Нейрохимия, 2020, T. 37, № 4, стр. 338-349

Исследование пластичности серотониновой системы мозга с помощью рекомбинантных линий мышей, несущих 1473G-аллель гена триптофангидроксилазы-2 и различающихся дистальным фрагментом хромосомы 13, содержащим ген, кодирующий 5-HT1A рецептор

А. Я. Родный 1, И. И. Белокопытова 1, Е. В. Антонов 1, В. С. Науменко 1, Е. М. Кондаурова 1

1 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение “Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук”
Новосибирск, Россия

Поступила в редакцию 26.03.2020
После доработки 09.06.2020
Принята к публикации 11.06.2020

Полный текст (PDF)

Аннотация

Для исследования влияния дистального фрагмента (103.9–112.4 м.п.н.) хромосомы 13, содержащего ген 5-HT1A рецептора каталептической линии СВА на серотониновую (5-HT) систему мозга у мышей, несущих 1473G-аллель гена ключевого фермента биосинтеза 5-НТ в мозге – триптофангидроксилазы-2 (ТПГ-2), были созданы новые рекомбинантные линии мышей B6-1473GG.CBA-CD13Mit76С (1473GG-76C) и B6-1473GG.CBA-D13Mit76В (1473GG-76B) на основе генома линии C57BL/6. Линии 1473GG-76C и 1473GG-76B несут фрагмент хромосомы 13, содержащий ген Htr1a от линии CBA и линии C57BL/6 соответственно. Обе линии гомозиготны по 1473G-аллелю, понижающему активность ТПГ-2. В результате исследования обнаружено, что линия 1473GG-76C характеризуется повышением уровней мРНК генов Htr1a, Htr2a и гена Maoа (моноаминооксидазы типа А – основного фермента разрушения 5-НТ) в среднем мозге, гена Htr1a в коре, генов Htr1a и Htr2a в гиппокампе по сравнению с 1473GG-76B. Кроме того, у линии 1473GG-76C повышена экспрессия генов, кодирующих ключевые регуляторы гена Htr1a – FREUD-1 и FREUD-2. Уровень мРНК гена Cc2d1а, кодирующего FREUD-1, повышен в коре, а экспрессия гена Cc2d1b, кодирующего FREUD-2, изменена в среднем мозге. Также у линии 1473GG-76C повышен уровень 5-НТ в среднем мозге, гипоталамусе и гиппокампе. В то же время в среднем мозге и коре этих мышей снижен уровень основного метаболита серотонина – 5-ГИУК. Отношение 5-ГИУК/5-НТ, отражающее интенсивность метаболизма 5-НТ, у линии 1473GG-76C снижено во всех исследованных структурах. Таким образом, у 1473GG-76C мышей, гомозиготных по G-аллелю гена Tph2 и несущих ген Htr1a от линии СВА, обнаружены существенные отличия в уровне мРНК ключевых генов 5-НТ системы и метаболизме 5-НТ в мозге по сравнению с мышами линии 1473GG-76B, гомозиготных по G-аллелю гена Tph2 и несущих ген Htr1a от линии С57BL/6.

Ключевые слова: полиморфизм C1473G, ген Tph2, ген Htr1a, рекомбинантные мыши, серотонин, триптофангидроксилаза-2, 5-НТ рецептор

ВВЕДЕНИЕ

Множество фактов убедительно указывает на участие серотонина (5-HT) во многих периферических и центральных физиологических функциях. Такая полифункциональность 5-HT системы основана на большом количестве различных рецепторов, опосредующих действие серотонина. 5-НТ нейроны в мозге и других тканях используют только один путь синтеза серотонина, где посредством триптофангидроксилазы-2 (ТПГ-2) из L-триптофана образуется 5-гидрокситриптофан, из которого с помощью триптофандекарбоксилазы получается серотонин. При передаче сигнала 5-НТ секретируется в синаптическую щель, где оказывает действие на различные 5-НТ рецепторы. Серотониновый транспортер (5-HTT), структура которого является высоко гомологичной у разных видов, в первую очередь ответственен за прекращение действия 5-HT в мозге и многих других тканях посредством обратного захвата высвобожденного серотонина. Метаболическая деградация серотонина в нейронах происходит, главным образом, с помощью фермента моноаминоксидазы типа А (MAO A) [1].

