Нейрохимия, 2020, T. 37, № 3, стр. 228-232

Содержание и активность гипоксия-индуцируемого фактора HIF1α увеличены в гиппокампе новорожденных крыс, переживших пренатальную гипоксию на 14–16 сутки эмбриогенеза

О. В. Ветровой 12, П. П. Нимирицкий 3, Е. И. Тюлькова 1, Е. А. Рыбникова 1

1 Лаборатория регуляции функций нейронов мозга, ФГБУН Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН
Санкт-Петербург, Россия

2 Кафедра биохимии, ФГБОУ ВО Санкт-Петербургский государственный университет
Санкт-Петербург, Россия

3 Институт регенеративной медицины, Медицинский научно-образовательный центр, ФГБОУ ВО Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова
Москва, Россия

Поступила в редакцию 14.03.2020
После доработки 08.04.2020
Принята к публикации 17.04.2020

Полный текст (PDF)

Аннотация

Методами вестерн блот и количественной ПЦР в реальном времени изучали содержание регуляторной альфа субъединицы гипоксия-индуцируемого фактора-1 (HIF1α) и количество мРНК регулируемых HIF1 генов лактатдегидрогеназы А (ldha) и глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы (g6pd) в гиппокампе 1-дневных крысят, матери которых подвергались трем сеансам тяжелой повреждающей гипоксии на 14–16 сут беременности. Пренатальная гипоксия вызывает устойчивое увеличение содержания HIF1α, а также ведет к увеличению количества мРНК ldha и уменьшению количества мРНК g6pd. Результаты свидетельствуют о том, что стимуляция опосредованных гипоксией перестроек метаболизма гиппокампа в результате пренатальной гипоксии, очевидно, является устойчивой, что может вызывать нарушения энергетического метаболизма мозга в дальнейшем онтогенезе.

Ключевые слова: пренатальная гипоксия, гиппокамп, HIF1

ВВЕДЕНИЕ

Хорошо известно, что значительная часть распространенных заболеваний, в том числе неврологических и нервно-психических, возникает в результате повреждающего действия на мозг различных неблагоприятных факторов, среди которых ведущую роль занимает гипоксия/ишемия [1, 2]. Особенно опасно действие гипоксии в раннем онтогенезе – в период пренатального и раннего постнатального развития [3, 4]. Нарушения развития мозга вследствие этого воздействия проявляются на ранних стадиях постнатального развития, сохраняются у взрослых и усугубляются с возрастом, ведя к преждевременному старению и ранней смертности [58].

Ранее нами и другими исследователями было установлено, что тяжелая гипобарическая гипоксия в пренатальном периоде развития приводит к устойчивым нарушениям двигательного, эмоционального, исследовательского поведения и способности к обучению, в основе которых лежат изменения функционирования центральной нервной системы на молекулярно-клеточном уровне [9, 10]. Патологии развития мозга, вызванные пренатальной гипоксией (ПГ), в первую очередь определяются стрессорным ответом матери на внешнее воздействие, в результате чего происходит выброс стрессовых гормонов в кровь, которые приводят к нарушениям в материнской и фетальной частях плаценты [11, 12]. В наших работах мы показали, что введение синтетического гормона дексаметазона или предъявление сеансов тяжелой гипобарической гипоксии на 14–16-е сутки беременности приводят к нарушениям развития мозга потомства, степень и направленность которых зависят от типа воздействия [9, 10]. В какой степени наблюдающиеся при повреждающих гипоксических/ишемических воздействиях во время беременности изменения обусловлены собственно гипоксическим фактором, а в какой – неспецифической стрессовой реакцией матери, до сих пор остается неясным. Гипоксия- индуцируемый фактор-1 (HIF1) является одним из основных регуляторов клеточного ответа на гипоксические воздействия [1317], обеспечивая регуляцию экспрессии генов, участвующих в ангиогенезе, анаэробном метаболизме, апоптозе [18, 19]. Чтобы оценить вклад гипоксической составляющей, было интересно изучить уровень экспрессии регуляторной альфа субъединицы HIF1, HIF1α, и оценить интенсивность HIF1-зависимой транскрипции. Задачей настоящего исследования было оценить уровень содержания регуляторной альфа субъединицы гипоксия-индуцируемого фактора-1 (HIF1α), а также измерить количество мРНК HIF1-зависимых генов (активируемый HIF1 ген ldha [20] и супрессируемый HIF1 ген g6pd [21]) в гиппокампе 1-дневных крысят, подвергавшихся гипоксии на 14–16-е сутки пренатального развития.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Животные и модель пренатальной гипоксии. Работа выполнена на взрослых самках крыс линии Wistar весом 300–350 г и их потомстве. Животные были получены из Биоколлекции Института физиологии им. И.П. Павлова РАН и содержались в лабораторных условиях при свободном доступе к воде и пище. При проведении экспериментов соблюдались требования, сформулированные в Директивах Совета Европейского сообщества (86/609/EEC) об использовании животных для экспериментальных исследований. Протоколы опытов были утверждены Комиссией по гуманному обращению с животными Института физиологии им. И.П. Павлова РАН.

