пг/мг белка, что в 2.6 раз ниже. Таким образом, относительное количество ангиогенина в исходной плазме оказалось значительно более высоким, чем в ее экзосомальной фракции, это значение как у пациентов, так и у здоровых добровольцев было статистически значимым (р < 0.0001) (рис. 2).

Рис. 2.

Уровень ангиогенина в плазме и ее экзосомальной фракции у пациентов с БАС и здоровых добровольцев. БАС – боковой амиотрофический склероз.

При сопоставлении содержания ангиогенина как в плазме, так и в экзосомальной фракции, у пациентов с БАС были выявлены более низкие уровни, по сравнению со здоровыми добровольцами, различия были статистически значимыми, что может указывать на протективную роль ангиогенина (рис. 2).

Содержание ангиогенина было оценено также в ЦСЖ пациентов с БАС, где оно составило 2365.19 [2219.35; 4175.06] пг/мг белка и ее экзосомальной фракции, где его уровень составил 223.50 [181.27; 266.21] пг/мг белка, что в 10.58 раз ниже. Это различие статистически значимо (р = 0.0002). Относительное количество ангиогенина в плазме у пациентов с БАС статистически выше, чем в ЦСЖ (р < 0.0001) (рис. 3). Тем не менее, во всем исследованном материале содержание ангиогенина было относительно высоким, что может говорить о том, что ангиогенин может переноситься как в составе внеклеточных везикул, так и вне их.

Рис. 3.

Уровень ангиогенина в плазме, ЦСЖ и экзосомальных фракциях у пациентов с БАС. ЦСЖ – цереброспинальная жидкость, БАС – боковой амиотрофический склероз.

При сопоставлении данных ИФА ангиогенина с клиническими характеристиками заболевания, такими как возраст пациента, длительность заболевания, балл по шкале ALSFRS-R, форма, стадия заболевания, жизненная емкость легких (ЖЕЛ), индекс массы тела (ИМТ), отмечалась тенденция к выявлению больших концентраций ангиогенина в плазме и ее экзосомальной фракции у пациентов с более высокой оценкой по шкале ALSFRS-R, хотя обнаруженная взаимосвязь не достигла уровня статистической значимости (р = 0.06). Таким образом, снижение уровня ангиогенина в плазме и в экзосомальной фракции плазмы может быть маркером прогрессирования заболевания, однако эта гипотеза нуждается в подтверждении в более крупной выборке. Других взаимосвязей с клиническими характеристиками заболевания обнаружено не было. Ассоциаций между уровнями ангиогенина в плазме, ЦСЖ, экзосомальных фракциях и наличием генетически обусловленной формы заболевания или какой-либо конкретной мутации не обнаружено.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Снижение уровня ангиогенина, выявленное нами у пациентов с БАС, по сравнению со здоровыми добровольцами, и более выраженное у пациентов с худшим функциональным состоянием указывает на протективное значение ангиогенина при БАС. Отличием нашего исследования от других работ, в которых анализировались уровни ангиогенина при патологии, является дополнительное измерение уровня ангиогенина в экзосомальных фракциях. Полученные нами данные указывают на снижение уровня ангиогенина при БАС во всех исследованных образцах. Также отмечена тенденция к выявлению более низких уровней ангиогенина у пациентов, находящихся в худшем функциональном состоянии. Хотя эти данные нуждаются в подтверждении в более крупной выборке пациентов, наши результаты указывают на возможное значение ангиогенина как плазмы, так и ее экзосомальной фракции как маркера прогрессирования заболевания при БАС.

Полученные нами данные согласуются с представлениями о возможной роли ангиогенина при БАС, полученными на основании результатов работ, проведенных на клеточных линиях и животных моделях. Было показано, что ангиогенин в больших количествах экспрессируется во взрослых мотонейронах и может защищать культуры мотонейронов от различных повреждающих воздействий, имеющих место при БАС, таких как эксайтотоксичность, гипоксия, стресс эндоплазматического ретикулума [19]. Рекомбинантный ангиогенин оказывал нейропротективное действие на культуры мотонейронов, а его введение мышам с мутацией SOD1G93A – лабораторной модели БАС, что приводило к значительному увеличению длительности жизни и двигательных функций у данных животных [20]. Протективный эффект ангиогенина реализуется только при воздействии на мотонейроны диких форм белка, но не его мутантных вариантов, отмечающихся у некоторых пациентов с БАС. Культуры клеток P19 поглощают как дикую форму ангиогенина, так и его варианты, связанные с БАС, однако ангиогенин дикого типа способствует дифференцировке клеток Р19 и росту нейритов, а связанные с БАС формы не имеют такого эффекта. Ангиогенин дикого типа защищает нейроны от гипоксия-индуцированной клеточной гибели, эксайтотоксичности и сывороточного голодания, а варианты, связанные с БАС, не оказывают нейропротективного действия [3, 20, 21].

