Нейрохимия, 2020, T. 37, № 3, стр. 208-219

Преобладание ноотропного или анксиолитического эффекта пептидов селанк, семакс и ноопепт в зависимости от пути их введения мышам BALB/c и С57BL/6

Е. В. Васильева 1, Е. А. Кондрахин 1, А. А. Абдуллина 1, Р. М. Салимов 1, Г. И. Ковалев 1

1 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение “НИИ фармакологии им. В.В. Закусова”
Москва, Россия

Поступила в редакцию 06.01.2020
После доработки 28.03.2020
Принята к публикации 09.04.2020

Полный текст (PDF)

Аннотация

В тесте “закрытый крестообразный лабиринт” (ЗКЛ) проведено сравнение влияния внутрибрюшинного и интраназального пути введения в течение 5 дней пептидов селанк (300 мкг/кг/день), ноопепт (1 мкг/кг/день), семакс (0.6 мкг/кг/день), проявляющих анксиолитический и ноотропный эффекты, на поведение мышей инбредных линий BALB/c и С57BL/6, а также на NMDA- и mGluII-рецепторы мозга. У мышей линии BALB/c при обоих путях введения семакса, ноопепта, селанка улучшалась исследовательская активность и снижалась тревожность, но при внутрибрюшинном введении ярче проявлялся анксиолитический эффект, а при интраназальном – ноотропный. У мышей линии C57BL/6 семакс, ноопепт и селанк при обоих путях введения не влияли на эффективность исследовательского поведения, а также на тревожность, за исключением семакса, проявившего больший анксиогенный эффект при внутрибрюшинном введении по сравнению с интраназальным. У мышей линии BALB/c внутрибрюшинное введение ноопепта и интраназальное введение селанка увеличивало плотность NMDA-рецепторов в гиппокампе, интраназальное введение ноопепта и семакса – уменьшало, изменений характеристик mGluII-рецепторов не происходило. У мышей линии C57BL/6 внутрибрюшинное введение семакса и интраназальное введение ноопепта снижало количество мест связывания NMDA-рецепторов, а внутрибрюшинное введение ноопепта и оба пути введения семакса уменьшали плотность mGluII-рецепторов в коре мозга.

Ключевые слова: селанк, ноопепт, семакс, BALB/c, C57BL/6, ноотропное действие, тревожность, закрытый крестообразный лабиринт, гиппокамп, фронтальная кора, NMDA-рецепторы, mGluII-рецепторы, [3H]MK-801, [3H]LY354740

ВВЕДЕНИЕ

Селанк (треонил-лизил-пролил-аргинил-пролил-глицил-пролил-диацетат), семакс (метионил-глутамил-гистидил-фенилаланил-пролил-глицил-пролин), ноопепт (этиловый эфир N-фенилацетил–L–пролилглицина) относятся к ноотропным препаратам пептидной природы, при этом они оказывают также нейропротективные и анксиолитические свойства. Несмотря на общность фармакологических эффектов, эти средства обладают различиями в фармакокинетике и фармакодинамике, проявляют специфические для каждого свойства. Следует также отметить, что селанк и семакс в клинике применяются в виде назальных капель, а ноопепт – в виде таблеток.

Ранее нами было установлено, что инбредные мыши BALB/c характеризуются в сравнении с особями линии C57BL/6 меньшей эффективностью исследовательского поведения, большей тревожностью и двигательной активностью в условиях незнакомой обстановки крестообразного лабиринта [1], меньшей плотностью NMDA- и mGluII-рецепторов в гиппокампе и коре мозга, соответственно [24]. Этот факт позволил использовать мышей BALB/c как модель когнитивного дефицита и/или состояния повышенной тревожности и двигательной активности при сравнении с мышами C57BL/6. Для большинства известных ноотропов с различной химической структурой специфический эффект после субхронического введения сопровождается ростом плотности глутаматных рецепторов NMDA-типа в гиппокампе [5], в свою очередь, в процесс регуляции эмоционального состояния, особенно тревожности, активно вовлечены mGluII-рецепторы [6]. Несмотря на то, что селанк, ноопепт и семакс уже доступны на фармацевтическом рынке, нейрорецепторный компонент их действия до сих пор описан скудно. В связи с вышесказанным для исследования механизмов исследуемых препаратов в качестве мишени ноотропной составляющей были выбраны NMDA-рецепторы в гиппокампе, анксиолиотической – mGluII-рецепторы в коре.

Таким образом, в данном исследовании было проведено сравнение эффектов селанка, ноопепта и семакса на поведенческие и рецепторные характеристики после внутрибрюшинного (в/б) и интраназального (и/н) введений препарата мышам инбредных линий C57BL/7 и BALB/c, различающихся как по фенотипу поведения в условиях незнакомой обстановки в закрытом крестообразном лабиринте, так и по исходному состоянию NMDA- и mGluII-рецепторов мозга.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Животные

Исследования проводили на самцах мышей линий BALB/c и С57BL/6 массой 25–30 г (питомник “Столбовая”), которых содержали в виварии ФГБНУ “НИИ фармакологии имени В.В.Закусова” в стандартных условиях со свободным доступом к воде и корму ad libitum, по 15 особей в клетке в течение 1-й нед. до начала эксперимента, на стандартной диете при 12-часовом световом режиме. Содержание животных соответствовало правилам лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ 351.000.3-96 и 51000.4-96), Приказу МЗ и СР РФ от 23 августа 2010 г. № 708н “Об утверждении Правил лабораторной практики”. Эксперименты проводили с 10 до 16 ч, при этом животных в день эксперимента тестировали поочередно из каждой группы, равномерно распределяя влияние фактора времени на поведение животных в разных группах. Проведение экспериментов одобрено Комиссией по биомедицинской этике ФГБНУ “НИИ фармакологии им. В.В. Закусова”. Животным посредством в/б и и/н (10 мкл, с использованием микропипетки фирмы Eppendorf) инъекций в течение 5 дней (субхроническое введение) ежедневно один раз в сутки вводили физиологический раствор (контрольная группа – NaCl, 0.9%), либо препараты, растворенные в физрастворе (опытные группы).

