Нейрохимия, 2020, T. 37, № 3, стр. 233-239

Влияние пренатальной гипоксии на содержание нейронспецифической енолазы в структурах головного мозга и сыворотке крови крыс в раннем онтогенезе

А. Ю. Морозова 1, А. В. Арутюнян 14, Ю. П. Милютина 1, П. Ю. Морозова 3, Л. С. Козина 4, И. А. Журавин 2

1 Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта
Санкт-Петербург, Россия

2 Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН
Санкт-Петербург, Россия

3 Санкт-Петербургский государственный университет
Санкт-Петербург, Россия

4 Санкт-Петербургский институт биорегуляции и геронтологии
Санкт-Петербург, Россия

Поступила в редакцию 18.11.2019
После доработки 22.12.2019
Принята к публикации 27.12.2019

Полный текст (PDF)

Аннотация

В работе исследовалась динамика изменения содержания нейронспецифической енолазы (NSE – КФ 4.2.1.11) в гиппокампе, коре и мозжечке крыс на 5-й, 10-й, 30-й дни постнатального развития, а также в их сыворотке крови. Показано, что содержание NSE в течение первого месяца жизни возрастает в несколько раз во всех изученных структурах, как после перенесенной гипоксии, так и в группе животных, не подвергавшихся гипоксическому воздействию. Установлено, что пренатальная гипоксия на 14-й день эмбрионального развития приводит к достоверным изменениям содержания NSE во всех изученных структурах головного мозга. В сыворотке крови содержание данного фермента возрастает на 5-й, 10-й, 30-й дни жизни у подопытных животных в сравнении с контрольной группой. Таким образом, недостаток кислорода оказывает влияние на содержание данного фермента как в структурах мозга, так и в сыворотке крови крыс, что дает возможность судить о выживаемости нейронов в условиях пренатальной гипоксии, а также позволяет предложить использовать этот показатель в качестве маркера нарушения ЦНС плода при воздействии гипоксии в период пренатального развития.

Ключевые слова: пренатальная гипоксия, нейроспецифические белки, нейронспецифическая енолаза (NSE), гиппокамп, кора, мозжечок, сыворотка крови, ранний онтогенез

ВВЕДЕНИЕ

В последнее десятилетие наблюдается рост нервно-психических заболеваний, развитие которых связано с патологическими процессами, протекающими в период эмбрионального развития. Наиболее высока частота неблагоприятных последствий у детей с синдромом задержки внутриутробного развития (ЗВУР). К одним из факторов, ведущих к формированию ЗВУР, относится осложнение беременности развитием хронической плацентарной недостаточности, при которой плод развивается в условиях гипоксии, от длительности которой, а также от сроков беременности, на которых она протекает, зависит формирование центральной нервной системы (ЦНС) новорожденного. Дети с ЗВУР характеризуются нарушением двигательных функций, сниженной способностью к обучению, гиперактивностью, невнимательностью и другими когнитивными нарушениями. В настоящее время предпринимаются попытки посредством использования экспериментальных моделей оценить последствия пренатальной гипоксии.

Так показано, что гипоксия запускает ряд молекулярных процессов, таких как деполяризация мембран, увеличение содержания внутриклеточного кальция, возрастание выброса и подавление обратного захвата нейромедиаторов, продукция свободных радикалов, которые участвуют в повреждении нейронов и их гибели. Наряду с данными процессами при гипоксии начинают функционировать компенсаторные механизмы, которые обеспечивают защиту головного мозга и организма в целом от недостатка кислорода. Пренатальная гипоксия, встречающаяся при беременности, вызывает нарушение развития ЦНС у плода [1], что может быть связано с изменением содержания различных нейроспецифических и нейротрофических белков в таких отделах развивающегося мозга, как гиппокамп, кора и мозжечок [2], отвечающих за когнитивные и двигательные функции организма. В экспериментальных исследованиях показано, что нарушение функционирования данных структур мозга проявляется в компенсируемых изменениях двигательных реакций и когнитивных дисфункциях в процессе взросления [3].

