Нейрохимия, 2020, T. 37, № 3, стр. 208-219
Преобладание ноотропного или анксиолитического эффекта пептидов селанк, семакс и ноопепт в зависимости от пути их введения мышам BALB/c и С57BL/6
Е. В. Васильева 1, Е. А. Кондрахин 1, А. А. Абдуллина 1, Р. М. Салимов 1, Г. И. Ковалев 1
1 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение
“НИИ фармакологии им. В.В. Закусова”
Москва, Россия
Поступила в редакцию 06.01.2020
После доработки 28.03.2020
Принята к публикации 09.04.2020
Аннотация
В тесте “закрытый крестообразный лабиринт” (ЗКЛ) проведено сравнение влияния внутрибрюшинного и интраназального пути введения в течение 5 дней пептидов селанк (300 мкг/кг/день), ноопепт (1 мкг/кг/день), семакс (0.6 мкг/кг/день), проявляющих анксиолитический и ноотропный эффекты, на поведение мышей инбредных линий BALB/c и С57BL/6, а также на NMDA- и mGluII-рецепторы мозга. У мышей линии BALB/c при обоих путях введения семакса, ноопепта, селанка улучшалась исследовательская активность и снижалась тревожность, но при внутрибрюшинном введении ярче проявлялся анксиолитический эффект, а при интраназальном – ноотропный. У мышей линии C57BL/6 семакс, ноопепт и селанк при обоих путях введения не влияли на эффективность исследовательского поведения, а также на тревожность, за исключением семакса, проявившего больший анксиогенный эффект при внутрибрюшинном введении по сравнению с интраназальным. У мышей линии BALB/c внутрибрюшинное введение ноопепта и интраназальное введение селанка увеличивало плотность NMDA-рецепторов в гиппокампе, интраназальное введение ноопепта и семакса – уменьшало, изменений характеристик mGluII-рецепторов не происходило. У мышей линии C57BL/6 внутрибрюшинное введение семакса и интраназальное введение ноопепта снижало количество мест связывания NMDA-рецепторов, а внутрибрюшинное введение ноопепта и оба пути введения семакса уменьшали плотность mGluII-рецепторов в коре мозга.
ВВЕДЕНИЕ
Селанк (треонил-лизил-пролил-аргинил-пролил-глицил-пролил-диацетат), семакс (метионил-глутамил-гистидил-фенилаланил-пролил-глицил-пролин), ноопепт (этиловый эфир N-фенилацетил–L–пролилглицина) относятся к ноотропным препаратам пептидной природы, при этом они оказывают также нейропротективные и анксиолитические свойства. Несмотря на общность фармакологических эффектов, эти средства обладают различиями в фармакокинетике и фармакодинамике, проявляют специфические для каждого свойства. Следует также отметить, что селанк и семакс в клинике применяются в виде назальных капель, а ноопепт – в виде таблеток.
Ранее нами было установлено, что инбредные мыши BALB/c характеризуются в сравнении с особями линии C57BL/6 меньшей эффективностью исследовательского поведения, большей тревожностью и двигательной активностью в условиях незнакомой обстановки крестообразного лабиринта [1], меньшей плотностью NMDA- и mGluII-рецепторов в гиппокампе и коре мозга, соответственно [2–4]. Этот факт позволил использовать мышей BALB/c как модель когнитивного дефицита и/или состояния повышенной тревожности и двигательной активности при сравнении с мышами C57BL/6. Для большинства известных ноотропов с различной химической структурой специфический эффект после субхронического введения сопровождается ростом плотности глутаматных рецепторов NMDA-типа в гиппокампе [5], в свою очередь, в процесс регуляции эмоционального состояния, особенно тревожности, активно вовлечены mGluII-рецепторы [6]. Несмотря на то, что селанк, ноопепт и семакс уже доступны на фармацевтическом рынке, нейрорецепторный компонент их действия до сих пор описан скудно. В связи с вышесказанным для исследования механизмов исследуемых препаратов в качестве мишени ноотропной составляющей были выбраны NMDA-рецепторы в гиппокампе, анксиолиотической – mGluII-рецепторы в коре.
Таким образом, в данном исследовании было проведено сравнение эффектов селанка, ноопепта и семакса на поведенческие и рецепторные характеристики после внутрибрюшинного (в/б) и интраназального (и/н) введений препарата мышам инбредных линий C57BL/7 и BALB/c, различающихся как по фенотипу поведения в условиях незнакомой обстановки в закрытом крестообразном лабиринте, так и по исходному состоянию NMDA- и mGluII-рецепторов мозга.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Животные
Исследования проводили на самцах мышей линий BALB/c и С57BL/6 массой 25–30 г (питомник “Столбовая”), которых содержали в виварии ФГБНУ “НИИ фармакологии имени В.В.Закусова” в стандартных условиях со свободным доступом к воде и корму ad libitum, по 15 особей в клетке в течение 1-й нед. до начала эксперимента, на стандартной диете при 12-часовом световом режиме. Содержание животных соответствовало правилам лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ 351.000.3-96 и 51000.4-96), Приказу МЗ и СР РФ от 23 августа 2010 г. № 708н “Об утверждении Правил лабораторной практики”. Эксперименты проводили с 10 до 16 ч, при этом животных в день эксперимента тестировали поочередно из каждой группы, равномерно распределяя влияние фактора времени на поведение животных в разных группах. Проведение экспериментов одобрено Комиссией по биомедицинской этике ФГБНУ “НИИ фармакологии им. В.В. Закусова”. Животным посредством в/б и и/н (10 мкл, с использованием микропипетки фирмы Eppendorf) инъекций в течение 5 дней (субхроническое введение) ежедневно один раз в сутки вводили физиологический раствор (контрольная группа – NaCl, 0.9%), либо препараты, растворенные в физрастворе (опытные группы).
Тест “закрытый крестообразный лабиринт” (ЗКЛ) применяли через 2 ч после последней инъекции изучаемых веществ. Сразу после окончания тестирования мышей декапитировали, головной мозг извлекали на льду и выделяли префронтальную кору и гиппокамп по общепринятой схеме [7] для последующего проведения радиолигандного анализа.
