Нейрохимия, 2020, T. 37, № 3, стр. 249-256

ВВЕДЕНИЕ

Болезнь Паркинсона (БП) – нейродегенеративное заболевание, характеризующееся постепенным нарастанием экстрапирамидной моторной симптоматики – брадикинезии, ригидности и тремора покоя, что связано с прогрессирующей гибелью дофаминергических нейронов черной субстанции среднего мозга [1]. Паркинсонический синдром характерен также для заболеваний группы “паркинсонизм-плюс” к которым относят прогрессирующий надъядерный паралич, мультисистемную атрофию, деменцию с тельцами Леви [1]. Выделяют, кроме того, вторичные формы – лекарственный, сосудистый, постинфекционный паркинсонизм и т.д.

В настоящее время накоплены многочисленные подтверждения того, что при БП нейродегенерация связана с патологической агрегацией в нейронах белка альфа-синуклеина и носит мультисистемный характер, затрагивая и периферические отделы нервной системы [2]. Моторная симптоматика при БП проявляется лишь после снижения уровня дофамина в нигростриарном пути на 60%, что соответствует гибели 50–60% нейронов компактной части черной субстанции (ЧСк) [3], однако немоторные нарушения во многих случаях опережают манифестацию двигательных расстройств на 5–10 и более лет [4]. Возникновение этих нарушений объясняется тем, что наряду с дегенеративными изменениями нигростриатной системы мозга при паркинсонизме имеет место также вовлечение мезолимбической дофаминергической системы и некоторых других нейротрансмиттерных систем.

Хотя токсические модели паркинсонизма на экспериментальных животных служили одним из первых инструментов исследования механизмов нарушений при БП, наряду с фармакологической блокадой синтеза и нейротрансмиссии дофамина [5], они остаются незаменимыми для оценки компенсаторных, пластических изменений в базальных ядрах, поиска причин повышенной уязвимости нигральных нейронов при БП, разработки стратегий нейропротекции и клеточной терапии при паркинсонизме. Классическими моделями является введение в различные отделы мозга нейротоксинов 6‑гидроксидофамина (6-ГДА) и 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина (МФТП), приводящих к гибели дофаминергических нейронов за счет индукции окислительных повреждений клетки и нарушения окислительного фосфорилирования [6]. В случае системного введения токсинов, например, МФТП, размер поражения значительно варьирует, что сказывается и на вариабельности проявления моторной симптоматики. При интракраниальном введении итоговый размер поражения и скорость его развития зависит от места введения токсина. Так, наиболее быструю и селективную гибель нейронов ЧСк с развитием характерной моторной симптоматики вызывает введение 6-ГДА непосредственно в средний мозг [7]. Чаще используют одностороннее интранигральное введение, при котором наблюдается снижение дофамина в мезостриарном дофаминергическом пути. Животные с таким повреждением не демонстрируют афагии и адипсии, в отличие от двусторонних разрушений ЧСк [8]. Кроме того, одностороннее введение токсина соответствует латерализации моторных нарушений в начальных стадиях БП [1]. В последнее время, учитывая возросший интерес к преклинической стадии БП, все больше внимания привлекают немоторные проявления паркинсонизма в данной модели [9, 10], связанные с нарушениями в мезолимбической и мезокортикальной дофаминергических системах. Подобные нейрохимические нарушения наблюдаются при введении 6-ГДА в стриатум, что сопровождается медленным развитием паркинсоноподобной симптоматики на протяжении 3 недель [10]. Для такого способа введения 6-ГДА детально описаны нейродегенеративные изменения как в ЧСк, так и ВТО [11]. Но в большинстве работ с интранигральным введением токсина, сделан акцент лишь на локальные изменениях в ЧСк и быстром развитии моторной симптоматики паркинсонизма [7, 12, 13]. Таким образом, в какой степени локальное введение 6-ГДА в ЧСк влияет на мезолимбическую дофаминергическую систему остается неясным. С учетом современных работ по гетерогенности популяций дофаминергических нейронов среднего мозга требуется более детальное изучение нейродегенерации в данной модели [14].

Вместе с тем, во многих работах ставится вопрос о локальности повреждений в 6-ГДА модели паркинсонизма. Так, были получены данные об изменении уровня дофамина в контралатеральном стриатуме [15, 12 ] при введении 6-ГДА в ЧСк, что рассматривают как свидетельство перекрестной дофаминергической иннервации и взаимодействия разных дофаминергических путей.