Особое внимание в этом аспекте вызывает изучение одного из нейроспецифических белков, такого как нейроспецифическая енолаза (NSE), обладающая нейротрофическими и нейропротективными свойствами по отношению к широкому спектру нервных клеток в ЦНС [4, 5]. Молекулярная масса нативной енолазы составляет 80–95 кДа, и фермент существует в виде нескольких димерных изоферментов (αα, αβ, αγ, ββ и γγ), образованных из трех субъединиц α, β и γ. NSE является изоферментом в виде гомодимера γγ [6] и относится к гликолитическим ферментам класса лиаз, катализирующим обратимую реакцию отщепления воды от 2-фосфо-D-глицерата с образованием макроэргического соединения фосфоенолпирувата. Таким образом, данный фермент участвует в катализе реакции гликолиза, который является основным механизмом генерации энергии нейронами. NSE относится к внутриклеточным энзимам головного мозга, определяется в нейронах, глиальных клетках, нейроэндокринных клетках, присутствует в следовых количествах в тромбоцитах и является общим маркером всех дифференцированных нейронов [4, 7]. Локализация NSE как в нейронах, так и глие (олигодендроцитах, астроцитах и микроглиальных клетках), указывает на то, что она наряду с участием в реакциях нейровоспаления, может выполнять также нейротрофическую роль [5]. Известно, что NSE наилучшим образом характеризует целостность мембран гематоэнцефалического барьера (ГЭБ), и определение ее содержания применяется для диагностики острых состояний, связанных с нарушением ГЭБ, таких как церебральная ишемия и гипоксия головного мозга [8, 9]. В связи с тем, что пренатальная гипоксия рассматривается в настоящий момент, как основой патологический фактор, ведущий к ЗВУР у новорожденных детей, то изучение ее влияния на содержание NSE в структурах, участвующих в формировании когнитивных и двигательных функций, а также в сыворотке крови животных с использованием модели пренатальной гипоксии, представляет собой интерес не только в рамках фундаментального исследования, но и в научно-практическом отношении, т.к. содержание NSE можно рассматривать, как биохимический показатель состояния головного мозга у потомства, определяющий выживаемость нервных клеток в условиях пренатальной гипоксии.

Целью данной работы явилось исследование содержания NSE в гиппокампе, коре и мозжечке, а также в сыворотке крови крыс в раннем онтогенезе при пренатальной гипоксии.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

В работе использовали крыс линии Wistar разного возраста из вивария Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова, как перенесших пренатальную гипоксию, так и не подвергавшихся ей (контрольная группа). Все исследования выполнялись с соблюдением утвержденных международных правил проведения работ с использованием экспериментальных животных [10] и в соответствии с рекомендациями этического комитета ИЭФБ РАН.

Для получения группы животных, перенесших пренатальную гипоксию, беременные самки крыс на 14-й день развития плода (Е14) подвергались действию нормобарической гипоксии в камере, емкость которой составляла 100 л, оснащенной системой вентиляции, терморегуляции, и адсорбции выдыхаемого СО2, а также газовым анализатором. В ходе эксперимента содержание O2 снижалось с 21 до 7% в течение 10 мин, и удерживалось на этом уровне 3 часа. В эксперименте нами были использованы крысы из потомства гипоксических и контрольных животных в возрасте 5-ти, 10-ти, 30-ти дней. Число крыс в каждой группе составляло не менее 6 животных.

На указанных сроках жизни животных декапитировали и извлекали мозг на холоде (+4°С). Зону, соответствующую коре, гиппокампу и мозжечку, извлекали согласно атласу (The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates). Образцы сыворотки крови получали посредством отстаивания крови в течение 30 мин при 37°С и в последующем центрифугировании при 2500 об./мин в течениe 20 мин. В случае необходимости повторного исследования образцы замораживались и хранились при –80°С.