Вещества
В экспериментах использовали при в/б и и/н путях введения дозу селанка (ЗАО ИНПЦ “Пептоген”, ИМГ РАН) 300 мкг/кг/день, ноопепта (ФГБНУ “НИИ фармакологии им. В.В. Закусова”) 1 мг/кг/день, семакса (ОХФАВ ИМГ РАН) 0.6 мг/кг/день, при которых проявляются как ноотропный, так и анксиолитический эффекты [8, 9].
Для изучения рецепторного связывания использовали [3H](+)МК-801 (210 Кюри/ммоль) – селективный антагонист NMDA-рецепторов, [3H]LY354740 (42 Кюри/ммоль) – селективный антагонист mGluII-рецепторов соответственно. Оба лиганда были синтезированы д. х. н. Ю.А. Золотаревым в ОХФАВ ИМГ РАН (зав. отделом – акад. РАН Н.Ф. Мясоедов). Остальные реактивы были приобретены в коммерческих источниках.
Изучение поведения
Тест ЗКЛ является неинвазивным методом и основан на врожденной способности каждого животного к различной степени эффективности исследовательского поведения в новой обстановке [3, 10, 11]. Закрытый крестообразный лабиринт состоял из 4-х пластмассовых закрытых пустых отсеков, соединенных с центральным отсеком с помощью входных отверстий. Мышь помещали в центральный отсек лабиринта и в полуавтоматическом режиме с помощью программы Behavset регистрировали последовательность и продолжительность ее переходов из одного рукава в другой. Сессия завершалась после 12-ти визитов в боковые отсеки. Последующий анализ данных позволял выделить ряд показателей эффективности исследовательского поведения, тревожности и двигательной активности. Оценивали показатели тревожности (латентный период первого захода в боковой отсек и время пребывания в нем, F_ChTm и F_GlTm), двигательной активности (общее время пребывания в центральном и боковых отсеках, T_ChTm и T_GlTm) и спонтанной ориентации (длина первого полного обхода боковых отсеков – F_PtrN и количество полных обходов за сессию – PatrN) [12, 13].
Радиолигандный анализ
NMDA-рецепторы. Выделение плазматических мембран с NMDA-рецепторами гиппокампа. Выделение плазматических мембран гиппокампа проводили по модифицированным методам [14, 15]. После декапитации ткань немедленно замораживали в жидком азоте и хранили в низкотемпературном холодильнике при –80°С. В день эксперимента гиппокампы размельчали в гомогенизаторе Поттера “тефлон-стекло” в 10 объемах буфера № 1 (5 мМ НЕРЕS, 4.5 мМ Tris, 0.32 M сахароза, рН 7.6). Гомогенат разбавляли 50 объемами буфера № 2 (5 мМ НЕРЕS, 4.5 мМ Tris, рН 7.6) и центрифугировали при 1000 g 10 мин на ультрацентрифуге “Optima L-70K” (“Beckman Coulter”). Супернатант сливали и вновь центрифугировали при 25000 g 20 мин. Для увеличения выхода белка эту операцию проводили дважды. Полученный осадок ресуспендировали в 50 объемах буфера № 2 и центрифугировали при 8000 g 20 мин. Супернатант и верхний коричневый осадочный слой сливали и центрифугировали при 25 000 g 20 мин. Осадок ресуспендировали в 50 объемах буфера № 3 (5 мМ НЕРЕS, 4.5 мМ Tris, 1 мМ Na4EDTA, рН 7.6) и троекратно центрифугировали при 25 000 g 20 мин. Полученный осадок ресуспендировали в 50 объемах буфера № 2 и однократно центрифугировали при 25000 g 20 мин. Конечный осадок сохраняли в 5 объемах буфера № 2 и замораживали в криопробирках в жидком азоте. В день анализа ткань размораживали, разбавляли в 10 объемах буфера № 2, центрифугировали при 25 000 g 20 мин. Осадок ресуспендировали в необходимом количестве буфера № 2.
Радиолигандный анализ NMDA-рецепторов. Инкубационная смесь (конечный объем 0.5 мл) содержала 50 мкл [3H](+)МК-801, 250 мкл буфера и 200 мкл белковой суспензии мембран, для неспецифического связывания добавляли 50 мкл немеченного лиганда (+)МК-801, 1 мМ). Реакционную смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч.
mGluII-рецепторы. Выделение плазматических мембран с mGluII-рецепторами префронтальной коры мозга. Выделение mGluIIR-рецепторов проводили по методу [16]. После декапитации ткань немедленно замораживали в жидком азоте и хранили в низкотемпературном холодильнике при ‒80°С. В день эксперимента ткань мозга размельчали в гомогенизаторе Поттера “тефлон-стекло” в 25 объемах буфера (50 мМ Tris-HCl, pH 7.1). Гомогенат центрифугировали при 48 000 g 10 мин. Полученный осадок гомогенизировали в буфере (50 мМ Tris-HCl, pH 7.1) и инкубировали при 37°С 10 мин, затем центрифугировали при 48 000 g 10 мин. Осадок ресуспендировали в 5 объемах буфера и замораживали в криопробирках при –80°С. В день эксперимента мембраны размораживали и центрифугировали 3 раза в буфере (50 мМ Tris-HCl, 2 мМ MgCl2, pH 7.4) 48 000 g 10 мин. Осадок ресуспендировали в необходимом количестве буфера (50 мМ Tris-HCl, 2 мМ MgCl2, pH 7.4). Концентрация белка в образцах мембран составляла 0.25 мг/мл.
Радиолигандный анализ mGluII-рецепторов. Инкубационная смесь (конечный объем 0.5 мл) содержала 50 мкл [3H]LY 354740, 200 или 250 мкл буфера (50 мМ Tris-HCl, 2 мМ MgCl2, pH 7.4) и 200 мкл белковой суспензии мембран, для неспецифического связывания добавляли 50 мкл немеченого лиганда (глутамат). Реакционную смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч.