Эксперименты проведены на 2 группах крыс: 1) контроль; 2) трехкратная тяжелая гипоксия (пренатальная гипоксия, ПГ).

Для создания ПГ беременных самок помещали трижды (на 14, 15 и 16 сутки беременности) в барокамеру проточного типа и снижали давление до 180 мм. рт. ст., что соответствует подъему на высоту 11 000 м. Длительность воздействия 3 ч. Дальнейшая работа производилась на 1-дневных детенышах самцах (для каждой группы n = 6).

Пробоподготовка. Гиппокамп быстро извлекали и замораживали в жидком азоте для дальнейшего выделения цитозольной и ядерной фракции и анализа белков интереса методом вестерн блот либо помещали в тризол (ThermoFisher, США) для экстракции РНК и последующего количественного анализа экспрессии генов интереса.

Выделение ядерных и цитозольных белков, вестерн блот. Ядерные и цитозольные белки ПГ и контрольных 1-дневных крысят выделяли с использованием коммерческого набора (78833, NE-PER™ Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents, ThermoFisher, США) согласно инструкциям производителя. Белки разделяли методам электрофореза в полиакриламидном геле по Лэммли и осуществляли электроперенос на нитроцеллюлозную мембрану (Bio-Rad, США). Далее, после блокировки в течение 1 часа в 5% молоке, мембраны инкубировали с кроличьими антителами против HIF1α (1 : 1000, ab2185, Abcam, США) и β-актина (1 : 2000, a9044, Sigma Ald., США) или мышиными антителами против NeuN (1 : 2000, ab104224, Abcam, США) в течение ночи при +4°C. Мембраны отмывали в TBST буфере и инкубировали с противокроличьими (1 : 10 000, a16096, Thermo Scientific, США) или противомышиными (1 : 40 000, a9044, Sigma Ald., США) HRP-антителами в течение 1.5 ч при комнатной температуре. Визуализацию белков интереса осуществляли с применением Clarity Max ECL хемилюминесцентного набора (Bio-Rad, США) используя систему документирования ChemiDoc MP Imaging System (Bio-Rad, США). Количественный анализ белка HIF1α проводили с использованием программы ImageJ (NIH, Bethesda, MD, США) нормируя данные на β-actin (цитозольная фракция) или NeuN (ядерная фракция) для количественного анализа и с целью исключения влияния внутри- и межгрупповых особенностей клеточного состава тканей.

Выделение и очистка РНК, обратная транскрипция и количественная ПЦР в реальном времени. Общую РНК из гиппокампа 1-дневных крыс изолировали, используя ExtractRNA набор (BC032, Евроген, Россия), очищали от ДНК с применением DNAseI (EN0521, ThermoFisher, США) и CleanRNA Standard набор (BC033, Евроген, Россия) согласно инструкциям производителя. Синтез кДНК проводили из 1 мкг тотальной РНК используя набор MMLV Reverse Transcription Kit (SK021, Евроген, Россия). Количественную ПЦР в реальном времени проводили, используя qPCRmix‑HS SYBR + LowROX набор (Евроген, Россия) на амплификаторе SimpliAmp Thermal Cycler (Applied Biosystems, США). Последовательности праймеров, температуры плавления и размеры фрагментов представлены в табл. 1.