В работе, изучавшей влияние структуры ангиогенина дикого типа и 11 его вариантов, связанных с БАС, было показано, что структурные изменения ангиогенина обусловливают его отрицательное воздействие на выживаемость нейронов преимущественно за счет влияния мутаций на РНКазную активность и способность индуцировать образование стрессовых гранул в нейрональных клеточных линиях [12]. Ангиогенин дикого типа в условиях гипоксии или голодания клетки индуцирует образование стресс-гранул в результате отщепления от тРНК антикодоновой петли и образования тРНК-производных стресс-индуцированных РНК. Последние несут целый ряд функций, включая подавление трансляции и деградацию специфических мРНК. В целом, стресс-гранулы обладают нейропротективной функцией, позволяя клетке пережить неблагоприятные условия, подавляя метаболизм РНК, поэтому одним из механизмов дегенерации мотонейронов у пациентов с мутациями в гене Ang может быть именно нарушение формирования стресс гранул. В то же время необходимо отметить, что агрегаты других мутантных белков, таких как как TDP-43, колокализуются со стресс-гранулами, формируя патологические агрегаты [22].

В отличие от наших данных, в нескольких исследованиях определялось повышение уровня ангиогенина в плазме крови у пациентов с БАС, которое расценивали как стрессовую реакцию, направленную на защиту гибнущих мотонейронов [23, 24]. Научной группой Skorupa было выдвинуто предположение о том, что ангиогенин, выделяемый мотонейронами под воздействием стресса, может служить сигналом призыва к помощи, адресованного астроцитам и эндотелиальным клеткам. В своих экспериментах они показали, что секреция ангиогенина мотонейронами в значительной степени активируется в ответ на стресс, а выделяемый ими ангиогенин поглощается почти исключительно астроглией, модифицируя в ней профиль РНК. Поступление ангиогенина в астроциты также было необходимым условием для защиты стресс-индуцированного повреждения мотонейронов с помощью ангиогенина [25].

В ряде других исследований повышения уровня ангиогенина в биологических жидкостях у пациентов с БАС выявлено не было. В работе Ilzecka различий концентраций ангиогенина в ЦСЖ между пациентами с БАС и контрольной группой выявлено не было [26]. В другом недавно опубликованном исследовании статистически значимых различий уровня ангиогенина в ЦСЖ у пациентов с БАС и здоровых добровольцев выявлено не было [27]. В работе McLaughlin и соавт. было показано статистически значимое снижение концентраций ангиогенина в сыворотке и плазме крови, а также ЦСЖ, по сравнению с контрольной группой [28]. В мета-анализе, проанализировавшем уровни ангиогенина в сыворотке крови у пациентов с нейродегенеративными заболевания (в основном с БАС), в сравнении со здоровыми добровольцами, статистически значимых различий между группами выявлено не было [29]. Ограничением нашего и многих других исследований, вошедших в последний мета-анализ, является относительно небольшой размер выборки. Как было показано ранее, уровень ангиогенина может варьировать в зависмости от целого ряда факторов, таких как возраст, пол, размеры тела, генетические особенности [30]. Таким образом, вопрос о значении ангиогенина в качестве биомаркера при БАС требует дополнительного изучения с включением в исследование более крупной выборки пациентов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследование показало, что уровни ангиогенина относительно высоки как в плазме, так и в ЦСЖ пациентов с БАС, так и в экзосомальной фракции. Тем не менее его содержание значительно выше в исходной плазме и ЦСЖ. У пациентов с БАС содержание ангиогенина в плазме и ее экзосомальной фракции понижено, по сравнению со здоровыми людьми. Обнаружена тенденция к взаимосвязи более низких уровней ангиогенина в плазме и ее экзосомальной фракции с худшим функциональным состоянием пациентов с БАС. Полученные данные указывают на возможную протективную роль ангиогенина при БАС, механизмы реализации этого эффекта нуждаются в дополнительном изучении. Полученные результаты создают основу для возможного использования ангиогенина в качестве маркера прогрессирования патологического процесса при БАС, однако этот вопрос также требует подтверждения в более крупных исследовниях.