Тест “закрытый крестообразный лабиринт” (ЗКЛ) применяли через 2 ч после последней инъекции изучаемых веществ. Сразу после окончания тестирования мышей декапитировали, головной мозг извлекали на льду и выделяли префронтальную кору и гиппокамп по общепринятой схеме [7] для последующего проведения радиолигандного анализа.

Вещества

В экспериментах использовали при в/б и и/н путях введения дозу селанка (ЗАО ИНПЦ “Пептоген”, ИМГ РАН) 300 мкг/кг/день, ноопепта (ФГБНУ “НИИ фармакологии им. В.В. Закусова”) 1 мг/кг/день, семакса (ОХФАВ ИМГ РАН) 0.6 мг/кг/день, при которых проявляются как ноотропный, так и анксиолитический эффекты [8, 9].

Для изучения рецепторного связывания использовали [3H](+)МК-801 (210 Кюри/ммоль) – селективный антагонист NMDA-рецепторов, [3H]LY354740 (42 Кюри/ммоль) – селективный антагонист mGluII-рецепторов соответственно. Оба лиганда были синтезированы д. х. н. Ю.А. Золотаревым в ОХФАВ ИМГ РАН (зав. отделом – акад. РАН Н.Ф. Мясоедов). Остальные реактивы были приобретены в коммерческих источниках.

Изучение поведения

Тест ЗКЛ является неинвазивным методом и основан на врожденной способности каждого животного к различной степени эффективности исследовательского поведения в новой обстановке [3, 10, 11]. Закрытый крестообразный лабиринт состоял из 4-х пластмассовых закрытых пустых отсеков, соединенных с центральным отсеком с помощью входных отверстий. Мышь помещали в центральный отсек лабиринта и в полуавтоматическом режиме с помощью программы Behavset регистрировали последовательность и продолжительность ее переходов из одного рукава в другой. Сессия завершалась после 12-ти визитов в боковые отсеки. Последующий анализ данных позволял выделить ряд показателей эффективности исследовательского поведения, тревожности и двигательной активности. Оценивали показатели тревожности (латентный период первого захода в боковой отсек и время пребывания в нем, F_ChTm и F_GlTm), двигательной активности (общее время пребывания в центральном и боковых отсеках, T_ChTm и T_GlTm) и спонтанной ориентации (длина первого полного обхода боковых отсеков – F_PtrN и количество полных обходов за сессию – PatrN) [12, 13].

Радиолигандный анализ

NMDA-рецепторы. Выделение плазматических мембран с NMDA-рецепторами гиппокампа. Выделение плазматических мембран гиппокампа проводили по модифицированным методам [14, 15]. После декапитации ткань немедленно замораживали в жидком азоте и хранили в низкотемпературном холодильнике при –80°С. В день эксперимента гиппокампы размельчали в гомогенизаторе Поттера “тефлон-стекло” в 10 объемах буфера № 1 (5 мМ НЕРЕS, 4.5 мМ Tris, 0.32 M сахароза, рН 7.6). Гомогенат разбавляли 50 объемами буфера № 2 (5 мМ НЕРЕS, 4.5 мМ Tris, рН 7.6) и центрифугировали при 1000 g 10 мин на ультрацентрифуге “Optima L-70K” (“Beckman Coulter”). Супернатант сливали и вновь центрифугировали при 25000 g 20 мин. Для увеличения выхода белка эту операцию проводили дважды. Полученный осадок ресуспендировали в 50 объемах буфера № 2 и центрифугировали при 8000 g 20 мин. Супернатант и верхний коричневый осадочный слой сливали и центрифугировали при 25 000 g 20 мин. Осадок ресуспендировали в 50 объемах буфера № 3 (5 мМ НЕРЕS, 4.5 мМ Tris, 1 мМ Na4EDTA, рН 7.6) и троекратно центрифугировали при 25 000 g 20 мин. Полученный осадок ресуспендировали в 50 объемах буфера № 2 и однократно центрифугировали при 25000 g 20 мин. Конечный осадок сохраняли в 5 объемах буфера № 2 и замораживали в криопробирках в жидком азоте. В день анализа ткань размораживали, разбавляли в 10 объемах буфера № 2, центрифугировали при 25 000 g 20 мин. Осадок ресуспендировали в необходимом количестве буфера № 2.

Радиолигандный анализ NMDA-рецепторов. Инкубационная смесь (конечный объем 0.5 мл) содержала 50 мкл [3H](+)МК-801, 250 мкл буфера и 200 мкл белковой суспензии мембран, для неспецифического связывания добавляли 50 мкл немеченного лиганда (+)МК-801, 1 мМ). Реакционную смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч.

mGluII-рецепторы. Выделение плазматических мембран с mGluII-рецепторами префронтальной коры мозга. Выделение mGluIIR-рецепторов проводили по методу [16]. После декапитации ткань немедленно замораживали в жидком азоте и хранили в низкотемпературном холодильнике при ‒80°С. В день эксперимента ткань мозга размельчали в гомогенизаторе Поттера “тефлон-стекло” в 25 объемах буфера (50 мМ Tris-HCl, pH 7.1). Гомогенат центрифугировали при 48 000 g 10 мин. Полученный осадок гомогенизировали в буфере (50 мМ Tris-HCl, pH 7.1) и инкубировали при 37°С 10 мин, затем центрифугировали при 48 000 g 10 мин. Осадок ресуспендировали в 5 объемах буфера и замораживали в криопробирках при –80°С. В день эксперимента мембраны размораживали и центрифугировали 3 раза в буфере (50 мМ Tris-HCl, 2 мМ MgCl2, pH 7.4) 48 000 g 10 мин. Осадок ресуспендировали в необходимом количестве буфера (50 мМ Tris-HCl, 2 мМ MgCl2, pH  7.4). Концентрация белка в образцах мембран составляла 0.25 мг/мл.

Радиолигандный анализ mGluII-рецепторов. Инкубационная смесь (конечный объем 0.5 мл) содержала 50 мкл [3H]LY 354740, 200 или 250 мкл буфера (50 мМ Tris-HCl, 2 мМ MgCl2, pH 7.4) и 200 мкл белковой суспензии мембран, для неспецифического связывания добавляли 50 мкл немеченого лиганда (глутамат). Реакционную смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч.