Таблица 1.  

Праймеры, использованные для количественной ПЦР в реальном времени

Ген Праймеры (5'–3') Температура плавления T, °C Размер продукта, п.н.
Бета-2 микроглобулин (b2m) Forward TGCCATTCAGAAAACTCCCC Reverse GAGGAAGTTGGGCTTCCCATT 57 73
Лактатдегидрогеназа А (ldha) Forward CGAGAGCATAATGAAGAAC Reverse TCCTTGATTCCATAGAGAC 57 75
Глюкозо-6-фосфат дегидрогеназа (g6pd) Forward AAGATGATGACCAAGAAG Reverse TTGTATCTGTTGCCATAG 57 80

Уровни содержания мРНК HIF1-зависимых генов (HIF1-активируемого гена лактатдегидрогеназы А (ldha) и HIF1-супрессируемого гена глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (g6pd)), нормированные на мРНК бета-2 микроглобулина (b2m) в качестве референса, были исследованы с использованием ΔΔCt метода.

Статистическая обработка результатов. Результаты обрабатывали с помощью пакетов анализа данных STATISTICA 7.0 Stat Soft, Inc и Microsoft Excel’2003, использовали непараметрический критерий Манна–Уитни (Mann–Whitney U-test). Изменения считали достоверными при p ≤ 0.05. Все результаты представлены в виде среднего арифметического ± SEM (standard error of the mean).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для оценки влияния ПГ на активность системы HIF1 в гиппокампе 1-дневных ПГ крысят мы осуществили анализ распределения белка HIF1α между ядерной и цитозольной фракциями методом вестерн блот и провели количественный анализ мРНК HIF1-зависимых генов ldha и g6pd.

ПГ вызывает устойчивое увеличение накопления HIF1α в цитозольной фракции гиппокампа 1-дневных крысят (133% от контроля) (рис. 1а, 1в), что сопровождается увеличением его количества и в ядерной фракции до 159% от контроля (рис. 1б, 1г). Увеличенная эффективность транслокации HIF1α в ядро сопровождается уменьшением содержания мРНК HIF1-супрессируемого гена g6pd (рис. 1д) и увеличением содержания мРНК HIF1-индуцируемого гена ldha (рис. 1е) (66% и 226% от контроля, соответственно).

Рис. 1.

Количество белка HIF1α в цитозольной (а, в) и ядерной (б, г) фракциях гиппокампа, количество мРНК HIF1-супрессируемого гена g6pd (д) и HIF1-активируемого гена ldha (е) в гиппокампе контрольных и ПГ 1-дневных крысят, переживших ПГ на 14–16 сутки эмбриогенеза. Данные представлены в % от контроля. Белые столбики – контроль, 100% (n = 6); черные столбики – ПГ (n = 6). * Различия с контролем статистически достоверны, р ≤ 0.05.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Гипоксия является одним из наиболее важных и клинически значимых стрессорных воздействий на плод. До сих пор многие исследователи полагают, что основой патологии развития мозга при действии гипоксии в период пренатального онтогенеза является выброс стресс гормонов матери в ответ на повреждающее воздействие, которые влияют как на состояние плаценты, так и непосредственно на развитие пола. На модели пренатальной гипоксии Райса–Ванутси было показано значительное увеличение белка HIF-1α в головном мозге 21-суточного плода (накануне родов), что является показателем гипоксии тканей головного мозга плода [1]. Полученные в настоящей работе данные показывают, что пренатальная гипоксия, предъявляемая в период закладки гиппокампа на 14–16-е сутки эмбриогенеза [3, 4], вызывает продолжительное увеличение содержания и активности транскрипционного фактора HIF1α, сохраняющееся у новорожденных животных.