Определение содержания NSE проводилось c использованием тест-системы “CanAg NSE EIA”, которая основана на твердофазном, неконкурентном иммуноферментном анализе. Использовали два типа моноклональных мышиных антител, которые направлены на различные антигенные детерминанты в молекуле NSE. Используемые моноклональные антитела связываются с γ-субъединицей фермента и детектируют ее γγ- и αγ-формы. Следует отметить, что в этих условиях наряду с NSE, определяется ненейрональная форма фермента NNE (α-енолаза). Сыворотку и стандарты инкубировали вместе с биотинилированными анти- NSE антителами и моноклональными антителами, коньюгированными с пероксидазой хрена в ячейках микропланшета, которые покрыты стрептавидином. Затем в каждую ячейку добавляли раствор субстрата (перекись водорода и 3,3',5,5'-тетраметилбензидин). В результате реакции развивается голубая окраска. После этого реакцию останавливали стоп-раствором (0.12 М HCl) и интенсивность окрашивания измеряли на спектрофотометре BioTek EL-808 при длине волны 405 нм. Интенсивность окраски пропорциональна количеству NSE, которая присутствует в образце. Концентрацию NSE в образцах рассчитывали по калибровочной кривой и выражали в мкг/мкг белка. Количество белка определяли методом Бредфорд [11]. Интенсивность окраски измеряли фотометрически при длине волны 595 нм. Стандартная кривая строилась с использованием γ-глобулина (мкг/мл). Чувствительность метода составляет 5–20 мкг белка/мл.

Статистическую обработку данных проводили с помощью программы Statistica for Windows 6.0 (StatSoft). Для оценки достоверности полученных различий использовали критерии t-Стьюдента и поправку Бонферрони. Данные считались достоверными при р < 0.05. Результаты представлены как М ± m (среднее ± ошибка среднего).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В течение постнатального периода развития содержание NSE резко возрастала как у контрольных, так и у подвергнутых пренатальной гипоксии животных к концу первого месяца жизни во всех изученных структурах, о чем свидетельствуют данные, представленные в табл. 1, а именно, у контрольных животных содержание NSE в гиппокампе повышалась в 19.7 раз к 30-му дню жизни, в коре и мозжечке также увеличивалось в десятки раз по сравнению с 5-м днем жизни, где обнаруживались следовые количества фермента.

Таблица 1.  

Содержание NSE в структурах головного мозга контрольных и опытных крысят в первый месяц жизни

Структура головного мозга День жизни животного NSE, мкг/мкг белка
контроль опыт
Гиппокамп 5 15.35 ± 1.35 9.60 ± 0.79*
10 38.35 ± 12.57 7.25 ± 0.93*
30 303.50 ± 56.07^^ 117.19 ± 5.98*#
Кора 5 0.45 ± 0.03 0.15 ± 0.03**
10 4.1 ± 0.67 1.36 ± 0.21**
30 79.3 ± 3.9^^ 111.4 ± 5.97** #
Мозжечок 5 0.6 ± 0.11 0.2 ± 0.04^
10 6.29 ± 0.73 2.13 ± 0.4^
30 140.5 ± 7.7^^ 91.85 ± 11.32^ #

^ ^ Достоверность различий NSE в течение первого месяца жизни контрольных животных, где р < 0.05; # достоверность различий NSE в течение первого месяца жизни опытных животных, где р < 0.05;   * достоверность различий содержания NSE в гиппокампе крыс контрольной группы и группы, перенесшей гипоксию, где р < 0.05; ** достоверность различий содержания NSE в коре крыс контрольной группы и группы, перенесшей гипоксию, где р < 0.05; ^ достоверность различий содержания NSE в мозжечке крыс контрольной группы и группы, перенесшей гипоксию, где р < 0.05.

Аналогичная тенденция наблюдается в изменении содержания фермента у подопытных животных, а именно в гиппокампе содержание NSE возрастало в 12 раз к концу первого месяца, а в коре и мозжечке повышалось также, как у контрольных животных в десятки раз. Важно отметить, что наибольшее содержание NSE наблюдалось в гиппокампе контрольных и подопытных животных.

У крысят, перенесших пренатальную гипоксию, содержание NSE снижалось на 5-й день жизни в гиппокампе в 1.6, в коре и мозжечке в 3 раза по сравнению с контрольной группой животных. На 10-й день жизни оно понижалось в гиппокампе в 5, в коре и мозжечке в 3 раза, а на 30-й день жизни тенденция к изменению содержания NSE несколько выравнивалось по сравнению с контрольной группой, тем не менее, оставаясь весьма существенной в гиппокампе, где содержание фермента более, чем в 2.5 раза было снижено у подопытной группы животных по сравнению с контрольной (табл. 1).