Одним из основных факторов, определяющих уровень серотонина в мозге, является активность лимитирующего фермента его биосинтеза – ТПГ-2 [2]. На сегодняшний день известно по меньшей мере девять миссенс-мутаций в гене Tph2 человека (hTPH2), и было показано, что некоторые из них изменяют активность, растворимость или стабильность фермента. Имеются доказательства связи между функциональными мутациями в гене hTPH2 и психическими заболеваниями: S41Y, P206S и биполярное аффективное расстройство, R441H и униполярная депрессия и R303W и СДВГ [3]. В 2004 году в гене Tph2 мышей был обнаружен однонуклеотидный полиморфизм, который определяется заменой C на G в положении 1473 экзона 11. Полиморфизм C1473G (rs33849125) приводит к замещению пролина аргинином в молекуле TПГ-2 и играет значительную роль в скорости синтеза серотонина в мозге, приводя к 50% снижению активности TПГ-2 [4, 5]. Аллель G, связанный с низкой активностью ТПГ-2, был перенесен из линии CC57Br (G/G) в геном линии C57BL/6 (C/C), и были созданы две рекомбинантные линии мышей B6-1473G и B6-1473C с низкой и нормальной активностью ТПГ-2 соответственно [6]. Однако, не было обнаружено изменения экспрессии ключевых генов серотониновой системы в мозге, кроме снижения экспрессии гена Htr2a в гиппокампе у линии B6-1473G по сравнению с линией B6-1473C. Также не было найдено изменений в уровне серотонина и его метаболита 5-ГИУК (5-гидроксииндолуксусная кислота) в среднем мозге, где располагаются тела серотониновых нейронов, у B6-1473G по сравнению с линией B6-1473C [68].

За последние 30 лет были идентифицированы семь отдельных семейств и клонированы 20 подтипов 5-НТ рецепторов [9]. 5-HT1A рецептор является одним из самых изученных рецепторов серотонина. Это связано с несколькими факторами: этот рецептор играет важную роль в нейрональном развитии и пластичности, контроле различных физиологических функций, а также в механизмах депрессии, тревожности и разного рода психических заболеваний [10, 11]. 5-НТ рецепторы широко представлены в центральной нервной системе, в особенности в миндалевидном комплексе, гиппокампе, перегородке и ядрах шва среднего мозга [12, 13]. 5-НТ рецепторы в ядрах шва выступают в роли соматодендритных ауторецепторов, ингибируя активность серотониновой системы посредством механизма отрицательной обратной связи [10, 11]. 5-НТ рецепторы локализованы также и постсинаптически. 5-НТ рецепторы, локализованные на мембране нейронов пре- и постсинаптически, оказывают различное влияние на активность нейронов мозга [11, 12]. Известно, что изменения в экспрессии гена Htr1a, кодирующего 5-HT1A рецептор, могут дифференциально влиять на пре- и постсинаптические 5-HT рецепторы и, следовательно, на функциональную активность 5-HT системы мозга. Так в промоторе гена рецептора, были обнаружены регуляторные сайты связывания селективных репрессоров фактора FREUD-1 и его гомолога FREUD-2, которые приводят к подавлению экспрессии гена рецептора в мозге [1417]. При сверхэкспрессии FREUD-1 обнаружено подавление экспрессии гена 5-НТ рецептора, а также снижение уровня самого белка 5-НТ рецептора. мРНК FREUD-1 обнаружена в ядрах шва среднего мозга, гиппокампе, коре и гипоталамусе, и показано, что белок FREUD-1 ко-локализован с 5-НТ рецептором [15]. Более того, имеется несколько работ, указывающих на участие FREUD-1 в развитии психопатологий [18, 19]. FREUD-2 является гомологом FREUD-1 и связывается со смежным сайтом FREUD-1, подавляя экспрессию гена 5-НТ рецептора [16, 17]. В отличие от FREUD-1, FREUD-2 слабо экспрессируется в ядрах шва, но при этом была обнаружена его высокая экспрессия в префронтальной коре, где он также ко-локализован с 5-HT1A рецепторами. Наблюдается тенденция к снижению FREUD-2 в префронтальной коре у больных депрессией [16]. Таким образом, транскрипционная регуляция гена Htr1a и изменения его экспрессии могут играть значительную роль в механизмах различного рода психических заболеваний [20].