Жидкостно-сцинтилляционная спектрометрия
По окончании инкубации пробы фильтровали через стекловолокнистые фильтры GF/B (“Whatman”), предварительно смоченные в 0.3% полиэтиленимине в течение 2 ч при комнатной температуре. Каждую пробирку промывали два раза холодным буфером, затем фильтры промывали два раза тем же объемом буфера. Фильтры просушивали на воздухе, переносили в сцинтилляционные флаконы и заливали 5 мл сцинтилляционной жидкости на основе толуола (4 г PPO, 0.2 г POPOP на 1 л толуола). Радиоактивность проб определяли на счетчике Tri-Carb 2900TR (“Perkin Elmer”) с эффективностью счета 42–46%. Концентрацию белка измеряли по стандартной методике Лоури.
Обработка и представление результатов
Cтaтиcтичecкую oбpaбoтку экcпepимeнтaльных дaнных пpoвoдили c пoмoщью пpoгpaммы Statistica 6.0. с привлечением мeтoдов пapaмeтpичecкoй и нeпapaмeтpичecкoй статистики. Для анализа данных поведенческого теста применяли 3-х факторный дисперсионный анализ ANOVA, в котором независимыми переменными (факторами) являлись линия мышей (BALB/c или C57BL/6), путь введения (внутрибрюшинно или интраназально), тип терапии (растворитель или пептид). Межгрупповое сравнение согласно факторному плану (planned comparison) выполняли с помощью анализа контрастов ANOVA.
Результаты экспериментов по радиорецепторному связыванию ex vivo оценивали с помощью пpoгpaммы GraphPad Prism 4. Рассчитанные величины Кd и Bmax отражают степень сродства рецептора к лиганду (нМ) и количество мест связывания лиганда (фмоль/мг белка), соответственно. Для анализа насыщения и получения характеристик связывания Bmax и Kd измеряли специфическое связывание для NMDA-рецепторов – от 1.25 до 20 нМ, для mGluII-рецепторов – от 12.5 до 200 нМ. Специфическое связывание рассчитывали как разницу между общим и неспецифическим связыванием. Для построения кривых насыщения радиоактивных лигандов каждая концентрация исследуемого вещества была взята в 2-х повторностях.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Поведение
Как видно из табл. 1–3, все пептиды после и/н введения мышам линии BALB/c оказывают ноотропное действие, что проявляется в улучшении поведения патрулирования, а именно, уменьшении числа заходов при первом патрулировании (F_PtrN), а после введения ноопепта и семакса – и в увеличении общего числа патрулирований лабиринта (PatrlN). Такой результат отсутствовал у мышей линии C57BL/6 за исключением увеличении общего числа патрулирований лабиринта (PatrlN) после внутрибрюшинного введения селанка.
Таблица 1.
Факторы | Параметры | |||||||||||||||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
F_PtrN | PatrlN | F_ChTm | F_GlTm | T_ChTm | T_GlTm | |||||||||||
Df | F | p | F | p | F | p | F | p | F | p | F | p | ||||
Линия мышей | 1 | 1.79 | 0.18 | 0.83 | 0.37 | 15.57 | <0.00 | 10.74 | <0.00 | 7.12 | 0.01 | 19.40 | <0.00 | |||
Путь введения | 1 | 0.04 | 0.84 | 3.15 | 0.08 | 17.78 | <0.00 | 3.59 | 0.06 | 19.42 | <0.00 | 22.17 | <0.00 | |||
Вещество | 1 | 4.83 | 0.03 | 1.37 | 0.24 | 3.86 | 0.05 | 0.02 | 0.89 | 0.51 | 0.48 | 0.05 | 0.83 | |||
Линия*Путь введения | 1 | 0.02 | 0.90 | 0.81 | 0.37 | 5.67 | 0.02 | 2.81 | 0.10 | 0.27 | 0.61 | 14.43 | <0.00 | |||
Линия*Вещество | 1 | 3.49 | 0.06 | 4.42 | 0.04 | 7.69 | 0.01 | 0.01 | 0.94 | 0.52 | 0.47 | 0.10 | 0.75 | |||
Путь введения*Вещество | 1 | 0.11 | 0.74 | 0.00 | 0.97 | 0.16 | 0.69 | 0.01 | 0.94 | 0.02 | 0.88 | 1.94 | 0.17 | |||
Линия*Путь введения*Вещество | 1 | 4.81 | 0.03 | 2.25 | 0.14 | 0.02 | 0.89 | 0.33 | 0.57 | 1.33 | 0.25 | 2.16 | 0.14 | |||
№ группы | Линия | Путь введения | Вещество | N | m | ±S.E.M. | m | ±S.E.M. | m | ±S.E.M. | m | ±S.E.M. | m | ±S.E.M. | m | ±S.E.M. |
1 | BALB/c | в/б | Физраствор | 11 | 6.2 | 0.4 | 2.0 | 0.2 | 7.7 | 1.0 | 12.9 | 6.6 | 59.0 | 6.1 | 88.8 | 14.7 |
2 | BALB/c | в/б | Селанк | 14 | 5.5 | 0.5 | 1.7 | 0.2 | 4.5& | 1.2 | 14.8 | 7.4 | 64.6 | 6.9 | 119.2 | 16.5 |
3 | BALB/c | и/н | Физраствор | 15 | 6.8 | 0.4 | 1.7 | 0.2 | 12.6 | 1.0 | 14.8 | 6.3 | 43.6 | 5.9 | 108.8 | 14.2 |
4 | BALB/c | и/н | Селанк | 15 | 5* | 0.4 | 1.8 | 0.2 | 9& | 1.0 | 10.9 | 6.3 | 38.1 | 5.9 | 80.5 | 14.2 |
5 | C57BL/6 | в/б | Физраствор | 16 | 5.9 | 0.4 | 1.6 | 0.2 | 4.5 | 1.0 | 37.9 | 6.3 | 53.5 | 5.9 | 191.1 | 14.2 |
6 | C57BL/6 | в/б | Селанк | 15 | 5.0 | 0.4 | 2.1** | 0.1 | 5.4 | 1.0 | 35.3 | 6.1 | 43.1 | 5.7 | 184.9 | 13.7 |
7 | C57BL/6 | и/н | Физраствор | 15 | 5.2 | 0.4 | 1.5 | 0.2 | 6.2 | 1.0 | 19.2 | 6.3 | 32.6 | 5.9 | 103.2 | 14.2 |
8 | C57BL/6 | и/н | Селанк | 15 | 5.9 | 0.4 | 1.7 | 0.2 | 6.4 | 1.0 | 21.2 | 6.3 | 30.8 | 5.9 | 98.5 | 14.2 |
Таблица 2.