Увеличение количества и активности HIF1 в незрелых предшественниках нейронов гиппокампа посредством вовлечения эпигенетических механизмов может способствовать стабильному изменению экспрессии генов энергетического метаболизма [19, 21], тем самым нарушая функциональную активность нервных клеток в дальнейшем онтогенезе [10, 11]. Следовательно, одним из важных механизмов показанных нами ранее долговременных нарушений развития мозга вследствие воздействия тяжелой гипобарической гипоксии, предъявляемой крысам на 14–16-е сутки гестации [9], лежат HIF1-зависимые изменения метаболизма в гиппокампе на ранних стадиях онтогенеза.

Список литературы

  1. Gonzalez-Rodriguez P.J., Xiong F., Li Y., Zhou J., Zhang L. // Neurobiol. Dis. 2014. V. 65. P. 172–179.

  2. Li Y., Gonzalez P., Zhang L. // Prog. Neurobiol. 2012. V. 98. P. 145–165.

  3. Golan H. and Huleihel M. // Developmental Sci. 2006. V. 9. P. 338–349.

  4. Rice D., Barone S. // Environmental Health Perspectives. 2000. V. 108. P. 511–533.

  5. Dudley K.J., Li X., Kobor M.S., Kippin T.E., Bredy T.W. // Neurosci. Biobehav. Rev. 2011. V. 35. P. 1544–1551.

  6. Xiong F, Zhang L. // Frontiers in Neuroendocrinology. 2013. V. 34. P. 27–46.

  7. Warner M.J., Ozanne S.E. // Biochem. J. 2010. V. 427. P. 333–347.

  8. Langley-Evans S.C., McMullen S. // Med. Princ. Pract. 2010. V. 19. P. 87–98.

  9. Ватаева Л.А., Тюлькова Е.И., Алёхин А.Н., Стратилов В.А. // Журн. эволюционной физиологии и биохимии. 2018. Т. 54. № 6. С. 404–410.

  10. Tyul’kova E.I., Vataeva L.A., Stratilov V.A., Barysheva V.S., Vetrovoy O.V. // Neurochemical J. 2020. V. 14. № 1. P. 64–72.

  11. Togher K.L., O’Keeffe M.M., Khashan A.S., Gutierrez H., Kenny L.C., O’Keeffe G.W. // Epigenetics. 2014. V. 9. № 6. P. 816–22.

  12. Glover V., O’Donnell K.J., O’Connor T.G., Fisher J. // Dev. Psychopathol. 2018. V. 30. № 3. P. 843–854.

  13. Semenza G.L, Nejfelt M.K., Chi S.M., Antonarakis S.E. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. V. 88. P. 5680–5684.

  14. Wang G.L., Jiang B.H., Rue E.A., Semenza G.L. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V. 92. P. 5510–5514.

  15. Maxwell P.H., Wiesener M.S., Chang G.W., Clifford S.C., Vaux E.C., Cockman M.E., Wykoff C.C., Pugh C.W., Maher E.R., Ratcliffe P.J. // Nature. 1999. V. 399. P. 271–275.

  16. Mircea I., Kondo K., Yang H., Kim W., Valiando J., Ohh M., Salic A., Asara J.M., Lane W.S., Kaelin W.G., Jr. // Science. 2001. V. 292. P. 464–468.

  17. Jakkola P., Mole D.R., Tian Y.M., Wilson M.I., Gielbert J., Gaskell S.J., von Kriegsheim A., Heberstreit H.F., Mukherji M., Schofield C.J., Maxwell P.H., Pugh C.W., Ratcliffe P.J. // Science. 2001. V. 292. P. 468–472.

  18. Zarember K.A., Malech H.L. // J. Clin. Invest. 2005. V. 115. P. 1702–1704.

  19. Sharp F.R., Bernaudin M. // Nat. Rev. Neurosci. 2004. V. 5. P. 437–448.

  20. Greijer A.E., van der Groep P., Kemming D., Shvarts A., Semenza G.L., Meijer G.A., van de Wiel M.A., Belien J.A.M., van Diest P.J., van der Wall E. // J. Pathology. 2005. V. 206. № 3. P. 291–304.

  21. Vetrovoy O., Sarieva K., Lomert E., Nimiritsky P., Eschenko N., Galkina O., Lyanguzov A., Tyulkova E., Rybnikova E. // J. Molecular Neuroscience. 2020. V. 70. P. 635–646.

Дополнительные материалы отсутствуют.