Оценив изменения в структурах мозга крыс, нами было изучено влияние гипоксии на содержание NSE в сыворотке крови животных (табл. 2).

Таблица 2.

Содержание NSE в сыворотке крови контрольных и опытных крысят в первый месяц жизни

Группа NSE, мкг/мл
5-й д. ж. 10-й д.ж. 30-й д.ж.
Контроль 0.25 ± 0.008 0.40 ± 0.02 0.60 ± 0.02#
Гипоксия 1.09 ± 0.08* 3.95 ± 0.17* 11.57 ± 1.50*^

# Достоверность различий NSE в течение первого месяца жизни контрольных животных, где р < 0.05; ^ достоверность различий NSE в течение первого месяца жизни подопытных животных, где р < 0.05; * достоверность различий содержания NSE в сыворотке крови крыс контрольной группы и группы, перенесшей гипоксию,    где р < 0.05.

Показано, что содержание данного фермента возрастало к 30-му дню жизни как в контрольной группе крыс, так и в подопытной в 2.4 и 10 раз соответственно. Пренатальная гипоксия приводила к повышению данного показателя на всех изученных сроках жизни, а именно на 5-й день жизни содержание NSE возрастало в 4.4 раза, на 10-й день – в 9.8 раз, а в конце первого месяца жизни в – 19 раз по сравнению с контрольными животными.

ОБСУЖДЕНИЕ

Известно, что нейроспецифические белки, в частности NSE, обладают нейротрофическими и нейропротекторными свойствами в отношении большого спектра нервных клеток в ЦНС [5]. В экспериментальных исследованиях показано, что NSE способствует выживаемости ряда структур головного мозга (неокортекса) при патологии посредством Са2+-опосредованного механизма, а также в последнее время укрепляется точка зрения о существовании собственного гликолитического пути в нейронах, все это позволяет рассматривать NSE в качестве высокоспецифичного маркера нейронов [6]. Пренатальная гипоксия является одним из патологических факторов, влияющих на формирование ЦНС у потомства, и чаще всего патологические изменения при недостатке кислорода отмечаются в структурах, задействованных в формировании когнитивных и двигательных функций [1215], а именно в коре и гиппокампе, ответственных за обучение и память [16, 17] и в мозжечке, отвечающем за двигательные функции, которые нарушаются не только у животных, но также и у детей с ЗВУР. В связи с выше перечисленным, особый интерес вызывает изучение изменения NSE в данных структурах головного мозга на экспериментальной модели. В нашей работе используется модель пренатальной гипоксии Е14, т.к. именно к концу второй недели и первых дней третьей недели эмбриогенеза наблюдается максимальная пролиферативная активность клеток головного мозга: начинается генерация крупных нейронов мозжечка, гиппокампа и коры.

14-й день эмбрионального развития для гипоксического воздействия выбран в связи с тем, что пролиферативная активность клеток головного мозга достигает максимума к концу второй недели внутриутробного развития и затем снижается [3, 18, 19]. В этот период начинается генерация клеток в новой коре, гиппокампе и мозжечке [18], т.е. гипоксическое воздействие на исследуемые структуры оказывалось нами в критические сроки их формирования, в то время, когда они наиболее уязвимы.

Выбор указанных сроков в постнатальном онтогенезе был обусловлен следующими факторами: 5-й день – это завершение миграции нейробластов, нейритогенез, 10-й день – начало миелинизации, максимальный кровоток, синаптогенез, с 10-го по 20-й день жизни протекает активная миелинизация, идет формирование синаптических структур, продолжается пролиферация нейронов и глиальных клеток. Дифференцировка и созревание нейронов обеспечивается интенсивным синтезом белков и липидов, многие из которых нейроспецифические, а также синтезом ростовых факторов и медиаторов, что сопровождается увеличением массы головного мозга животных. На 30-й день происходит завершение интенсивного формирования ЦНС [20].