Факторы | Параметры | |||||||||||||||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
F_PtrN | PatrlN | F_ChTm | F_GlTm | T_ChTm | T_GlTm | |||||||||||
Df | F | p | F | p | F | p | F | p | F | p | F | p | ||||
Линия мышей | 1 | 1.00 | 0.32 | 2.84 | 0.09 | 5.43 | 0.02 | 9.83 | <0.01 | 0.05 | 0.83 | 7.53 | <0.01 | |||
Путь введения | 1 | 1.39 | 0.24 | 2.67 | 0.10 | 9.44 | <0.01 | 0.05 | 0.82 | 2.22 | 0.14 | 0.05 | 0.82 | |||
Вещество | 1 | 2.11 | 0.15 | 8.25 | <0.01 | 6.81 | 0.01 | 1.48 | 0.23 | 0.10 | 0.76 | 2.22 | 0.14 | |||
Линия*Путь введения | 1 | 2.39 | 0.12 | 1.48 | 0.23 | 5.54 | 0.02 | 27.80 | <0.01 | 3.44 | 0.07 | 1.19 | 0.28 | |||
Линия*Вещество | 1 | 3.20 | 0.08 | 2.11 | 0.15 | 1.68 | 0.20 | 21.37 | <0.01 | 1.12 | 0.29 | 3.15 | 0.08 | |||
Путь введения*Вещество | 1 | 3.74 | 0.06 | 5.13 | 0.03 | 0.03 | 0.86 | 0.15 | 0.70 | 1.75 | 0.19 | 0.31 | 0.58 | |||
Линия*Путь введения*Вещество | 1 | 2.92 | 0.09 | 3.30 | 0.07 | 3.89 | 0.05 | 0.96 | 0.33 | 0.54 | 0.46 | 2.24 | 0.14 | |||
№ группы | Линия | Путь введения | Вещество | N | m | ±S.E.M. | m | ±S.E.M. | m | ±S.E.M. | m | ±S.E.M. | m | ±S.E.M. | m | ±S.E.M. |
1 | BALB/c | в/б | Физраствор | 81 | 5.7 | 0.1 | 1.9 | 0.1 | 12.3 | 0.7 | 9.0 | 0.7 | 38.3 | 1.6 | 86.8 | 3.8 |
2 | BALB/c | в/б | Ноопепт | 13 | 5.8 | 0.4 | 1.9 | 0.1 | 5.7 & | 1.7 | 6.5 # | 1.8 | 43.9 | 4.0 | 91.2 | 9.5 |
3 | BALB/c | и/н | Физраствор | 10 | 6.5 | 0.4 | 1.5 | 0.1 | 11.1 | 1.9 | 16.9 | 2.0 | 39.0 | 4.6 | 87.4 | 10.9 |
4 | BALB/c | и/н | Ноопепт | 8 | 4.8 * | 0.5 | 2.3 ** | 0.2 | 8.6 | 2.1 | 11 # | 2.2 | 41.2 | 5.2 | 79.2 | 12.2 |
5 | C57BL/6 | в/б | Физраствор | 47 | 5.0 | 0.2 | 2.1 | 0.1 | 3.1 | 0.9 | 14.9 | 0.9 | 34.6 | 2.1 | 96.0 | 5.0 |
6 | C57BL/6 | в/б | Ноопепт | 14 | 5.1 | 0.4 | 2.2 | 0.1 | 4.1 | 1.6 | 21.4## | 1.7 | 38.3 | 3.9 | 104.1 | 9.2 |
7 | C57BL/6 | и/н | Физраствор | 12 | 5.8 | 0.4 | 1.8 | 0.1 | 11.9 | 1.7 | 7.4 | 1.8 | 49.9 | 4.2 | 91.1 | 9.9 |
8 | C57BL/6 | и/н | Ноопепт | 9 | 5.8 | 0.4 | 2.0 | 0.2 | 7.9 | 2.0 | 15.3## | 2.1 | 41.9 | 4.9 | 126.5 | 11.5 |
* Значимое отличие от группы 3; F(1,186) = 7.92, p = 0.005; # значимое отличие от групп 1 и 3; F(1,186) = 5.56, p = 0.019; ** значимое отличие от группы 3; F(1,186) = 11.8, p = 0.001; ## значимое отличие от групп 5 и 7; F(1,186) = 17.83, p < 0.001; & значимое отличие от группы 1; F(1,186) = 13.64, p < 0.001.
Таблица 3.