Жидкостно-сцинтилляционная спектрометрия

По окончании инкубации пробы фильтровали через стекловолокнистые фильтры GF/B (“Whatman”), предварительно смоченные в 0.3% полиэтиленимине в течение 2 ч при комнатной температуре. Каждую пробирку промывали два раза холодным буфером, затем фильтры промывали два раза тем же объемом буфера. Фильтры просушивали на воздухе, переносили в сцинтилляционные флаконы и заливали 5 мл сцинтилляционной жидкости на основе толуола (4 г PPO, 0.2 г POPOP на 1 л толуола). Радиоактивность проб определяли на счетчике Tri-Carb 2900TR (“Perkin Elmer”) с эффективностью счета 42–46%. Концентрацию белка измеряли по стандартной методике Лоури.

Обработка и представление результатов

Cтaтиcтичecкую oбpaбoтку экcпepимeнтaльных дaнных пpoвoдили c пoмoщью пpoгpaммы Statistica 6.0. с привлечением мeтoдов пapaмeтpичecкoй и нeпapaмeтpичecкoй статистики. Для анализа данных поведенческого теста применяли 3-х факторный дисперсионный анализ ANOVA, в котором независимыми переменными (факторами) являлись линия мышей (BALB/c или C57BL/6), путь введения (внутрибрюшинно или интраназально), тип терапии (растворитель или пептид). Межгрупповое сравнение согласно факторному плану (planned comparison) выполняли с помощью анализа контрастов ANOVA.

Результаты экспериментов по радиорецепторному связыванию ex vivo оценивали с помощью пpoгpaммы GraphPad Prism 4. Рассчитанные величины Кd и Bmax отражают степень сродства рецептора к лиганду (нМ) и количество мест связывания лиганда (фмоль/мг белка), соответственно. Для анализа насыщения и получения характеристик связывания Bmax и Kd измеряли специфическое связывание для NMDA-рецепторов – от 1.25 до 20 нМ, для mGluII-рецепторов – от 12.5 до 200 нМ. Специфическое связывание рассчитывали как разницу между общим и неспецифическим связыванием. Для построения кривых насыщения радиоактивных лигандов каждая концентрация исследуемого вещества была взята в 2-х повторностях.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Поведение

Как видно из табл. 1–3, все пептиды после и/н введения мышам линии BALB/c оказывают ноотропное действие, что проявляется в улучшении поведения патрулирования, а именно, уменьшении числа заходов при первом патрулировании (F_PtrN), а после введения ноопепта и семакса – и в увеличении общего числа патрулирований лабиринта (PatrlN). Такой результат отсутствовал у мышей линии C57BL/6 за исключением увеличении общего числа патрулирований лабиринта (PatrlN) после внутрибрюшинного введения селанка.

Таблица 1.

Результаты 3-факторного дисперсионного анализа влияния cеланка на поведение мышей и сравнение групп согласно факторному плану с помощью анализа контрастов. Независимыми факторами являются линия мышей (BALB/c или C57BL/6; Линия), путь введения – внутрибрюшинно (в/б) или интраназально (и/н) (Путь введения), тип терапии – растворитель (Физраствор) или селанк (Вещество)

Факторы Параметры
F_PtrN PatrlN F_ChTm F_GlTm T_ChTm T_GlTm
Df F p F p F p F p F p F p
Линия мышей 1 1.79 0.18 0.83 0.37 15.57 <0.00 10.74 <0.00 7.12 0.01 19.40 <0.00
Путь введения 1 0.04 0.84 3.15 0.08 17.78 <0.00 3.59 0.06 19.42 <0.00 22.17 <0.00
Вещество 1 4.83 0.03 1.37 0.24 3.86 0.05 0.02 0.89 0.51 0.48 0.05 0.83
Линия*Путь введения 1 0.02 0.90 0.81 0.37 5.67 0.02 2.81 0.10 0.27 0.61 14.43 <0.00
Линия*Вещество 1 3.49 0.06 4.42 0.04 7.69 0.01 0.01 0.94 0.52 0.47 0.10 0.75
Путь введения*Вещество 1 0.11 0.74 0.00 0.97 0.16 0.69 0.01 0.94 0.02 0.88 1.94 0.17
Линия*Путь введения*Вещество 1 4.81 0.03 2.25 0.14 0.02 0.89 0.33 0.57 1.33 0.25 2.16 0.14
№ группы Линия Путь введения Вещество N m ±S.E.M. m ±S.E.M. m ±S.E.M. m ±S.E.M. m ±S.E.M. m ±S.E.M.
1 BALB/c в/б Физраствор 11 6.2 0.4 2.0 0.2 7.7 1.0 12.9 6.6 59.0 6.1 88.8 14.7
2 BALB/c в/б Селанк 14 5.5 0.5 1.7 0.2 4.5& 1.2 14.8 7.4 64.6 6.9 119.2 16.5
3 BALB/c и/н Физраствор 15 6.8 0.4 1.7 0.2 12.6 1.0 14.8 6.3 43.6 5.9 108.8 14.2
4 BALB/c и/н Селанк 15      5* 0.4 1.8 0.2      9& 1.0 10.9 6.3 38.1 5.9 80.5 14.2
5 C57BL/6 в/б Физраствор 16 5.9 0.4 1.6 0.2 4.5 1.0 37.9 6.3 53.5 5.9 191.1 14.2
6 C57BL/6 в/б Селанк 15 5.0 0.4 2.1** 0.1 5.4 1.0 35.3 6.1 43.1 5.7 184.9 13.7
7 C57BL/6 и/н Физраствор 15 5.2 0.4 1.5 0.2 6.2 1.0 19.2 6.3 32.6 5.9 103.2 14.2
8 C57BL/6 и/н Селанк 15 5.9 0.4 1.7 0.2 6.4 1.0 21.2 6.3 30.8 5.9 98.5 14.2

* значимое отличие от группы 3; F(1,108) = 9.2, p = 0.003; ** значимое отличие от группы 5; F(1,108) = 6.08, p = 0.015; & значимое отличие от групп 1 и 3; F(1,108) = 10.6, p = 0.002.