Поскольку нейродегенеративный процесс при БП у человека не ограничен черной субстанцией, важной для понимания механизмов данной патологии представляется оценка изменений не только в нигростриатной системе, но и в структурах, мезолимбической и мезокортикальной дофаминергических системам, формируемых нейронами ВТО [4]. В связи с этим представляет интерес изучение гибели дофаминергических нейронов в вентральной тегментальной области (ВТО) мозга при локальном введении 6-ГДА как в зоны ее иннервации – базальные ядра [16, 11 ], так и в ЧСк.

Цель исследования – охарактеризовать выраженность нейродегенеративного процесса в нигростриарной и мезолимбической дофаминовых системах и связанные с ними нарушения поведения при моделировании паркинсонизма с помощью одностороннего интранигрального введения 6-гидроксидофамина.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эксперимент проведен на 18 аутбредных крысах самцах Wistar в возрасте 3.5 мес., с массой тела 300–350 г, которые содержались в стандартных контролируемых условиях вивария при 12-ч световом цикле.

Для получения модели паркинсонического синдрома животных помещали на раму лабораторного стереотаксиса (Stoelting Co., США), скальп надрезали и через просверленные в черепе отверстия в средний мозг справа вводили 6-OHDA в дозе 12 мкг в 3 мкл 0.05% раствора аскорбиновой кислоты в соответствии с координатами атласа мозга крыс (АР = –4.8; L = 1.9; V = 8.0) [17]. Ложнооперированным животным (n = 9) вводили растворитель в том же объеме. Для анестезии применяли золетил 100 в дозе 3 мг/100 г и ксиланит в дозе 3 мг/кг внутримышечно, для премедикации использовали атропин в дозе 0.04 мг/кг подкожно за 10–15 мин до введения ксиланита.

В течение 2 нед. животным давали оправиться от операции, на 14-й и 20-й день после введения токсина животных тестировали в “Открытом поле” (ОП). Установка для изучения изменения двигательной активности и ориентировочно-исследовательского поведения представляла собой короб 97 × 97 × 40 см из жесткого ПВХ (“Открытая наука”, Россия). Поведение крыс фиксировали в течение 3-х мин, последующий анализ данных проводили с помощью системы видео наблюдения Any-Maze (Stoelting Inc., США) с программным обеспечением.

На 25-й день эксперимента крыс декапитировали и извлекали мозг для дальнейшего биохимического и гистологического анализа. Мозг разделяли на льду и в соответствии с атласом [17] выделяли префронтальную кору, область покрышки среднего мозга, дорсальный и вентральный стриатум билатерально. У части животных (по 3 из каждой группы) блок мозга, содержащий средний мозг, фиксировали в 4% формалине на PBS для иммуногистохимического анализа на тирозингидроксилазу. Полученные образцы стриатума и коры замораживали в жидком азоте и использовали для последующего измерения уровня моноаминов с помощью метода ВЭЖХ/ЭД.

Для морфологического исследования были взяты 3 образца мозга из каждой группы. Образцы пропитывали средой O.C.T. (Tissue Tek, Sakura, США) и готовили серию фронтальных срезов толщиной 10 мкм (всего 36 срезов, взятых через 20 мкм) на криостате Cryo 3 (Tissue Tek, Sakura, США), продвигаясь в каудальном направлении от трека иглы (области введения токсина). Область исследования была выбрана таким образом, чтобы захватить большую часть парабрахиального пигментированного ядра и черной субстанции. Из полученной серии срезов для подсчета нейронов брали каждый шестой срез. Для выявления тирозингидроксилазы использовали кроличьи поликлональные антитела (1 : 500, Sigma, Germany) и вторичные антитела козы к иммуноглобулинам кролика, меченные флуорохромом CF488 (1 : 150, Sigma, Germany). Срезы изучали под флуоресцентным микроскопом Eclipse NiU (Nikon; Япония). При помощи программы ImageJ (Wayne Rasband (NIH); США) оценивали количество дофаминергических нейронов в дорсальной и латеральной областях ЧСк и в области парабрахиального ядра (латерального ядра ВТО) [14].

Дополнительно для оценки повреждения латерального ядра ВТО отдельной группе животных (n = 6) через две недели после введения 6-ГДА стереотаксичеcки вводили в стриатум (АР = 0.3; L = 3.0; V = 7.0) ретроградный трейсер DiI (10 мкл 0.5% р-р в диметилсульфоксиде (Sigma, Германия)). Половина животных получала инъекции в ипсилатеральный стриатум, а половина – в противоположное полушарие. Через две недели после введения DiI животных декапитировали, мозг фискировали как описано выше и на вибратоме (Microm HM560V, Thermo Fischer, США) готовили срезы толщиной 25 мкм.