Факторы | Параметры | |||||||||||||||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
F_PtrN | PatrlN | F_ChTm | F_GlTm | T_ChTm | T_GlTm | |||||||||||
Df | F | p | F | p | F | p | F | p | F | p | F | p | ||||
Линия мышей | 1 | 58.1 | <0.01 | 18.55 | <0.01 | 58.40 | <0.01 | 32.80 | <0.01 | 7.23 | <0.01 | 9.17 | <0.01 | |||
Путь введения | 1 | 49.25 | <0.01 | 34.90 | <0.01 | 127.60 | <0.01 | 52.23 | <0.01 | 59.82 | <0.01 | 2.07 | 0.15 | |||
Вещество | 1 | 4.64 | 0.03 | 1.58 | 0.21 | 0.90 | 0.33 | 8.37 | <0.01 | 1.86 | 0.17 | 0.00 | 0.99 | |||
Линия*Путь введения | 1 | 46.62 | <0.01 | 10.70 | <0.01 | 22.20 | <0.01 | 0.34 | 0.56 | 0.31 | 0.58 | 0.50 | 0.48 | |||
Линия*Вещество | 1 | 7.13 | 0.01 | 6.53 | 0.01 | 1.60 | 0.20 | 0.60 | 0.44 | 0.93 | 0.34 | 0.12 | 0.73 | |||
Путь введения*Вещество | 1 | 0.21 | 0.65 | 0.95 | 0.33 | 6.60 | 0.01 | 7.64 | <0.01 | 2.46 | 0.12 | 0.66 | 0.42 | |||
Линия*Путь введения*Вещество | 1 | 0.41 | 0.52 | 0.32 | 0.57 | 2.10 | 0.15 | 0.86 | 0.36 | 3.07 | 0.08 | 0.07 | 0.79 | |||
№ группы | Линия мышей |
Путь введения | Вещество | N | m | ±S.E.M. | m | ±S.E.M. | m | ±S.E.M. | m | ±S.E.M. | m | ±S.E.M. | m | ±S.E.M. |
1 | BALB/c | в/б | Физраствор | 81 | 5.7 | 0.17 | 1.90 | 0.05 | 12.33 | 1.18 | 9.02 | 1.24 | 38.32 | 2.02 | 86.81 | 3.92 |
2 | BALB/c | в/б | Семакс | 14 | 4.8 | 0.4 | 2.1 | 0.1 | 5.3 | 2.8 | 5.9 | 3.0 | 41.1 | 4.9 | 87.8 | 9.4 |
3 | BALB/c | и/н | Физраствор | 20 | 9.2 | 0.3 | 1.1 | 0.1 | 31.8 | 2.4 | 23.5 | 2.5 | 70.5 | 4.1 | 93.7 | 7.9 |
4 | BALB/c | и/н | Семакс | 20 | 7.8* | 0.3 | 1.5** | 0.1 | 37.9& | 2.4 | 14.1&& | 2.5 | 54.9 | 4.1 | 88.8 | 7.9 |
5 | C57BL/6 | в/б | Физраствор | 47 | 5.0 | 0.2 | 2.1 | 0.1 | 3.1 | 1.6 | 14.9 | 1.6 | 34.6 | 2.6 | 96.0 | 5.1 |
6 | C57BL/6 | в/б | Семакс | 13 | 5.1 | 0.4 | 2.0 | 0.1 | 4.9 | 3.0 | 17.6 | 3.1 | 33.0 | 5.0 | 103.6 | 9.8 |
7 | C57BL/6 | и/н | Физраствор | 20 | 5.0 | 0.3 | 1.9 | 0.1 | 12.0 | 2.4 | 34.5 | 2.5 | 54.0 | 4.1 | 113.4 | 7.9 |
8 | C57BL/6 | и/н | Семакс | 24 | 5.2 | 0.3 | 1.8 | 0.1 | 17.5& | 2.2 | 24.6&& | 2.3 | 53.4 | 3.7 | 109.4 | 7.2 |
У мышей линии BALB/c ноопепт и селанк при обоих путях введения оказывают анксиолитическое действие, что проявляется в уменьшении времени пребывания в центре при помещении в лабиринт (F_ChTm) и времени пребывания в тупике лабиринта при первом визите (F_GlTm). Семакс при и/н введении оказывал на данные показатели смешанное действие, увеличивая время пребывания в центре при помещении в лабиринт (F_ChTm) и уменьшая время пребывания в тупике лабиринта при первом визите (F_GlTm). У мышей линии C57BL/6 ноопепт при обоих путях введения оказывал анксиогенное действие (увеличение времени пребывания в тупике лабиринта при первом визите), семакс оказывал смешанное действие, увеличивая время пребывания в центре при помещении в лабиринт и уменьшая время пребывания в тупике лабиринта при первом визите, а селанк не оказывал влияния на данные показатели.
Влияния изученных пептидов на общую двигательную активность в данном тесте (показатели T_ChTm и T_GlTm) выявлено не было.
Радиорецепторный анализ ex vivo
В радиолигандном анализе ex vivo оценивали влияние в/б и и/н введений селанка, ноопепта и семакса на характеристики NMDA- и mGluII-рецепторов – Bmax и Kd. Во всех группах пептиды не изменяли величин Kd по сравнению с контролем. На рис. 1 и 2 представлены сводные данные по влиянию в/б и и/н введений трех пептидов на плотность глутаматных рецепторов мозга мышей линий C57BL/7 и BALB/c, данные по величине Bmax указаны в %, за 100% принято значение соответствующих контрольных групп животных.
У мышей BALB/c в/б введение ноопепта и и/н введение селанка увеличивают на 16% (${{{\text{B}}}_{{{\text{ma}}{{{\text{x}}}_{{{\text{ноопепт}}}}}}}}$ = = 2374 ± 62) и 23% (${{{\text{B}}}_{{{\text{ma}}{{{\text{x}}}_{{{\text{селанк}}}}}}}}$ = 2770 ± 60), соответственно (p < 0.05, t-тест Стьюдента), а и/н введение ноопепта и семакса уменьшает на 27% (${{{\text{B}}}_{{{\text{ma}}{{{\text{x}}}_{{{\text{ноопепт}}}}}}}}$ = = 1577 ± 24) и 21% (${{{\text{B}}}_{{{\text{ma}}{{{\text{x}}}_{{{\text{семакс}}}}}}}}$ = 1660 ± 63), соответственно (p < 0.05, t-тест Стьюдента), количество мест связывания NMDA-рецепторов гиппокампа. У мышей C57BL/6 в/б введение семакса и и/н введение ноопепта уменьшает на 29% (${{{\text{B}}}_{{{\text{ma}}{{{\text{x}}}_{{{\text{семакс}}}}}}}}$ = = 1800 ± 36) и 22% (${{{\text{B}}}_{{{\text{ma}}{{{\text{x}}}_{{{\text{ноопепт}}}}}}}}$ = 2205 ± 106) соответственно (p < 0.05, t-тест Стьюдента), плотность NMDA-рецепторов.
При обоих путях введения всех трех пептидов у мышей BALB/c не происходило изменений характеристик mGluII-рецепторов в префронтальной коре мозга, у мышей C57BL/6 под влиянием в/б введения ноопепта и обоих введений семакса плотность mGluII-рецепторов коры мозга уменьшалась на 19% (${{{\text{B}}}_{{{\text{ma}}{{{\text{x}}}_{{{\text{ноопепт}}}}}}}}$ = 981 ± 73), 18% (${{{\text{B}}}_{{{\text{ma}}{{{\text{x}}}_{{{\text{семакс}}}}}}}}$ = = 986 ± 79) и 16% (${{{\text{B}}}_{{{\text{ma}}{{{\text{x}}}_{{{\text{семакс}}}}}}}}$ = 1007 ± 76), соответственно (p < 0.05, t-тест Стьюдента).