При изучении уровня NSE в гиппокампе, коре и мозжечке в онтогенетичском периоде с 5-го по 30-й день жизни нами было выявлено резкое возрастание его содержания во всех отделах, что согласуется с работами, в которых исследовалась динамика изменения концентрации данного фермента с 1-го дня по 30-й мес. жизни в различных структурах головного мозга мышей, причем следует отметить, что наибольшее возрастание этого показателя отмечалось, начиная с 3-й недели вплоть до 6-го месяца жизни животных [21, 22]. Можно полагать, что вклад ненейрональной αγ-формы фермента в изменение содержания NSE в указанные сроки крайне незначителен, поскольку она содержится преимущественно в мозге эмбрионов и элиминируется в постнатальном периоде по мере созревания нейронов [23]. Обнаруженная динамика увеличения содержания NSE в контрольных и подопытных группах крыс также соответствует ранее полученным результатам, согласно которым уровень содержания другого нейроспецифического белка S-100 при гипоксии возрастает во всех изученных структурах мозга [2], что свидетельствует о важной роли белков S-100 и NSE в поддержании нормального функционирования головного мозга.

Проведенный анализ полученных результатов показал, что патологическое воздействие пренатальной гипоксии в период первого месяца жизни крыс приводит к уменьшению содержания NSE в коре и гиппокампе подопытных животных, что согласуется с ранее полученными нами данными о достоверном снижении при гипоксии уровня таких нейротрофических белков, как BDNF и NGF и S-100 [2]. Такие изменения в содержании выше указанных показателей могут приводить к нарушению выполнения функций данных белков и влиять на формирование синаптической пластичности и целостность нейронов в изученных структурах головного мозга. Так, установлено, что у животных Е14, подвергнутых пренатальной гипоксии, снижено количество лабильных шипиков в гиппокампе, что авторы связывают с нарушением пластичности нейронных сетей [16]. Аналогичные изменения в биохимических показателях наблюдалось нами и в мозжечке, что свидетельствует о биохимическом проявлении нарушения функций данной структуры. В литературе показано, что гипоксия во время внутриутробного развития приводит к структурным нарушениям мозжечка [14], что сопровождается изменениями в поведении животных [3]. Исходя из полученных данных в данном эксперименте и ранее, можно заключить, что пренатальная гипоксия сопровождается изменением содержания нейротрофических и нейроспецифических белков во всех изученных структурах, что может приводить к нарушению развития нейронов, глиальных клеток, разрастания дендритных окончаний и формирования синаптических контактов в головном мозге.

Известно, что морфофункциональные изменения нейронов и глиальных клеток при различных вариантах гипоксического воздействия приводят к нарушению целостности ГЭБ, что сопровождается высвобождением в кровь нейроспецифических ферментов и их изоформ. Таким образом, определение в нашем эксперименте NSE в сыворотке крови позволяет оценить интенсивность повреждения ЦНС у экспериментальных животных. Нами показано, что пренатальная гипоксия приводит к достоверному возрастанию содержания NSE на всех изученных сроках в сыворотке крови, что свидетельствует о повреждении нейронов и нарушении ГЭБ в головном мозге крыс после перенесенной пренатальной гипоксии. Можно предположить выход NSE в этих условиях в кровоток, что обуславливает возможность использования данного показателя в качестве маркера гипоксического повреждения головного мозга, как это принято в отношении определения NSE в крови при различных нейродегенеративных заболеваниях [5, 24, 25]. Изменения, полученные в сыворотке крови крыс, согласуются с выше описанными данными, при которых наблюдается снижение NSE в структурах головного мозга, возможно связанное с отставанием развития нервной системы, и проявляется в нарушении двигательных и когнитивных функций, а именно обучении и памяти в раннем онтогенезе животных, что подтверждается исследованиями с использованием физиологических тестов [3, 4, 16].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, пренатальная гипоксия (Е14) сопровождается достоверным изменением содержания NSE в гиппокампе, коре и мозжечке головного мозга животных, что может быть одной из причин отставания развития нервной системы в раннем онтогенезе и нарушения поведения животного на более поздних сроках жизни. Обнаруженное достоверное повышение содержания NSE в сыворотке крови опытных животных свидетельствует о нарушении целостности ГЭБ и дает возможность допустить предположение об использовании NSE в качестве маркера повреждения нейронов головного мозга и нарушения их функций у потомства с перенесенной пренатальной гипоксией, в частности у детей с ЗВУР.