В разных зонах стриатума определяли содержание дофамина (ДА) и его основных метаболитов 3,4-дигидроксифенилуксусной кислоты (ДОФУК) и гомованилиновой кислоты (ГВК). Ткань мозга гомогенизировали в 20 объемах 0.1N HClO₄ с добавлением диоксибензиламина (0.5 нмоль/мл) в качестве внутреннего стандарта, затем центрифугировали при 10 000 g в течение 10 мин, для анализа использовали супернатант. Определение проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией на хроматографе LC-304T (BAS, West Lafayette, США) с аналитической колонкой C18 (4 × 150 мм, 4 мкм, Phenomenex, США).

Все эксперименты проводились в соответствии с международными правилами по работе с лабораторными животными, c соблюдением биоэтических норм и возможным сокращением числа использованных животных [18]. Статистическую обработку проводили с использованием программы “Statistica 10.0”. Для определения статистической значимости различий использовали факторный дисперсионный анализ (ANOVA), для сравнения между группами использовали апостериорные тесты Тьюки (Tukey test) и t-критерий Стьюдента. Различия считались значимыми при p < 0.05. Результаты представлены в виде среднего значения ± ошибка среднего (M ± SEM) и среднего значения ± стандартное отклонение (M ± SD).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Поведение. Сопоставление веса животных, получавших инъекцию 6-ГДА, с контрольными животными, выявило значимое снижение веса на 13-й день после операции (316.6 ± 35.5 г против 346.0 ± 21.3 г в контрольной группе, p < 0.05), которое нивелировалось к 19-му дню эксперимента (338.6 ± 23.9 г против 357.5 ± 21.7 г в контрольной группе). Тестирование в ОП позволило обнаружить изменения в поведении экспериментальных крыс относительно контрольных в оба исследованных срока после операции: на 14-й и 20-й день (табл. 1). Было показано, что введение токсина привело к значимому снижению длины пройденного в ОП пути (F(1,16) = 38.07; p < 0.01), уменьшению количества стоек (F(1,16) = 11.88; p < 0.05) и увеличению количества спонтанных вращений вправо (F(1,16) = 7.57; p < 0.05). Для животных экспериментальной группы была характерна латерализация отдельных двигательных действий, проявившаяся в увеличенном числе спонтанных вращений вправо по сравнению с числом вращений влево, что характерно для унилатерального разрушения дофаминергической иннервации [19]. Стоит отметить, что различия в количестве вращений в сторону повреждения были более выражены у экспериментальной группы при первом тестировании, а при втором значимых отличий по этому параметру уже не выявлялось (табл. 1).

Гистология. Подсчет нейронов в компактной части черной субстанции показал значимое снижение плотности нейронов в ЧСк и парабрахиальном ядре ВТО (F(2,4) = 10.18; p = 0.046). При этом более выраженное снижение наблюдалось в дорсолатеральной части, включающей нейроны ЧСк (см. рис. 1, 2). Так, у животных, которым вводили 6-ГДА, на 23-й день полностью отсутствовали нейроны в дорсолатеральной части, а в медиальной части (ПБЯ) их количество снижалось только на 58%. Следовательно, токсическое воздействие 6-ГДА распространялось не только на дорсолатеральную часть ЧСк, куда вводился токсин, но и на структуры ВТО. Полученные результаты подтверждались качественной оценкой изменений на срезах черной субстанции после ипсилатерального введения в стриатум животных, получавших 6-ГДА ретроградного трейсера DiI (рис. 1) – наблюдалась потеря меченых DiI нейронов в парабрахиальном ядре ВТО и полное исчезновение метки в ЧСк.

Рис. 1.

Повреждение нейронов компактной части черной субстанции (ЧСк) и парабрахиального ядра вентрального поля покрышки среднего мозга (ПБЯ) при одностороннем интранигральном введении 6-ГДА. а, б – Иммуногистохимическое выявление тирозингидроксилазы (TH). в, г – Выявление ретроградно меченых нейронов при введении красителя DiI на контралатеральной повреждению стороне (в) и на стороне введения 6-ГДА (г). ЧСк – компактная часть черной субстанции, ЧСк-Л –латеральная область компактной части черной субстанции, ЧСк-В – вентральная область, ЧСк-Д – дорсальная область и ПБЯ – область парабрахиального пигментированного ядра ВТО. Справа – сторона введения 6-ГДА.