Таблица 2.

Результаты 3-факторного дисперсионного анализа влияния ноопепта на поведение мышей и сравнение групп согласно факторному плану с помощью анализа контрастов. Независимыми факторами являются линия мышей (BALB/c или C57BL/6; Линия), путь введения – внутрибрюшинно (в/б) или интраназально (и/н), тип терапии – растворитель (Физраствор) или ноопепт (Вещество)

Факторы Параметры
F_PtrN PatrlN F_ChTm F_GlTm T_ChTm T_GlTm
Df F p F p F p F p F p F p
Линия мышей 1 1.00 0.32 2.84 0.09 5.43 0.02 9.83 <0.01 0.05 0.83 7.53 <0.01
Путь введения 1 1.39 0.24 2.67 0.10 9.44 <0.01 0.05 0.82 2.22 0.14 0.05 0.82
Вещество 1 2.11 0.15 8.25 <0.01 6.81 0.01 1.48 0.23 0.10 0.76 2.22 0.14
Линия*Путь введения 1 2.39 0.12 1.48 0.23 5.54 0.02 27.80 <0.01 3.44 0.07 1.19 0.28
Линия*Вещество 1 3.20 0.08 2.11 0.15 1.68 0.20 21.37 <0.01 1.12 0.29 3.15 0.08
Путь введения*Вещество 1 3.74 0.06 5.13 0.03 0.03 0.86 0.15 0.70 1.75 0.19 0.31 0.58
Линия*Путь введения*Вещество 1 2.92 0.09 3.30 0.07 3.89 0.05 0.96 0.33 0.54 0.46 2.24 0.14
№ группы Линия Путь введения Вещество N m ±S.E.M. m ±S.E.M. m ±S.E.M. m ±S.E.M. m ±S.E.M. m ±S.E.M.
1 BALB/c в/б Физраствор 81 5.7 0.1 1.9 0.1 12.3 0.7 9.0 0.7 38.3 1.6 86.8 3.8
2 BALB/c в/б Ноопепт 13 5.8 0.4 1.9 0.1 5.7 & 1.7 6.5 # 1.8 43.9 4.0 91.2 9.5
3 BALB/c и/н Физраствор 10 6.5 0.4 1.5 0.1 11.1 1.9 16.9 2.0 39.0 4.6 87.4 10.9
4 BALB/c и/н Ноопепт 8 4.8 * 0.5 2.3 ** 0.2 8.6 2.1 11 # 2.2 41.2 5.2 79.2 12.2
5 C57BL/6 в/б Физраствор 47 5.0 0.2 2.1 0.1 3.1 0.9 14.9 0.9 34.6 2.1 96.0 5.0
6 C57BL/6 в/б Ноопепт 14 5.1 0.4 2.2 0.1 4.1 1.6 21.4## 1.7 38.3 3.9 104.1 9.2
7 C57BL/6 и/н Физраствор 12 5.8 0.4 1.8 0.1 11.9 1.7 7.4 1.8 49.9 4.2 91.1 9.9
8 C57BL/6 и/н Ноопепт 9 5.8 0.4 2.0 0.2 7.9 2.0 15.3## 2.1 41.9 4.9 126.5 11.5

 * Значимое отличие от группы 3; F(1,186) = 7.92, p = 0.005; # значимое отличие от групп 1 и 3; F(1,186) = 5.56, p = 0.019; ** значимое отличие от группы 3; F(1,186) = 11.8, p = 0.001; ## значимое отличие от групп 5 и 7; F(1,186) = 17.83, p < 0.001; & значимое отличие от группы 1; F(1,186) = 13.64, p < 0.001.

Таблица 3.

Результаты 3-факторного дисперсионного анализа влияния семакса на поведение мышей и сравнение групп согласно факторному плану с помощью анализа контрастов. Независимыми факторами являются линия мышей (BALB/c или C57BL/6; Линия), путь введения – внутрибрюшинно (в/б) или интраназально (и/н), тип терапии – растворитель (Физраствор) или семакс (Вещество)

Факторы Параметры
F_PtrN PatrlN F_ChTm F_GlTm T_ChTm T_GlTm
Df F p F p F p F p F p F p
Линия мышей 1 58.1 <0.01 18.55 <0.01 58.40 <0.01 32.80 <0.01 7.23 <0.01 9.17 <0.01
Путь введения 1 49.25 <0.01 34.90 <0.01 127.60 <0.01 52.23 <0.01 59.82 <0.01 2.07 0.15
Вещество 1 4.64 0.03 1.58 0.21 0.90 0.33 8.37 <0.01 1.86 0.17 0.00 0.99
Линия*Путь введения 1 46.62 <0.01 10.70 <0.01 22.20 <0.01 0.34 0.56 0.31 0.58 0.50 0.48
Линия*Вещество 1 7.13 0.01 6.53 0.01 1.60 0.20 0.60 0.44 0.93 0.34 0.12 0.73
Путь введения*Вещество 1 0.21 0.65 0.95 0.33 6.60 0.01 7.64 <0.01 2.46 0.12 0.66 0.42
Линия*Путь введения*Вещество 1 0.41 0.52 0.32 0.57 2.10 0.15 0.86 0.36 3.07 0.08 0.07 0.79
№ группы Линия
мышей
Путь введения Вещество N m ±S.E.M. m ±S.E.M. m ±S.E.M. m ±S.E.M. m ±S.E.M. m ±S.E.M.
1 BALB/c в/б Физраствор 81 5.7 0.17 1.90 0.05 12.33 1.18 9.02 1.24 38.32 2.02 86.81 3.92
2 BALB/c в/б Семакс 14 4.8 0.4 2.1 0.1 5.3 2.8 5.9 3.0 41.1 4.9 87.8 9.4
3 BALB/c и/н Физраствор 20 9.2 0.3 1.1 0.1 31.8 2.4 23.5 2.5 70.5 4.1 93.7 7.9
4 BALB/c и/н Семакс 20 7.8* 0.3 1.5** 0.1 37.9& 2.4 14.1&& 2.5 54.9 4.1 88.8 7.9
5 C57BL/6 в/б Физраствор 47 5.0 0.2 2.1 0.1 3.1 1.6 14.9 1.6 34.6 2.6 96.0 5.1
6 C57BL/6 в/б Семакс 13 5.1 0.4 2.0 0.1 4.9 3.0 17.6 3.1 33.0 5.0 103.6 9.8
7 C57BL/6 и/н Физраствор 20 5.0 0.3 1.9 0.1 12.0 2.4 34.5 2.5 54.0 4.1 113.4 7.9
8 C57BL/6 и/н Семакс 24 5.2 0.3 1.8 0.1 17.5& 2.2 24.6&& 2.3 53.4 3.7 109.4 7.2