Регуляторные пептиды являются универсальными эндогенными биорегуляторами клеточных функций в организме человека, среди которых особое место занимают нейропептиды – регуляторы функций нервной системы. Каждый регуляторный пептид проявляет спектр биологической активности, определяемый, во-первых, его непосредственным взаимодействием с клеткой-мишенью и, во-вторых, его способностью индуцировать высвобождения ряда других пептидов, которые в свою очередь, также могут служить индукторами высвобождения следующей группы пептидов и т.д., в результате чего первичные эффекты того или иного пептида пролонгируются и развиваются в организме [17].
В настоящем исследовании была поставлена задача сопоставления эффектов препаратов при и/н и в/б путях введения. Для комплексного подхода действие селанка, ноопепта и семакса было изучено на разных уровнях: поведенческом и рецепторном. Помимо этого были взяты разные линии мышей C57BL/7 и BALB/c, различающиеся как по фенотипу поведения в условиях незнакомой обстановки в ЗКЛ, так и по исходному состоянию NMDA- и mGluII -рецепторов в гиппокампе и коре мозга соответственно [2–4].
Внутрибрюшинный путь введения лекарственных средств по скорости воздействия приближается к внутривенному, но в клинических условиях он используется крайне редко. Висцеральный листок брюшины, богатый кровеносными сосудами, выделяет в полость серозную жидкость, а париетальный листок за счет лимфатических сосудов ее всасывает. Предполагается, что лекарственное вещество, введенное внутрибрюшинно, попадает в лимфатическую систему, протоки которой впадают в грудные вены большого круга кровообращения, которые в свою очередь переходят в систему верхней полой вены, заканчивающую свой путь в правом предсердии [18, 19].
При интраназальном введении веществ значительная их часть всасывается в кровь, меньшая – при помощи периневрального транспорта по чувствительным нервам попадает непосредственно в мозг через нейроны обонятельного тракта и далее распространяется по структурам головного мозга при помощи механизмов, не связанных с кровотоком. При этом исключается пресистемный метаболизм в желудочно-кишечном тракте и печени, быстрее достигается терапевтический эффект, то есть используется возможность прямого поступления лекарств непосредственно в мозг. Механизмы, участвующие в доставке веществ из носовой полости в мозг, изучены недостаточно, но обсуждаются несколько вариантов. Скорее всего, используемым пептидам присущ экстранейрональный транспорт вдоль обонятельного нерва, посредством которого короткие пептидные молекулы могут попадать напрямую в нервную ткань по межклеточному пространству через щелевые контакты между поддерживающими клетками и обонятельными нейронами [20, 21].
Для анализа влияния исследуемых пептидов на рецепторные характеристики в исследовании были выбраны два типа глутаматных рецепторов: ионотропные NMDA- и метаботропные mGluII. Активность первого связывают преимущественно с процессами обучения и памяти [22], тогда как второго – с состоянием тревожности [6].
В результате были получены схожие по ряду показателей эффекты в/б и и/н путей введения селанка, ноопепта, семакса на поведении в ЗКЛ, и различное влияние на эти рецепторы.
В тесте ЗКЛ в обоих случаях увеличивалась исследовательская активность мышей линии BALB/c, исходно характеризующихся меньшей эффективностью исследовательского поведения. При этом в случае назального введения препарата влияние было более выраженным: показатель эффективности обследования лабиринта F_PtrN и PatrlN, указывающие на наличие ноотропной активности [10], изменялись в большей степени – 27% (селанк), 29% (ноопепт) и 36% (семакс), тогда как при внутрибрюшинном – всего на 10%, 2% и 16%, соответственно. Кроме того, на исходно более тревожных мышах BALB/c в данном тесте проявился анксиолитический эффект пептидов, который был ярче выражен при в/б введении: показатели F_ChTm и F_GlTm уменьшались на 43% (селанк), 53% (ноопепт) и 57% (семакс), тогда как при и/н – на 29, 34 и 40% соответственно. Сводные данные по влиянию всех трех пептидов при в/б и и/н введениях на поведенческие параметры мышей C57BL/7 и BALB/c в тесте ЗКЛ представлены в табл. 4.
Таблица 4.
Вещества | Поведение | |||||||||||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Исследовательская активность | Тревожность | Двигательная активность | ||||||||||
F_ PtrN | PatrlN | F_ChTm | F_GlTm | T_ChTm | T_GlTm | |||||||
BALB/c | C57Bl/6 | BALB/c | C57Bl/6 | BALB/c | C57Bl/6 | BALB/c | C57Bl/6 | BALB/c | C57Bl/6 | BALB/c | C57Bl/6 | |
Селанк в/б | + | 0 | 0 | 0 | – | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
↓ 10% | ↓ 43% | |||||||||||
Селанк и/н | + | 0 | 0 | 0 | – | 0 | 0 | 0 | + | 0 | 0 | 0 |
↓ 27% | ↓29% | ↓ 17% | ||||||||||
Семакс в/б | + | 0 | + | 0 | – | 0 | – | + | 0 | 0 | 0 | 0 |
↓ 16% | ↑ 10% | ↓ 57% | ↓ 35% | ↑ 59% | ||||||||
Семакс и/н | + | 0 | + | 0 | 0 | 0 | – | + | + | 0 | + | 0 |
↓ 15% | ↑ 36% | ↓ 40% | ↑ 46% | ↓ 22% | ↓ 5% | |||||||
Ноопепт в/б | 0 | 0 | + | 0 | – | 0 | – | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
↑ 2% | ↓ 53% | ↓ 28% | ||||||||||
Ноопепт и/н | + | 0 | + | 0 | 0 | 0 | – | + | 0 | 0 | 0 | 0 |
↓ 29% | ↑ 12% | ↓ 34% | ↑ 88% | ↑ 39% |
Таким образом, на основании сопоставления полученных результатов можно выделить общие свойства селанка, семакса и ноопепта при разных путях введения: при в/б введении три пептида сильнее проявляют свои анксиолитические свойства, а при и/н – ноотропные на мышах линии BALB/c.