Список литературы

  1. Dubrovskaya N.M., Nalivaeva N.N., Vasilev D.S., Bagrova D.I., Zhuravin I.A. // Nova Science Publishers. Inc. 2012. V. 6. P. 155–173.

  2. Морозова А.Ю., Арутюнян А.В., Милютина Ю.П., Морозова П.Ю., Козина Л.С., Журавин И.А. // Нейрохимия. 2018. Т. 35. № 3. С. 256–263.

  3. Дубровская Н.М., Журавин И.А. // Журн. высш. нервн. деят. 2008. Т. 58. № 6. С. 718–727.

  4. Isgro M.A., Bottori P., Scatena R. // Adv. Exp. Med. Biol. 2015. V. 867. P. 125–143.

  5. Hague A., Polcyn R., Matcelle D., Banik N.L. // Brain. Sci. 2018. V. 8. P. 33–45.

  6. Блинов Д.В., Терентьев А.А. // Нейрохимия. 2013. Т. 30. № 3. С. 179–192.

  7. Рахимбаева Г.С., Рашидова Н.С. // Межд. неврологический журн. 2011. Т. 2. С. 123–128.

  8. Blennow K., Wallin A., Ekamn R. // J. Neurol. Transm. 1994. V. 8. P. 27–30

  9. Жукова И.А., Алифирова В.М., Жукова Н.Г. // Бюллетень сибирской медицины. № 2. 2011. С. 15–21.

  10. Kilkenny C., Browne W. J., Cuthill I. C., Emerson M., Altman D. G. // PLoS Biol. 2010. V. 8. № 6. e1000412.

  11. Bradford M.M. // Anal. Biochem. 1976. V. 72. P. 248–254.

  12. Васильев Д.С., Туманова Н.Л., Журавин И.А. // Журн. эволюц. биох. физиол. 2008. Т. 44. № 3. С. 258–266.

  13. Burke R.E., Baimbridge K.G. // J. Neuroscience. 1993. V. 56. № 2. P. 305–315.

  14. Rees S., Indel T. // Early Hum. Dev. 2005. V. 81. № 9. P. 753–761.

  15. Vasilev D.S., Dubrovskaya N.M., Tumanova N.L., Zhuravin I.A. // Front. Neurosci. 2016. V. 10. Article 126. https://doi.org/10.3389/fnins.2016.00126

  16. Журавин И.А., Туманова Н.Л., Васильев Д.С. // Докл. РАН. 2009. Т. 425. С. 123–125.

  17. Журавин И.А., Дубровская Н.М., Туманова Н.Л. // Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова. 2003. Т. 89. С. 522–532.

  18. Резников К.Ю. // Пролиферация клеток мозга позвоночных в условиях нормального развития мозга и при его травме. М.: Наука, 1981. 149 с.

  19. Miller M.W. // J. Comp. Neurol. 1989. V. 287. P. 326–338.

  20. Ещенко Н.Д., Путилина Ф.Е., Галкина О.В. // Биохимия развивающегося мозга. Избранные разделы. СПб.: Изд-во СПбУ, 2013. 252 с.

  21. Schaf D.V., Каушанская Е.Я. // Значение нейротрофических белков и протеолитических ферментов в оценке тяжести критического состояния мозга новорожденных и их нервно-психического развития в раннем возрасте. Автореф. дис. … канд. мед. наук,1993. 47 с.

  22. Чехонин В.П., Дмитриева Т.Б., Жирков Ю.А.// Иммунохимический анализ нейроспецифических антигенов. М., 2000. 416 с.

  23. Marangos P.J., Schmechel D.E., Parma A.M., Goodwin F.K. // Brain Res.1980. V. 3. P. 185–193.

  24. Schaf D.V., Tort A.B., Fricke D., Schestatsky P., Portela L.V., Souza D. O., Rieder C.R. // Parkinsonism Relat. Disord. 2005. V. 11. P. 39–43.

  25. Chaves M.L., Cammozzato A.L., Ferreira E.D., Piazenski I., Kochhann R., Dalligna O., Mazzini G.S., Souza D. O., Portela L.V. // J. Neuroinflam. 2010. V. 7. P. 6–18.

Дополнительные материалы отсутствуют.