Недавно в лаборатории нейрогеномики поведения ИЦиГ СО РАН были получены рекомбинантные линии B6.CBA-D13Mit76C (B6-М76С) и B6.CBA-D13Mit76B (B6-М76B) на геноме инбредной линии мышей C57BL/6, содержащие фрагмент 102,73-110,56 м.п.н. хромосомы 13 с геном Htr1a, полученный из предрасположенной к каталепсии линии CBA и устойчивой к каталепсии линии C57BL/6, соответственно. Мыши этих линий характеризуются различной чувствительностью пре- и постсинаптических 5-HT1A рецепторов к хроническому введению агониста 8-OH-DPAT [21]. При исследовании серотониновой системы мозга этих мышей было показано, что у линии B6-M76C снижен метаболизм 5-HT в гиппокампе и это сопровождается повышенной экспрессией гена Htr1a по сравнению с мышами B6-M76B. Кроме того, у мышей B6-M76C, обнаружено снижение общего объема мозга, снижение размера стриатума, мозжечка и гипофиза [21, 22].

В то время как отдельные эффекты полиморфизма C1473G на функционирование 5-НТ системы мозга изучены, его совместное с геном Htr1a влияние на 5-НТ систему остается совершенно неизвестным. Таким образом, целью данной работы является исследование влияния участка дистального фрагмента хромосомы 13, содержащего ген Htr1a каталептической линии CBA на фоне G-аллеля полиморфизма C1473G, определяющим сниженную активность ключевого фермента синтеза 5-HT ТПГ-2, на состояние и пластичность серотониновой системы мозга. Это включает в себя исследование экспрессии генов ключевых элементов синтеза, обратного захвата и деградации серотонина, основных серотониновых рецепторов (Htr1a и его селективные сайленсеры Cc2d1a и Cc2d1b, Htr2a и Htr7), а так же уровень обмена серотонина и его метаболита 5-ГИУК в мозге.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Получение линий

Новые рекомбинантные линии B6-1473GG.CBA-D13Mit76С (1473GG-76C) и B6-1473GG.CBA-D13Mit76В (1473GG-76B) были получены переносом фрагментов хромосомы 13, маркированных полиморфными микросателлитными маркерами: D13Mit211 (103.9 м.п.н.), D13Mit76 (110.56 м.п.н.) и D13Mit260 (112.4 м.п.н.) от ранее полученной в лаборатории рекомбинантной линий мышей B6.CBA-D13Mit76C и B6.CBA-D13Mit76B [21] в геном другой рекомбинантной линии B6-1473G [23], соответственно. Генотипирование полиморфизма С1473G гена Tph2 проводилось в соответствии с опубликованным протоколом [24] с двумя позитивными контрольными праймерами, дающими продукт ПЦР 523 п.н., и с аллель-специфическими праймерами 1473C или 1473G, дающими продукт ПЦР 307 п.н [23]. Для получения линий были взяты самцы линии B6-1473G, которых скрестили с самками B6.CBA-D13Mit76C и B6.CBA-D13Mit76В соответственно. Полученных гибридов F1 от (B6-1473GхB6.CBA-D13Mit76C) (гетерозигот, несущих CBA- и С57BL/6-аллели маркеров D13Mit76, D13Mit211 AKR- и С57BL/6-аллели для маркера D13Mit260 и гетерозигот по полиморфизму C1473G (С/G) скрещивали c друг с другом. Для получения второй линии B6-1473GG.CBA-D13Mit76В полученных гибридов F1 от (B6-1473GхB6.CBA-D13Mit76В) (гомозигот по аллелям С57BL/6 маркеров D13Mit211, D13Mit76, D13Mit260 и гетерозигот по полиморфизму C1473G (С/G) скрещивали c друг с другом. Далее для получения линии B6-1473GG.CBA-D13Mit76С отбирали гомозигот G/G и гомозигот несущих СВА аллели по маркерам D13Mit211, D13Mit76, и AKR аллели для D13Mit260. Для линии B6-1473GG.CBA-D13Mit76В отбирали и гомозигот несущих С57BL/6 -аллели по маркерам D13Mit211, D13Mit76, D13Mit260, и гомозигот G/G. Линия B6-1473GG.CBA-D13Mit76С гомозиготна по СВА-аллелям D13Mit76 и D13Mit211 и по AKR-аллелям D13Mit260 и также гомозиготна по G/G полиморфизму гена Tph2. Линия B6-1473GG.CBA-D13Mit76В гомозиготна по С57BL/6 – аллелям D13Mit76 и D13Mit211 и D13Mit260 и также гомозиготна по G/G полиморфизму гена Tph2. Генотип животного определяли по образцам ДНК, полученной из ткани кончика хвоста, с помощью ПЦР со специфичными для маркеров D13Mit76, D13Mit211, D13Mit260 и C/G праймерами (табл. 1) [22, 23, 25]. Продукты ПЦР разделяли с помощью электрофореза в 2% агарозном геле и визуализировали с использованием окрашивания бромидом этидия.