Полученную разницу в соотношении ноотропного и анксиолитического компонентов при в/б и и/н введении ноопепта и семакса можно интерпретировать с нескольких точек зрения.
При разных путях введения у препаратов могут наблюдаться различная биотрансформация, следовательно, образующиеся метаболиты могут проявлять неодинаковые фармакологические эффекты.
В случае селанка в плазме крови около 90% пептидазной активности идет на образование из исходного гептапептида молекул пентапептида TKPRP и наиболее долгоживущего трипептида TKR [23], самостоятельная психофармакологическая активность которых еще не установлена.
Семакс (Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro) распадается в сыворотке крови крыс под воздействием аминопептидаз и ангиотензин-преобразующего фермента [24]. Первым отщепляется метионин в положении 1, оставляя гексапептид (Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro), затем глутамин в положении 2 (His-Phe-Pro-Gly-Pro). Эти фрагменты являются стабильными нейропептидами, самостоятельно модулирующими холинергическую нейропередачу и генерацию оксида азота [25, 26]. Кроме того, под влиянием аминопептидаз семакс может метаболизироваться в тетрапептид Met-Glu-His-Phe и трипептид Pro-Gly-Pro, оказывающие влияние на функциональную активность нервной клетки [27, 28]. Дальнейший распад всех пептидов продолжается до отдельных аминокислот, которые как абсолютно естественные для организма включаются в обменные процессы [24].
Ноопепт (этиловый эфир N-фенилацетил-L-пролилглицина), абсорбируясь в желудочно-кишечном тракте, в неизмененном виде поступает в системный кровоток, проникает через гематоэнцефалический барьер, определяется в мозге в больших концентрациях, чем в крови. Пептид частично сохраняется в неизмененном виде, частично метаболизируется с образованием фенилуксусной кислоты, фенилацетилпролина и циклопролилглицина (ЦПГ). Последний, являясь основным метаболитом ноопепта, обладает структурным сходством с эндогенным нейропептидом [29]. Неизмененный ноопепт обнаруживается в малых количествах в сыворотке, поскольку он быстро метаболизируется в течение 25 мин после перорального приема. Кроме того, ЦПГ сам по себе имеет ноотропный потенциал при введении в форме инъекций, хотя в меньшей степени, чем ноопепт [30]. В настоящее время считается, что ноопепт действует в качестве пролекарства для ЦПГ, и именно в этой форме ЦПГ проявляет большую активность. Однако, существуют данные, что при приеме ноопепта в виде инъекций и перорально (в дозе 0.5 мг/кг и 10 мг/кг, соответственно) наблюдаются антиамнестические эффекты, которые усиливаются при субхроническом введении в течение 9 дней, тогда как при инъекциях ЦПГ усиления эффекта не наблюдается [31]. Эффекты ноопепта и ЦПГ не идентичны, и это может быть связано с тем, что либо ноопепт в отличие от ЦПГ, обладает накопительным действием, либо действие последнего усиливается под влиянием других метаболитов.
Другой причиной различия эффектов после в/б и и/н введений пептидов может быть первичное поступление в разные области мозга. В/б введение сравнимо с внутривенным, при котором небольшие пептиды проникают в мозг через гематоэнцефалический барьер и с общим кровотоком достигают разных отделов мозга [24, 32]. Обнаружено, что вещества, попадающие в мозг по обонятельному нерву, преимущественно распределяются в ростральные отделы мозга, включая обонятельные луковицы, фронтальную кору, гиппокамп, миндалину [32–34].
В наших экспериментах более выраженное ноотропное действие семакса и ноопепта при интраназальном введении свидетельствует о том, что пептиды посредством экстранейронального пути через обонятельный эпителий попадают в большей степени в области мозга, связанные с процессами памяти и обучения, а при в/б введении преимущественно в структуры мозга, ответственные за эмоциональный статус (передний мозг и лимбические области), вследствие чего преобладает анксиолитический эффект.
Таким образом, полученные различия в рецепторных мишенях при в/б и и/н путях введения можно также объяснить выше упомянутыми факторами. Повышение плотности NMDA-рецепторов в гиппокампе под влиянием в/б введения ноопепта и и/н введения селанка у мышей BALB/c может объяснять улучшение исследовательской активности в тесте ЗКЛ. Понижение этих же самых рецепторов при и/н введении ноопепта и семакса предполагает, что скорее всего ноотропный эффект в данном случае достигается другими механизмами.
Ни один из пептидов при обоих путях введения у мышей BALB/c не влиял на характеристики mGluII- рецепторов, что указывает на то, что эти рецепторы не участвуют в формировании анксиолитического эффекта у данной линии. В свою очередь, анксиогенное действие при обоих введениях семакса у С57Bl/6 может быть связано со снижением количества метаботропных глутаматных рецепторов в коре мозга. В целом, в группе С57Bl/6 наблюдается схожесть влияния ноопепта и семакса на оба типа глутаматных рецепторов, что проявляется в уменьшении их плотности в выбранных структурах мозга.
Полученную в нашем исследовании разницу в соотношении ноотропной и анксиолитической составляющих и рецепторных мишенях пептидных препаратов в зависимости от пути введения можно использовать для достижения необходимого терапевтического эффекта.
ВЫВОДЫ
1. У мышей BALB/с семакс, ноопепт и селанк положительно влияют на исследовательское поведение и снижают тревожность при обоих путях введения, при этом ноотропный эффект ярче проявляется при и/н введении по сравнению с в/б, тогда как анксиолитический эффект этих пептидов более выражен при в/б введении.
2. У мышей C57BL/6 при обоих путях введения семакса, ноопепта и селанка не наблюдается ноотропного и анксиолитического эффектов, а семакс, напротив, проявляет анксиогенный эффект, более выраженный при в/б пути введения по сравнению с и/н.
3. У мышей BALB/с плотность NMDA-рецепторов изменяется следующим образом: под влиянием и/н введения увеличивается у селанка, уменьшается у ноопепта и семакса, и только внутрибрюшинное введение ноопепта увеличивает этот параметр; плотность mGluII-рецепторов остается неизменной при обоих путях введения.
4. У мышей линии C57BL/6 наблюдается снижение мест связывания глутаматных рецепторов: NMDA-рецепторов – под влиянием в/б введения семакса и и/н введения ноопепта, mGluII-рецепторов – под влиянием в/б введения ноопепта и обоих путей введения семакса.