Рис. 2.

Подсчет количества нейронов в разных отделах покрышки среднего мозга на 23-й день после введения 6-ГДА. * p < 0.05 по сравнению с группой контроля по критерию Стьюдента. Остальные обозначения, как на рис. 1.

Катехоламины. Анализ содержания дофамина и его основных метаболитов – 3,4-диоксифенил-уксусной кислоты (ДОФУК) и гомованилиновой кислоты (ГВК) – в различных областях стриатума выявил их значимое снижение только со стороны, ипсилатеральной по отношению к введению токсина в черную субстанцию (F(3,12) = 47.89; p < 0.001 для дорсальной части; F(3,11) = 3.57; p < 0.05 для вентральной). С контралатеральной стороны изменений метаболизма дофамина обнаружено не было (F(2,13) = 1.31; p = 0.29 для дорсальной части; F(2,13) = 2.80; p = 0.09 для вентральной) (табл. 2). Выявленные изменения были более выраженными в дорсальной части ипсилатерального стриатума (рис. 3): снижение уровня дофамина на 88% (p < 0.001), ДОФУК на 88% (p < 0.001), ГВК на 80% (p < 0.001). В вентральной части, включающей прилежащее ядро, было обнаружено значимое снижение уровня дофамина на 65% (p < 0.01) но ДОФУК (62% от контрольных значений, р = 0.07) и ГВК (88% от контрольных значений, р = 0.59) по отношению к значениям контрольной группы не изменялись.

Рис. 3.

Измерение содержания дофамина в разных областях стриатума животных на 23-й день после введения 6-ГДА. Сбоку схематично предcтавлено выделение зон стриатума по атласу (AP = +1 мм; ([17]): 1 – левый дорсальный, 2 – правый дорсальный, 3 – левый вентральный, 4 – правый вентральный, * p < 0.05 по сравнению с группой контроля по критерию Стьюдента.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

6-ГДА – гидроксилированный аналог естественного нейротрансмиттера дофамина – один из самых распространенных нейротоксинов, используемых в моделях дегенерации центральных катехоламинергических проекций [6]. Несмотря на более чем 50-летнюю историю изучения 6-ГДА [8], вопросы локальности повреждений, временной динамики развития патологии и роли различных патологических каскадов в развитии 6-ГДА-индуцированных повреждений остаются нерешенными [20, 21]. Так, в большинстве работ исследователи концентрируются на гибели нейронов в компактной части черной субстанции и оценивают повреждения в отдаленные сроки после введения токсинов [22], что не позволяет оценить динамику развития нейродегенерации. В качестве основных механизмов токсичности 6-ГДА предполагают его аутоокисление и ферментативное окисление моноаминоксидазами, что ведет к образованию хинонов, перекиси водорода, суперкосид-аниона и гидроксильных радикалов [6, 23]. Интересно, что в физиологических условиях в результате окисления дофамина образуется хиноновая, окисленная форма 6-ГДА, что послужило поводом для гипотезы о роли эндогенного 6-ГДА в патогенезе БП [24]. Большинство авторов называют апоптоз основным механизмом гибели нейронов ЧСк при введении 6-ГДА, однако показаны и другие типы гибели клеток – некроз и аутофагия [20, 25 ], а их соотношение вероятно зависит от активации механизмов нейровоспаления.

Несмотря на быстрое действие 6-ГДА, характеризующееся гибелью нейронов в течение 12 ч после введения в черную субстанцию и снижением дофамина в течение 2–3 дней [26], динамика развития моторной симптоматики в данной модели оказывается значительно более медленной. При этом, на 3–4 неделю приходятся основные функциональные перестройки в сети базальных ганглиев, выраженные в усилении активности ретикулярной части черной субстанции и бледного шара. Известно, что двигательная активность также достигает минимума к 3–4 нед. после операции [27, 28]. В данном исследовании было показано, что на этих сроках горизонтальная и вертикальная активность у животных опытной группы существенно ниже контрольных значений, но у животных не обнаруживалось птоза, тремора, или выраженной ригидности, характерных для поздних стадий паркинсонизма [5]. Ранее, на модели введении 6-ГДА в область ЧСк нами была проведена оценка не только двигательной дисфункции, но и психоэмоционального состояния животных в тесте “Сужающаяся дорожка” с присвоением баллов по шкале невротизации [29, 30]. Было показано наличие “нестандартной” поведенческой активности крыс с моделью БП, в том числе стереотипных движений головой, интенсивного обнюхивания и лизания установки, стереотипных жевательных движений, длительных замираний и др. Такие животные либо вовсе отказывались от поступательного движения, либо преодолевали расстояние до укрытия за значительно более длительное время, чем контрольные. Полученные данные свидетельствовали о развитии у экспериментальных крыс неврозо-подобного состояния. В соответствие с этим, представляло интерес охарактеризовать выраженность нарушений дофаминергической системы мозга крыс именно на сроке 21–25 дней после токсического повреждения ЧСк.