* Значимое отличие от группы 3; F(1,231) = 8.19, p < 0.01; & значимое отличие от групп 3 и 7; F(1,231) = 6.13, p = 0.01; ** значимое отличие от группы 3; F(1,231) = 6.68, p = 0.01; && значимое отличие от групп 3 и 7; F(1,231) = 15.59, p < 0.01.

У мышей линии BALB/c ноопепт и селанк при обоих путях введения оказывают анксиолитическое действие, что проявляется в уменьшении времени пребывания в центре при помещении в лабиринт (F_ChTm) и времени пребывания в тупике лабиринта при первом визите (F_GlTm). Семакс при и/н введении оказывал на данные показатели смешанное действие, увеличивая время пребывания в центре при помещении в лабиринт (F_ChTm) и уменьшая время пребывания в тупике лабиринта при первом визите (F_GlTm). У мышей линии C57BL/6 ноопепт при обоих путях введения оказывал анксиогенное действие (увеличение времени пребывания в тупике лабиринта при первом визите), семакс оказывал смешанное действие, увеличивая время пребывания в центре при помещении в лабиринт и уменьшая время пребывания в тупике лабиринта при первом визите, а селанк не оказывал влияния на данные показатели.

Влияния изученных пептидов на общую двигательную активность в данном тесте (показатели T_ChTm и T_GlTm) выявлено не было.

Радиорецепторный анализ ex vivo

В радиолигандном анализе ex vivo оценивали влияние в/б и и/н введений селанка, ноопепта и семакса на характеристики NMDA- и mGluII-рецепторов – Bmax и Kd. Во всех группах пептиды не изменяли величин Kd по сравнению с контролем. На рис. 1 и 2 представлены сводные данные по влиянию в/б и и/н введений трех пептидов на плотность глутаматных рецепторов мозга мышей линий C57BL/7 и BALB/c, данные по величине Bmax указаны в %, за 100% принято значение соответствующих контрольных групп животных.

Рис. 1.

Влияние внутрибрюшинного и интраназального введений селанка, ноопепта и семакса на связывание [3H]МК-801 с NMDA-рецепторами гиппокампа мышей BALB/c (а) и C57BL/6 (б). Примечание: * статистически значимые отличия от контроля (p < < 0.05; t-test Стьюдента; за 100% принято значение контрольных групп.

Рис. 2.

Влияние внутрибрюшинного и интраназального введения селанка, ноопепта и семакса на связывание [3H]LY354740 с mGluII-рецепторами коры мозга мышей BALB/c (а) и C57BL/6 (б). Примечание: * статистически значимые отличия от контроля (p < < 0.05; t-test Стьюдента); за 100% принято значение контрольных групп.

У мышей BALB/c в/б введение ноопепта и и/н введение селанка увеличивают на 16% (${{{\text{B}}}_{{{\text{ma}}{{{\text{x}}}_{{{\text{ноопепт}}}}}}}}$ = = 2374 ± 62) и 23% (${{{\text{B}}}_{{{\text{ma}}{{{\text{x}}}_{{{\text{селанк}}}}}}}}$ = 2770 ± 60), соответственно (p < 0.05, t-тест Стьюдента), а и/н введение ноопепта и семакса уменьшает на 27% (${{{\text{B}}}_{{{\text{ma}}{{{\text{x}}}_{{{\text{ноопепт}}}}}}}}$ = = 1577 ± 24) и 21% (${{{\text{B}}}_{{{\text{ma}}{{{\text{x}}}_{{{\text{семакс}}}}}}}}$ = 1660 ± 63), соответственно (p < 0.05, t-тест Стьюдента), количество мест связывания NMDA-рецепторов гиппокампа. У мышей C57BL/6 в/б введение семакса и и/н введение ноопепта уменьшает на 29% (${{{\text{B}}}_{{{\text{ma}}{{{\text{x}}}_{{{\text{семакс}}}}}}}}$ = = 1800 ± 36) и 22% (${{{\text{B}}}_{{{\text{ma}}{{{\text{x}}}_{{{\text{ноопепт}}}}}}}}$ = 2205 ± 106) соответственно (p < 0.05, t-тест Стьюдента), плотность NMDA-рецепторов.

При обоих путях введения всех трех пептидов у мышей BALB/c не происходило изменений характеристик mGluII-рецепторов в префронтальной коре мозга, у мышей C57BL/6 под влиянием в/б введения ноопепта и обоих введений семакса плотность mGluII-рецепторов коры мозга уменьшалась на 19% (${{{\text{B}}}_{{{\text{ma}}{{{\text{x}}}_{{{\text{ноопепт}}}}}}}}$ = 981 ± 73), 18% (${{{\text{B}}}_{{{\text{ma}}{{{\text{x}}}_{{{\text{семакс}}}}}}}}$ = = 986 ± 79) и 16% (${{{\text{B}}}_{{{\text{ma}}{{{\text{x}}}_{{{\text{семакс}}}}}}}}$ = 1007 ± 76), соответственно (p < 0.05, t-тест Стьюдента).