5. Разный спектр фармакологических эффектов селанка, ноопепта и семакса под влиянием в/б и и/н путей может быть обусловлен как факторами фармакокинетики и биотрансформации, так и динамикой образования ноотропного и анксиолитического действия препаратов.
Список литературы
Васильева Е.В., Салимов Р.М., Ковалев Г.И. // Экспериментальная и клиническая фармакология. 2012. Т. 75. № 7. С. 32–37.
Васильева Е.В. Золотарев Ю.А., Ковалев Г.И. // Нейрохимия. 2013. Т. 30. № 2. С. 135–141.
Ковалев Г.И., Кондрахин, Е.А., Салимов Р.М. // Нейрохимия. 2013. Т. 30. № 2. С. 128–134.
Ковалев Г.И., Кондрахин Е.А., Салимов Р.М., Незнамов Г.Г. // Экспериментальная и клиническая фармакология. 2014. Т. 77. № 12. С. 49–55.
Ковалев Г.И., Фирстова Ю.Ю. // Клиническая фармакология и терапия. 2010. Т. 19. № 6. С. 72–73.
Linden A. M., Baez M., Bergeron M., Schoepp D.D. // Neuropharmacology. 2006. V. 51. P. 213–228.
Glowinski L.L. Iversen J. // J. Neurochem. 1966. T. 13. № 8. P. 655–669.
Васильева Е.В., Кондрахин Е.А., Салимов Р.М., Ковалев Г.И. // Экспериментальная и клиническая фармакология. 2016. Т. 79. № 9. С. 3–11.
Васильева Е.В., Салимов Р.М., Ковалев Г.И. // Фармакокинетика и фармакодинамика. 2016. № 2. С. 31–36.
Салимов Р.М. // Журн. ВНД. 1988. Т. 38. № 3. С. 569–571.
Salimov R.M. // Alcohol. 1999. № 17. P. 157–162.
Миронов А.Н. // Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. М.: Гриф и К, 2012. 944 с.
Ковалев Г.И., Васильева Е.В., Салимов Р.М. // Журн. ВНД. 2019. Т. 69. № 1. С. 123–130.
Zhou L.M., Gu Z.Q., Costa A.M., Yamada K.A., Manssone P.E. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1997. V. 280(1). P. 422–427.
LaPage K.T., Ishmael J.E., Low C.W., Traynelis S.F., Murray T.F. // Neuropharmacology. 2005. V. 49. P. 1–16.
Schaffhauser H., Richards J.G., Cartmell J., Chaboz S., Kemp J.A., Klingelschmidt A., Messer J., Stadler H., Woltering T., Mutel V. // Mol. Pharmacol. 1998. V. 53. P. 228–233.
Соллертинская Т.Н., Шорохов М.В., Н.Ф. Мясоедов Н.Ф. и др. // Асимметрия. 2014. № 4. С. 53–65.
Richard L.D., Vogl A.W., Adam W.M.M. Grays Anatomy for Students, 2nd Edition, Abdominal Viscera. 2009. 406 p.
Das R.G. and North D. // Laboratory Animals. 2007. № 41. P. 312–320.
Hanson L. R., Frey H. F. // BMC Neuroscience. 2008. V. 9. P. S3–S5.
Illum L. // Eur. J. Pharm. Sci. 2000. V. 11. P. 1–18.
Van Dongen A.M. Biology of the NMDA Receptor (Frontiers in Neuroscience), CRC, Boca Raton, 2008. 367 p.
Золотарев Ю.А., Дадаян А.К., Долотов О.В. и др. // Биоорганическая химия. 2006. Т. 32. № 2. С. 183–191.
Potaman V.N., Antonova L.V., Dubynin V.A., Zaitzev D.A., Kamensky A.A., Myasoedov N.F., Nezavibatko V.N. // Neurosci. Lett. 1991. V. 127. № 1. P. 133–138.
Ашмарин И.П., Незавибатько Н.Н., Мясоедов Н.Ф., Каменский А.А. // Журн. ВНД. 1997. Т. 47. С. 419–425.
Ashmarin I.P., Kamensky A.A., Myasoedov N.F., Skvortsova V.I. // Regulatory Peptides. 2000. V. 89. P. 51
Storozhevykh T.P., Tukhbatova G.R., Senilova Y.E., Pinelis V.G., Andreeva L.A., Myasoyedov N.F. // Bull. Exp. Biol. Med. 2007. V. 143. № 5. P. 601–604.
Dmitrieva V.G., Povarova O.V., Skvortsova V.I., Limborska S.A., Myasoedov N.F., Dergunova L.V. // Cell. Mol. Neurobiol. 2010. V. 30. № 1. P. 71–77.
Бойко С.С., Жердев В.П., Дворянинов А.А., Гудашева Т.А., Островская Р.У., Воронина Т.А., Розанцев Г.Г., Середенин С.Б. // Экспериментальная и клиническая фармакология. 1997. Т. 60. С. 101–104.
Ostrovskaya R.U., Mirsoev T.K., Romanova G.A., Gudasheva T.A., Kravchenko E.V., Trofimov C.C., Voronina T.A., Seredenin S.B. // Bull. Exp. Biol. Med. 2001. V. 132. № 4. P. 959–962.
Ostrovskaya R.U., Romanova G.A., Barskov I.V., Shanina E.V., Gudasheva T.A., Victorov I.V., Voronina T.A., Seredenin S.B. // Behav. Pharmacol. 1999. V. 10. № 5. P. 549–553.
Манченко Д.М., Глазова Н.Ю., Левицкая Н.Г., Андреева Л.А., Каменский А.А., Мясоедов Н.Ф. // Российский физиологический журн. им. И.М. Сеченова. 2010. Т. 96. № 10. С. 1014–1023.
Chen X.Q., Fawcett J.R., Rahman Y.E., Ala T.A., Frey W.H. // J. Alzheimers Dis. 1998. V. 1. № 1. P. 35–44.
Hanson L.R., Frey W.H. // J. Neuroimmune Pharm. 2007. V. 2. P. 81–86.
Дополнительные материалы отсутствуют.