Морфологический анализ выявил не только полное исчезновение дофаминовых нейронов в ЧСк, но и значительное снижение их количества в парабрахиальном ядре ВТО, примыкающем к дорсальному рогу ЧСк [14]. Это совпадает с литературными данными по другим способам введения 6-ГДА [11], где также наблюдается гибель нейронов ВТО при выраженном повреждении ЧСк (>70%). Можно предположить, что, поскольку гибель нейронов в области введения 6-ГДА сопровождается активацией микроглии, это ведет к усилению нейродегенеративного процесса, распространяющегося и на относительно удаленные от места введения токсина области. К сожалению, для характеристики уязвимости различных зон покрышки к 6-ГДА-индуцированным повреждениям недостаточно анализа в конечной точке и необходим более детальный анализ ранних стадий развития патологии.

Полученные данные по уровню дофамина и его метаболитов в разных областях стриатума свидетельствуют о том, что в правом дорсальном стриатуме, судя по уровню дофамина, наблюдается полное исчезновение дофаминергической иннервации. Интересно, что нарушения иннервации проявляются и в вентральном стриатуме справа, что дополнительно подтверждает повреждение ВТО, проецирующейся в данную область [14].

Нейроанатомически обнаруживается до 5% нейронов черной субстанции (в том числе – дофаминергических), проецирующихся в контралатеральный стриатум [31]. Недавно было продемонстрировано высвобождение дофамина в контралатеральном стриатуме перекрестными нигростриарными проекциями в ответ на стимуляцию черной субстанции [15]. Предполагают, что контралатеральные нигростриарные проекции участвуют в пластических перестройках в базальных ядрах при повреждении ЧС в эксперименте и при болезни Паркинсона [15]. В то же время, локальное повреждение области покрышки среднего мозга справа в нашем эксперименте значимо не влияло на метаболизм дофамина с контралатеральной стороны: уровень дофамина и ДОФУК не отличается значимо от контрольных животных. Очевидно, что перекрестная дофамин-ергическая иннервация практически не сказывалась на проявлении нейропатологии в данной модели. В других исследованиях также было показано, что при гибели нейронов более 75% последующей реиннервации стриатума не наблюдается [32].

Сопутствующая активация микроглии также проявляется наиболее активно в первую неделю и к 3-й неделе уже сходит на нет [13]. В данном исследовании мы наблюдаем конечный результат совершившегося патологического процесса. Тем не менее, обнаруженные изменения ВТО в 6-ГДА-индуцированной модели заслуживают особого внимания, поскольку подтверждают результаты морфологических исследований post mortem при болезни Паркинсона [33]. Подобные нарушения, как правило, рассматривают как одну из причин немоторной симптоматики БП [34]. Таким образом, ранее выявленные нарушения эмоционального состояния у крыс с 6-ГДА-индуцированной моделью БП [9, 29, 30] могут быть связаны с показанным в настоящей работе повреждением вентрально-тегментальной области мозга.

ВЫВОДЫ

1. Одностороннее введение 12 мкг 6-ГДА в черную субстанцию через 3 недели приводило к гибели дофаминовых нейронов ЧСк и резкому падению содержания дофамина на 88% в дорсальном ипсилатеральном стриатуме, а также снижению общей двигательной активности у экспериментальных животных.

2. Гибель дофаминовых нейронов под действием 6-ГДА отмечалась также в вентральной тегментальной области, но в меньшей степени (снижение числа нейронов в парабрахиальном ядре ВТО на 58%). Уровень дофамина в вентральном стриатуме на стороне повреждения снижался на 65%.

3. Введение 6-ГДА в ЧСк повреждает структуры нигростриарной и мезолимбической дофаминовых систем мозга ипсилатерально. При этом участия межполушарных (перекрестных) нигростриарных дофаминергических проекций в восполнении дефицита медиатора на исследуемом сроке не выявлено.