Таблица 1.

Нуклеотидные последовательности праймеров и их характеристики

Ген Нуклеотидная последовательность Тотж, °C Длина продукта ПЦР, п.н.
Htr1a F 5'-ctgtgacctgtttatcgccctg-3'
R 5'-gtagtctatagggtcggtgattgc-3'
62 200
Htr2a F 5'-agaagccaccttgtgtgtga-3'
R 5'-ttgctcattgctgatggact-3'
61 169
Htr7 F5'-ggctacacgatctactccaccg-3'
R5'-cgcacactcttccacctccttc-3'
65 198
Tph2 F 5'-cattcctcgcacaattccagtcg-3'
R 5'-cttgacatattcaactagacgctc-3'
61 239
Slc6а4 F 5'-cgctctactacctcatctcctcc-3'
R 5'-gtcctgggcgaagtagttgg-3’
63 101
Maoa F 5'-aatgaggatgttaaatgggtagatgttggt-3'
R 5'-cttgacatattcaactagacgctc-3'
61 138
Cc2d1a F 5'-gcaaagccgggcaacatcatc-3'
R 5'-tagcagaggtgggtgtagtgg-3'
60 181
Cc2d1b F 5'-acacgcaccaaagacctgataac-3'
R 5'-gtatccttgtcttcgcccacag-3'
64 114
rPol2 F 5'-tgtgacaactccatacaatgc-3'
R 5'-ctctcttagtgaatttgcgtact-3'
60 194
D13Mit76 F 5'-atgcacctgtctaaatgtgtgc-3'
R 5'-agagggactgtgggactgtg-3'
59 109
D13Mit211 F 5'-tttgcaaaagacaagacttattgc-3'
R 5'-aaaagacatccagttctcaatgg-3'
59 114
D13Mit260 F 5'-taaatttggatgcagacaatgg-3'
R 5'-ttaaaaatagaaatggctctgtgtg-3'
59 115

Исследование уровня мРНК генов и уровень моноаминов в мозге животных изучали на самцах линии B6-1473GG.CBA-D13Mit76С и B6-1473GG.CBA-D13Mit76В. Мыши после отсадки от матерей в возрасте 1 мес. содержались в группах одного пола по 10 особей в клетках размером 40 × 25 × 12 см в стандартных условиях (20–22°C, свободный доступ к еде и воде, 12-ч цикл свет/ темнота). В опытах использовали животных в возрасте 2–3 мес., массой 25 ± 5 г. За 2 дня до выведения из эксперимента животных рассаживали в индивидуальные клетки того же размера, чтобы исключить влияние группового эффекта. После чего мышей декапитировали, на льду выделяли кору, гиппокамп, гипоталамус и область ядер шва среднего мозга, замораживали структуры мозга в жидком азоте и хранили при –80°С до процедуры выделения общей РНК и моноаминов. Все структуры мозга от двух линий выделяли в один день, в первой половине дня (10:00–12:00 ч).

Высокоэффективная жидкостная хроматография

Экстракция. Структуры головного мозга мышей гомогенизировали в гомогенизаторе Поттера-Эльвейма на ледяной бане в 200 мкл 0.6 М хлорной кислоты, содержащей изопреналин (внутренний стандарт) в концентрации 200 нг/мл. Для осаждения белка гомогенат центрифугировали при 12 000 g в течение 15 мин при 4°C. Осадок хранили при –20°C для дальнейшего количественного определения белка согласно протоколу Брэдфорда. Супернатант разводили ультрачистой водой в 2 раза и фильтровали на мембране с диаметром пор 22 мкм. Полученный экстракт использовали для хроматографического анализа.

Хроматографический анализ. Измерения проводили с помощью модульной системы хроматографического анализа (Shimadzu Corporation, США), оснащенной градиентным насосом на четыре растворителя (LC-20AD) с вакуумным дегазатором (DGU-20A5R) и блоком для автоматизированного ввода пробы с петлей объемом 100 мкл (SIL-20A).

Элюирование проводили в изократическом режиме в течение 15 мин. Элюент состоял из 90% 50 мМ фосфатного буферного раствора при pH 3.9 и 10% метанола в присутствии 0.3% натрий 1‑октансульфоната. Скорость подачи элюента составляла 1 мл/мин. Разделение веществ происходило на аналитической колонке (Luna, Penomenex, США) С18 (длина × внутренний диаметр 100 × 4.6 мм) с размером частиц сорбента 5 мкм. Колонка была защищена предколонкой С8 (длина × × внутренний диаметр 12.5 × 4.6 мм, 5 мкм). Колонка была термостатирована при 40°С.