Регуляторные пептиды являются универсальными эндогенными биорегуляторами клеточных функций в организме человека, среди которых особое место занимают нейропептиды – регуляторы функций нервной системы. Каждый регуляторный пептид проявляет спектр биологической активности, определяемый, во-первых, его непосредственным взаимодействием с клеткой-мишенью и, во-вторых, его способностью индуцировать высвобождения ряда других пептидов, которые в свою очередь, также могут служить индукторами высвобождения следующей группы пептидов и т.д., в результате чего первичные эффекты того или иного пептида пролонгируются и развиваются в организме [17].

В настоящем исследовании была поставлена задача сопоставления эффектов препаратов при и/н и в/б путях введения. Для комплексного подхода действие селанка, ноопепта и семакса было изучено на разных уровнях: поведенческом и рецепторном. Помимо этого были взяты разные линии мышей C57BL/7 и BALB/c, различающиеся как по фенотипу поведения в условиях незнакомой обстановки в ЗКЛ, так и по исходному состоянию NMDA- и mGluII -рецепторов в гиппокампе и коре мозга соответственно [24].

Внутрибрюшинный путь введения лекарственных средств по скорости воздействия приближается к внутривенному, но в клинических условиях он используется крайне редко. Висцеральный листок брюшины, богатый кровеносными сосудами, выделяет в полость серозную жидкость, а париетальный листок за счет лимфатических сосудов ее всасывает. Предполагается, что лекарственное вещество, введенное внутрибрюшинно, попадает в лимфатическую систему, протоки которой впадают в грудные вены большого круга кровообращения, которые в свою очередь переходят в систему верхней полой вены, заканчивающую свой путь в правом предсердии [18, 19].

При интраназальном введении веществ значительная их часть всасывается в кровь, меньшая – при помощи периневрального транспорта по чувствительным нервам попадает непосредственно в мозг через нейроны обонятельного тракта и далее распространяется по структурам головного мозга при помощи механизмов, не связанных с кровотоком. При этом исключается пресистемный метаболизм в желудочно-кишечном тракте и печени, быстрее достигается терапевтический эффект, то есть используется возможность прямого поступления лекарств непосредственно в мозг. Механизмы, участвующие в доставке веществ из носовой полости в мозг, изучены недостаточно, но обсуждаются несколько вариантов. Скорее всего, используемым пептидам присущ экстранейрональный транспорт вдоль обонятельного нерва, посредством которого короткие пептидные молекулы могут попадать напрямую в нервную ткань по межклеточному пространству через щелевые контакты между поддерживающими клетками и обонятельными нейронами [20, 21].

Для анализа влияния исследуемых пептидов на рецепторные характеристики в исследовании были выбраны два типа глутаматных рецепторов: ионотропные NMDA- и метаботропные mGluII. Активность первого связывают преимущественно с процессами обучения и памяти [22], тогда как второго – с состоянием тревожности [6].

В результате были получены схожие по ряду показателей эффекты в/б и и/н путей введения селанка, ноопепта, семакса на поведении в ЗКЛ, и различное влияние на эти рецепторы.

В тесте ЗКЛ в обоих случаях увеличивалась исследовательская активность мышей линии BALB/c, исходно характеризующихся меньшей эффективностью исследовательского поведения. При этом в случае назального введения препарата влияние было более выраженным: показатель эффективности обследования лабиринта F_PtrN и PatrlN, указывающие на наличие ноотропной активности [10], изменялись в большей степени – 27% (селанк), 29% (ноопепт) и 36% (семакс), тогда как при внутрибрюшинном – всего на 10%, 2% и 16%, соответственно. Кроме того, на исходно более тревожных мышах BALB/c в данном тесте проявился анксиолитический эффект пептидов, который был ярче выражен при в/б введении: показатели F_ChTm и F_GlTm уменьшались на 43% (селанк), 53% (ноопепт) и 57% (семакс), тогда как при и/н – на 29, 34 и 40% соответственно. Сводные данные по влиянию всех трех пептидов при в/б и и/н введениях на поведенческие параметры мышей C57BL/7 и BALB/c в тесте ЗКЛ представлены в табл. 4.

Таблица 4.  

Сопоставление поведенческих эффектов при разных путях введения исследуемых веществ

Вещества Поведение
Исследовательская активность Тревожность Двигательная активность
F_ PtrN PatrlN F_ChTm F_GlTm T_ChTm T_GlTm
BALB/c C57Bl/6 BALB/c C57Bl/6 BALB/c C57Bl/6 BALB/c C57Bl/6 BALB/c C57Bl/6 BALB/c C57Bl/6
Селанк в/б + 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
↓ 10%       ↓ 43%              
Селанк и/н + 0 0 0 0 0 0 + 0 0 0
↓ 27%       ↓29%       ↓ 17%      
Семакс в/б + 0 + 0 0 + 0 0 0 0
↓ 16%   ↑ 10%   ↓ 57%   ↓ 35% ↑ 59%        
Семакс и/н + 0 + 0 0 0 + + 0 + 0
↓ 15%   ↑ 36%       ↓ 40% ↑ 46% ↓ 22%   ↓ 5%  
Ноопепт в/б 0 0 + 0 0 0 0 0 0 0
    ↑ 2%   ↓ 53%   ↓ 28%          
Ноопепт и/н + 0 + 0 0 0 + 0 0 0 0
↓ 29%   ↑ 12%       ↓ 34% ↑ 88%       ↑ 39%

Примечание: +, – и 0 – усиление, ослабление и отсутствие эффекта в сравнении с контролем.

Таким образом, на основании сопоставления полученных результатов можно выделить общие свойства селанка, семакса и ноопепта при разных путях введения: при в/б введении три пептида сильнее проявляют свои анксиолитические свойства, а при и/н – ноотропные на мышах линии BALB/c.

Полученную разницу в соотношении ноотропного и анксиолитического компонентов при в/б и и/н введении ноопепта и семакса можно интерпретировать с нескольких точек зрения.

При разных путях введения у препаратов могут наблюдаться различная биотрансформация, следовательно, образующиеся метаболиты могут проявлять неодинаковые фармакологические эффекты.

В случае селанка в плазме крови около 90% пептидазной активности идет на образование из исходного гептапептида молекул пентапептида TKPRP и наиболее долгоживущего трипептида TKR [23], самостоятельная психофармакологическая активность которых еще не установлена.