Биогенные амины детектировали на электрохимическом детекторе DECADE II (стеклоуглеродная проточная ячейка VT-03 длиной 3 мм) (Antec, Нидерланды) при установленном потенциале +0.7 В относительно потенциала хлорсеребряного электрода сравнения. Сигнал детектора снимался интегратором CBM-20A (Shimadzu Corporation, США) и обрабатывался в программе Labsolutions (Shimadzu). Предел количественного определения – 20 пг в пробе при отношении сигнал–шум 5 : 1.

ОТ-ПЦР в реальном времени

Экспрессию генов определяли с помощью количественного метода обратной транскрипции с последующей полимеразной цепной реакцией (ОТ-ПЦР), разработанного в нашей лаборатории [2628]. Использовали два типа стандартов: внешний и внутренний. Внутренний стандарт (мРНК rPol2) применяли для контроля обратной транскрипции в качестве основы для расчета уровня мРНК исследуемых генов. В предварительных опытах не были выявлены различия в уровне мРНК rPol2 в исследуемых структурах мозга. Внешним стандартом служила ДНК мыши известной концентрации, что позволило контролировать ПЦР и определять число копий мРНК исследуемых генов rPol2 в образцах.

Выделение общей РНК

Общая РНК была выделена с помощью TRIzolReagent (“Lifetechnologies”, США) в соответствии с инструкцией производителя с последующей обработкой ферментом ДНКазой по протоколу производителя (Promega inc., США). РНК была разведена водой до концентрации 0.125 мкг/мкл и хранилась при –70°С. Присутствие примесей геномной ДНК в препаратах РНК определяли в соответствии с протоколом, описанным ранее [27, 28].

Реакция обратной транскрипции

Общая РНК (8 мкл, или 1 мкг) была смешана со 180 нг статистического праймера длиной 6 нуклеотидов (конечная концентрация праймера составила 5 мкМ) и 2.25 мкМ стерильного KCl в объеме 16 мкл, денатурирована при 94°C в течение 5 мин на амплификаторе “БИС” М-120 (БИС-Н, Россия), после чего был проведен отжиг при 41°C в течение 15 мин, затем было добавлено 15 мкл смеси, содержащей обратную транскриптазу M-MLV (200 ед.), Tris-HCl (pH 8.3, 0.225 мкмоль), смесь dNTP (0.015 мкмоль каждого), DTT (0.225 мкмоль) и MnCl2 (0.03 мкмоль). Полученная смесь (конечным объемом 31 мкл) была инкубирована при 41°C в течение 60 мин. Синтезированная кДНК хранилась при температуре –20°C.

Полимеразная цепная реакция в реальном времени (real-time PCR)

Праймеры, используемые для амплификации кДНК исследуемых генов (табл. 1), разработаны на основе последовательностей, опубликованных в базе данных EMBL Nucleotide database, и синтезированы в компании “Биосан” (Новосибирск, Россия). 1 мкл кДНК смешивали с 2.5 мкл ПЦР буфера (содержит интеркалирующий краситель SYBR green I и референсный краситель ROX), 2.5 мкл 2.5 мМ dNTP, 2.5 мкл 25 мМ MgCl2, 2.5 мкл смеси праймеров (прямого и обратного), 0.2 мкл Taq ДНК-полимеразы и стерильной воды до конечного объема 20 мкл. При приготовлении реакционной смеси были использованы наборы реагентов “Синтол” (Москва, Россия). ПЦР была проведена на амплификаторе LightCycler 480 System (Roche, Swizerland) в соответствии со следующим протоколом: 3 мин 94°C, 1 цикл; 10 с при 94°C, 30 с при соответствующей температуре отжига (табл. 1), 30 с при 72°C, 40 циклов. Серия разведений геномной ДНК с концентрацией 0.125, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64 и 128 нг/мкл амплифицировалась одновременно в отдельных пробирках и использовалась как внешний экзогенный стандарт для построения калибровочной кривой. Калибровочная кривая в координатах Ct (значение порогового цикла) – lgP (десятичный логарифм количества стандарта ДНК) была построена автоматически программным обеспечением LightCycler 480 System. Экспрессия генов представлена как отношение количества кДНК исследуемых генов к 100 копиям кДНК rPol2, выполняющей функцию внутреннего стандарта.

Статистический анализ

Результаты были представлены как m ± SEM и сравнены при помощи однофакторного дисперсионного анализа ANOVA в программе STATISTICA. Статистическая значимость была на уровне р < 0.05. Нормальности дисперсий проверялись с помощью критериев Колмогорова–Смирнова и Шапиро–Уилка, для всех дисперсий статистическая значимость по обоим критериям была р > 0.05, что свидетельствует о нормальности всех распределений. Критерий Диксона использовался для выявления и исключения крайних отклонений из анализа, для относительных значений, крайние параметры убирались из дисперсий обоих сопоставляемых абсолютных величин.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Однофакторный дисперсионный анализ выявил эффект генотипа между 1473GG-76C и 1473GG-76B на уровень экспрессии гена Htr1a, кодирующего ключевой рецептор серотонина 5-HT1A. Мы нашли его достоверное повышение (рис. 1) у 1473GG-76C в среднем мозге (F1,18 = 8.35, p < 0.001), префронтальной коре (F1,17 = 12.54, p < 0.01) и гиппокампе (F1,19 = 5.55, p < 0.05). В гипоталамусе достоверных различий обнаружено не было (F1,19 < < 1). Для транскрипционных факторов гена Htr1a были получены следующие различия (рис. 2): достоверное повышение уровня экспрессии мРНК гена Cc2d1a в гиппокампе (F1,19 = 7.83, p < 0.05) и мРНК гена Cc2d1b в среднем мозге (F1,19 = 5.75, p < 0.05) у мышей линии 1473GG-76C по сравнению с мышами линии 1473GG-76B.

Рис. 1.

Уровень мРНК гена Htr1a в структурах мозга мышей 1473GG-76C и 1473GG-76B. Экспрессия гена представлена как число копий кДНК соответствующего гена на 100 копий кДНК rPol2. * p < 0.05, ** p < < 0.01 по сравнению с 1473GG-76B. В каждой группе число образцов n ≥ 10.

Рис. 2.

Уровни мРНК генов аCc2d1a и бCc2d1b в структурах мозга мышей 1473GG-76C и 1473GG-76B. Экспрессия гена представлена как число копий кДНК соответствующего гена на 100 копий кДНК rPol2. * p < 0.05 по сравнению с 1473GG-76B. В каждой группе число образцов n ≥ 10.

Для уровня мРНК гена Htr2a, кодирующего рецептор 5-HT2A был обнаружен эффект генотипа (рис. 3). Экспрессия этого гена была повышена у мышей 1473GG-76C в среднем мозге (F1,18 = 4.81, p < 0.05) и гиппокампе (F1,18 = 4.81, p < 0.05), но не для префронтальной коры (F1,18 < 1) и гипоталамусе (F1,15 < 1).

Рис. 3.

Уровень мРНК гена Htr2a в структурах мозга мышей 1473GG-76C и 1473GG-76B. Экспрессия гена представлена как число копий кДНК соответствующего гена на 100 копий кДНК rPol2. * p < 0.05, *** p < < 0.001 по сравнению с 1473GG-76B. В каждой группе число образцов n ≥ 10.

Не было обнаружено эффекта генотипа между 1473GG-76C и 1473GG-76B на уровень мРНК гена Htr7, кодирующего рецептор серотонина 7 типа во всех исследованных структурах (рис. 4): средний мозг (F1,17 = 1.60, p > 0.05), префронтальная кора (F1,19 = 3.55, p > 0.05), гиппокамп (F1,17 < 1) и гипоталамус (F1,17 < 1).

Рис. 4.

Уровень мРНК гена Htr7 в структурах мозга мышей 1473GG-76C и 1473GG-76B. Экспрессия гена представлена как число копий кДНК соответствующего гена на 100 копий кДНК rPol2. В каждой группе число образцов n ≥ 10.

Для ключевых элементов серотониновой системы (рис. 5) в среднем мозге был найден эффект генотипа только на экспрессию гена Maoa, кодирующего фермент деградации серотонина МАО А (F1,18 = 6.96, p < 0.05), которая оказалась выше у линии 1473GG-76C, в то время как уровни экспрессии генов Slc6a4 и Tph2, кодирующих серотониновый транспортер и ключевой фермент синтеза серотонина, соответственно, не изменились (F1,19 < 1).

Рис. 5.

Уровни мРНК генов Slc6a4, Tph2 и Maoa в среднем мозге мышей 1473GG-76C и 1473GG-76B. Экспрессия гена представлена как число копий кДНК соответствующего гена на 100 копий кДНК rPol2. * p < 0.05 по сравнению с 1473GG-76B. В каждой группе число образцов n ≥ 10.