Семакс (Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro) распадается в сыворотке крови крыс под воздействием аминопептидаз и ангиотензин-преобразующего фермента [24]. Первым отщепляется метионин в положении 1, оставляя гексапептид (Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro), затем глутамин в положении 2 (His-Phe-Pro-Gly-Pro). Эти фрагменты являются стабильными нейропептидами, самостоятельно модулирующими холинергическую нейропередачу и генерацию оксида азота [25, 26]. Кроме того, под влиянием аминопептидаз семакс может метаболизироваться в тетрапептид Met-Glu-His-Phe и трипептид Pro-Gly-Pro, оказывающие влияние на функциональную активность нервной клетки [27, 28]. Дальнейший распад всех пептидов продолжается до отдельных аминокислот, которые как абсолютно естественные для организма включаются в обменные процессы [24].

Ноопепт (этиловый эфир N-фенилацетил-L-пролилглицина), абсорбируясь в желудочно-кишечном тракте, в неизмененном виде поступает в системный кровоток, проникает через гематоэнцефалический барьер, определяется в мозге в больших концентрациях, чем в крови. Пептид частично сохраняется в неизмененном виде, частично метаболизируется с образованием фенилуксусной кислоты, фенилацетилпролина и циклопролилглицина (ЦПГ). Последний, являясь основным метаболитом ноопепта, обладает структурным сходством с эндогенным нейропептидом [29]. Неизмененный ноопепт обнаруживается в малых количествах в сыворотке, поскольку он быстро метаболизируется в течение 25 мин после перорального приема. Кроме того, ЦПГ сам по себе имеет ноотропный потенциал при введении в форме инъекций, хотя в меньшей степени, чем ноопепт [30]. В настоящее время считается, что ноопепт действует в качестве пролекарства для ЦПГ, и именно в этой форме ЦПГ проявляет большую активность. Однако, существуют данные, что при приеме ноопепта в виде инъекций и перорально (в дозе 0.5 мг/кг и 10 мг/кг, соответственно) наблюдаются антиамнестические эффекты, которые усиливаются при субхроническом введении в течение 9 дней, тогда как при инъекциях ЦПГ усиления эффекта не наблюдается [31]. Эффекты ноопепта и ЦПГ не идентичны, и это может быть связано с тем, что либо ноопепт в отличие от ЦПГ, обладает накопительным действием, либо действие последнего усиливается под влиянием других метаболитов.

Другой причиной различия эффектов после в/б и и/н введений пептидов может быть первичное поступление в разные области мозга. В/б введение сравнимо с внутривенным, при котором небольшие пептиды проникают в мозг через гематоэнцефалический барьер и с общим кровотоком достигают разных отделов мозга [24, 32]. Обнаружено, что вещества, попадающие в мозг по обонятельному нерву, преимущественно распределяются в ростральные отделы мозга, включая обонятельные луковицы, фронтальную кору, гиппокамп, миндалину [3234].

В наших экспериментах более выраженное ноотропное действие семакса и ноопепта при интраназальном введении свидетельствует о том, что пептиды посредством экстранейронального пути через обонятельный эпителий попадают в большей степени в области мозга, связанные с процессами памяти и обучения, а при в/б введении преимущественно в структуры мозга, ответственные за эмоциональный статус (передний мозг и лимбические области), вследствие чего преобладает анксиолитический эффект.

Таким образом, полученные различия в рецепторных мишенях при в/б и и/н путях введения можно также объяснить выше упомянутыми факторами. Повышение плотности NMDA-рецепторов в гиппокампе под влиянием в/б введения ноопепта и и/н введения селанка у мышей BALB/c может объяснять улучшение исследовательской активности в тесте ЗКЛ. Понижение этих же самых рецепторов при и/н введении ноопепта и семакса предполагает, что скорее всего ноотропный эффект в данном случае достигается другими механизмами.

Ни один из пептидов при обоих путях введения у мышей BALB/c не влиял на характеристики mGluII- рецепторов, что указывает на то, что эти рецепторы не участвуют в формировании анксиолитического эффекта у данной линии. В свою очередь, анксиогенное действие при обоих введениях семакса у С57Bl/6 может быть связано со снижением количества метаботропных глутаматных рецепторов в коре мозга. В целом, в группе С57Bl/6 наблюдается схожесть влияния ноопепта и семакса на оба типа глутаматных рецепторов, что проявляется в уменьшении их плотности в выбранных структурах мозга.

Полученную в нашем исследовании разницу в соотношении ноотропной и анксиолитической составляющих и рецепторных мишенях пептидных препаратов в зависимости от пути введения можно использовать для достижения необходимого терапевтического эффекта.

ВЫВОДЫ

1. У мышей BALB/с семакс, ноопепт и селанк положительно влияют на исследовательское поведение и снижают тревожность при обоих путях введения, при этом ноотропный эффект ярче проявляется при и/н введении по сравнению с в/б, тогда как анксиолитический эффект этих пептидов более выражен при в/б введении.

2. У мышей C57BL/6 при обоих путях введения семакса, ноопепта и селанка не наблюдается ноотропного и анксиолитического эффектов, а семакс, напротив, проявляет анксиогенный эффект, более выраженный при в/б пути введения по сравнению с и/н.

3. У мышей BALB/с плотность NMDA-рецепторов изменяется следующим образом: под влиянием и/н введения увеличивается у селанка, уменьшается у ноопепта и семакса, и только внутрибрюшинное введение ноопепта увеличивает этот параметр; плотность mGluII-рецепторов остается неизменной при обоих путях введения.

4. У мышей линии C57BL/6 наблюдается снижение мест связывания глутаматных рецепторов: NMDA-рецепторов – под влиянием в/б введения семакса и и/н введения ноопепта, mGluII-рецепторов – под влиянием в/б введения ноопепта и обоих путей введения семакса.

5. Разный спектр фармакологических эффектов селанка, ноопепта и семакса под влиянием в/б и и/н путей может быть обусловлен как факторами фармакокинетики и биотрансформации, так и динамикой образования ноотропного и анксиолитического действия препаратов.