Хроматографический анализ (рис. 6) (ВЭЖХ) выявил достоверное повышение уровня серотонина в среднем мозге (F1,19 = 5.21, p < 0.05), гиппокампе (F1,20 = 6.08, p < 0.05) и гипоталамусе (F1,20 = 16.60, p < 0.001), но не в префронтальной коре (F1,15 < 1) у мышей линии 1473GG-76C. Уровень основного метаболита серотонина 5-ГИУК (5-гидроксииндолуксусной кислоты) в среднем мозге и префронтальной коре был достоверно снижен (F1,19 = 6.51, p < 0.05 и F1,15 = 7.48, p < 0.05 соответственно) у мышей линии 1473GG-76C. В гиппокампе и гипоталамусе уровень 5-ГИУК у этих мышей не изменился (F1,20 = 3.34, p > 0.05 и F1,20 = 2.42, p > 0.05 соответственно). Кроме того, у мышей линии 1473GG-76C было найдено достоверное снижение коэффициента метаболизма серотонина в среднем мозге (F1,19 = 22.26, p < 0.001), префронтальной коре (F1,15 = 8.67, p < 0.05), гиппокампе (F1,20 = 15.07, p < 0.001) и гипоталамусе (F1,20 = = 6.37, p < 0.05).

Рис. 6.

Уровни а – 5-HT, б – 5-ГИУК и в – соотношение 5-ГИУК/5-HT в структурах мозга мышей 1473GG-76C и 1473GG-76B. Уровень 5-HT и 5-ГИУК представлен в нг/мг. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001 по сравнению с 1473GG-76B. В каждой группе число образцов n ≥ 10.

ОБСУЖДЕНИЕ

Использование рекомбинантных линий, различающихся только небольшим фрагментом генома, является эффективным подходом изучения пластичности и функции нейротрансмитерных систем, регулирующих множество физиологических функций, включая поведение [29]. В данной работе исследования проводились на рекомбинантных мышах линий B6-1473GG.CBA-D13Mit76С и B6-1473GG.CBA-D13Mit76В, отличающихся от мышей реципиентной линии С57BL/6-G/G генотипом полиморфизма C1473G гена Tph2 и дистальным фрагментом (103,9-112,4 м.п.н.) хромосомы 13, содержащим ген Htr1a каталептической линии СВА (B6-1473GG.CBA-D13Mit76С) и линии C57BL/6 (B6-1473GG.CBA-D13Mit76В) соответственно. В результате исследования у линии 1473GG-76C по сравнению с линией 1473GG-76В было обнаружено повышение экспрессии гена 5-НТ рецептора ключевого регулятора функциональной активности 5-НТ системы мозга [11], в коре и среднем мозге, где расположены тела серотониновых нейронов, а также гиппокампе, структуре, где наблюдается наивысший уровень мРНК и наибольшая плотность 5-НТ рецепторов [13]. Известно, что изменения в экспрессии гена Htr1a могут дифференциально влиять на пре- и постсинаптические 5-HT рецепторы и, следовательно, на функциональную активность 5-HT системы мозга [11]. Принимая во внимание данные о роли 5-НТ рецептора в контроле функции 5-НТ системы мозга [11], транскрипционные факторы гена Htr1a можно рассматривать в качестве потенциальных регуляторов функциональной активности 5-HT системы мозга. Интересно отметить, что наличие дистального фрагмента (103.9–112.4 м.п.н.) хромосомы 13, содержащего ген Htr1a каталептической линии на фоне 1473G-аллеля гена Tph2, привело к повышению уровня мРНК транскрипционных регуляторов экспрессии 5-НТ рецептора – гена Cc2d1a в гиппокампе и гена Cc2d1b в среднем мозге по сравнению с мышами линии 1473GG-76B. Возможно, повышение экспрессии сайленсеров 5-НТ рецептора является компенсаторным ответом на повышение экспрессии самого гена Htr1a в новом генетическом окружении. Изменения экспрессии регуляторов гена Htr1a может приводить к развитию различных психических заболеваний [20], поскольку это вовлекает множество изменений не только на уровне транскрипции самого гена Htr1a, но и на уровне обмена серотонина в мозге.

При исследовании экспрессии Htr7 гена, не было обнаружено разницы между линиями мышей, хотя данный тип рецепторов играет важную роль не только в функционировании самой серотониновой системы, но и в регуляции 5-НТ1A рецептора [10]. Полученные данные указывают на то, что на уровне экспрессии рецепторы регулируются независимо друг от друга.