Список литературы

  1. Васильева Е.В., Салимов Р.М., Ковалев Г.И. // Экспериментальная и клиническая фармакология. 2012. Т. 75. № 7. С. 32–37.

  2. Васильева Е.В. Золотарев Ю.А., Ковалев Г.И. // Нейрохимия. 2013. Т. 30. № 2. С. 135–141.

  3. Ковалев Г.И., Кондрахин, Е.А., Салимов Р.М. // Нейрохимия. 2013. Т. 30. № 2. С. 128–134.

  4. Ковалев Г.И., Кондрахин Е.А., Салимов Р.М., Незнамов Г.Г. // Экспериментальная и клиническая фармакология. 2014. Т. 77. № 12. С. 49–55.

  5. Ковалев Г.И., Фирстова Ю.Ю. // Клиническая фармакология и терапия. 2010. Т. 19. № 6. С. 72–73.

  6. Linden A. M., Baez M., Bergeron M., Schoepp D.D. // Neuropharmacology. 2006. V. 51. P. 213–228.

  7. Glowinski L.L. Iversen J. // J. Neurochem. 1966. T. 13. № 8. P. 655–669.

  8. Васильева Е.В., Кондрахин Е.А., Салимов Р.М., Ковалев Г.И. // Экспериментальная и клиническая фармакология. 2016. Т. 79. № 9. С. 3–11.

  9. Васильева Е.В., Салимов Р.М., Ковалев Г.И. // Фармакокинетика и фармакодинамика. 2016. № 2. С. 31–36.

  10. Салимов Р.М. // Журн. ВНД. 1988. Т. 38. № 3. С. 569–571.

  11. Salimov R.M. // Alcohol. 1999. № 17. P. 157–162.

  12. Миронов А.Н. // Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. М.: Гриф и К, 2012. 944 с.

  13. Ковалев Г.И., Васильева Е.В., Салимов Р.М. // Журн. ВНД. 2019. Т. 69. № 1. С. 123–130.

  14. Zhou L.M., Gu Z.Q., Costa A.M., Yamada K.A., Manssone P.E. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1997. V. 280(1). P. 422–427.

  15. LaPage K.T., Ishmael J.E., Low C.W., Traynelis S.F., Murray T.F. // Neuropharmacology. 2005. V. 49. P. 1–16.

  16. Schaffhauser H., Richards J.G., Cartmell J., Chaboz S., Kemp J.A., Klingelschmidt A., Messer J., Stadler H., Woltering T., Mutel V. // Mol. Pharmacol. 1998. V. 53. P. 228–233.

  17. Соллертинская Т.Н., Шорохов М.В., Н.Ф. Мясоедов Н.Ф. и др. // Асимметрия. 2014. № 4. С. 53–65.

  18. Richard L.D., Vogl A.W., Adam W.M.M. Grays Anatomy for Students, 2nd Edition, Abdominal Viscera. 2009. 406 p.

  19. Das R.G. and North D. // Laboratory Animals. 2007. № 41. P. 312–320.

  20. Hanson L. R., Frey H. F. // BMC Neuroscience. 2008. V. 9. P. S3–S5.

  21. Illum L. // Eur. J. Pharm. Sci. 2000. V. 11. P. 1–18.

  22. Van Dongen A.M. Biology of the NMDA Receptor (Frontiers in Neuroscience), CRC, Boca Raton, 2008. 367 p.

  23. Золотарев Ю.А., Дадаян А.К., Долотов О.В. и др. // Биоорганическая химия. 2006. Т. 32. № 2. С. 183–191.

  24. Potaman V.N., Antonova L.V., Dubynin V.A., Zaitzev D.A., Kamensky A.A., Myasoedov N.F., Nezavibatko V.N. // Neurosci. Lett. 1991. V. 127. № 1. P. 133–138.

  25. Ашмарин И.П., Незавибатько Н.Н., Мясоедов Н.Ф., Каменский А.А. // Журн. ВНД. 1997. Т. 47. С. 419–425.

  26. Ashmarin I.P., Kamensky A.A., Myasoedov N.F., Skvortsova V.I. // Regulatory Peptides. 2000. V. 89. P. 51

  27. Storozhevykh T.P., Tukhbatova G.R., Senilova Y.E., Pinelis V.G., Andreeva L.A., Myasoyedov N.F. // Bull. Exp. Biol. Med. 2007. V. 143. № 5. P. 601–604.

  28. Dmitrieva V.G., Povarova O.V., Skvortsova V.I., Limborska S.A., Myasoedov N.F., Dergunova L.V. // Cell. Mol. Neurobiol. 2010. V. 30. № 1. P. 71–77.

  29. Бойко С.С., Жердев В.П., Дворянинов А.А., Гудашева Т.А., Островская Р.У., Воронина Т.А., Розанцев Г.Г., Середенин С.Б. // Экспериментальная и клиническая фармакология. 1997. Т. 60. С. 101–104.

  30. Ostrovskaya R.U., Mirsoev T.K., Romanova G.A., Gudasheva T.A., Kravchenko E.V., Trofimov C.C., Voronina T.A., Seredenin S.B. // Bull. Exp. Biol. Med. 2001. V. 132. № 4. P. 959–962.

  31. Ostrovskaya R.U., Romanova G.A., Barskov I.V., Shanina E.V., Gudasheva T.A., Victorov I.V., Voronina T.A., Seredenin S.B. // Behav. Pharmacol. 1999. V. 10. № 5. P. 549–553.

  32. Манченко Д.М., Глазова Н.Ю., Левицкая Н.Г., Андреева Л.А., Каменский А.А., Мясоедов Н.Ф. // Российский физиологический журн. им. И.М. Сеченова. 2010. Т. 96. № 10. С. 1014–1023.

  33. Chen X.Q., Fawcett J.R., Rahman Y.E., Ala T.A., Frey W.H. // J. Alzheimers Dis. 1998. V. 1. № 1. P. 35–44.

  34. Hanson L.R., Frey W.H. // J. Neuroimmune Pharm. 2007. V. 2. P. 81–86.

Дополнительные материалы отсутствуют.