5-HT2A рецепторы привлекают особое внимание из-за их тесной связи с 5-HT1A рецепторами в механизме наследственности каталепсии. Так известно, что введение агонистов 5-HT2A и 5-НТ рецепторов уменьшает у мышей и крыс выраженность каталептического замирания, вызванного введением нейролептиков [3032]. Хроническая и острая активация 5-HT2A рецепторов вызывает у крыс и мышей значительное падение функциональной активности 5-HT1A рецепторов [3337]. Кроме того, было показано функциональное взаимодействие между 5-HT2A и 5-HT1A рецепторами в механизме подавления каталепсии у мышей. Активация 5-HT2A рецептора вызывает активацию пресинаптических и ингибирование постсинаптических 5-HT1A рецепторов [38]. Также показано непосредственное белок-белковое взаимодействие 5-НТ и 5-НТ рецепторов [39]. Наличие дистального фрагмента (103.9–112.4 м.п.н.) хромосомы 13, содержащего ген Htr1a каталептической линии на фоне генотипа G/G гена Tph2 приводит к повышению мРНК гена Htr2а, кодирующего 5-НТ рецептор в среднем мозге и гиппокампе у мышей линии 1473GG-76C по сравнению с линией 1473GG-76В также несущих генотип G/G гена Tph2, но ген Htr1a от линии С57BL/6. Известно, что дистальный фрагмент (103.9–112.4 м.п.н.) хромосомы 13 определяет около 20% проявления каталепсии у мышей [4042] и каталептические линии характеризуются, с одной стороны, повышенной функциональной активностью 5-НТ рецептора и отсутствием изменений экспрессии гена Htr1a в мозге, и, с другой стороны, сниженной функциональной активность 5-НТ рецептора, которая сопровождается снижением экспрессии гена Htr2a в коре [38, 43]. В нашем случае, возможно, повышение экспрессии мРНК гена Htr2а у линии 1473GG-76C связано с повышением экспрессии в этих же структурах мозга гена Htr1a, полученного от каталептической линии СВА, и наличием одновременно G-аллеля гена Tph2. У рекомбинантной линии B6-1473G с участком хромосомы 13 от C57BL/6, показано снижение экспрессии гена Htr2a в гиппокампе по сравнению с линией B6-1473C имеющей нормальный аллель гена триптофангидроксилазы и участок хромосомы 13 от линии C57BL/6 [8].

Метаболизм серотонина в мозге у линии 1473GG-76C снижается и это вызывается именно содержанием СВА-аллеля гена Htr1a на фоне гомозиготности по 1473G-аллелю гена Tph2, так как у линии 1473GG-76В также снижена активность ТПГ-2. У контрольных мышей линий гомозиготных по 1473С- и 1473G-аллелям гена Tph2 не было найдено отличий по уровню серотонина, его основного метаболита и индекса метаболизма (отношение 5-ГИУК/5-НТ) в работе с хроническим потреблением флуоксетина [6]. В другой работе при воздействии острого стресса было обнаружено снижение уровня серотонина в коре и гиппокампе, что, однако, не привело к изменению индекса обмена серотонина в этих структурах у B6-1473G мышей контрольной группы [7]. Кроме того, исследование влияния укороченного дня на моноамины мозга этих мышей показало, что контрольные мыши, содержащиеся при нормальном световом периоде, но тестированные в течение 2 дней в поведенческих тестах, характеризуются сниженным уровнем 5-ГИУК и обменом серотонина в гиппокампе [8]. Все выше перечисленное позволяет предположить, что уровни моноаминов и их метаболитов в коре и гиппокампе у данных мышей очень чувствительны к различным воздействиям. В нашем случае уменьшение метаболизма серотонина во всех исследованных структурах мозга может являться либо компенсаторной реакцией, либо нейрохимическим дисбалансом вызванным сочетанием мутаций из разных геномов на геноме линии C56BL/6. Это хорошо согласуется с имеющимися данными, полученными при исследовании 5-НТ системы мозга у мышей линии B6-M76C, у которой перенос фрагмента хромосомы 13 привел к снижению 5-HT метаболизма в гиппокампе и повышению экспрессии гена Htr1a по сравнению с мышами B6-M76B. Однако у B6-M76C не было обнаружено изменений в экспрессии гена Htr1a в других структурах мозга. Также не было найдено отличий в уровне мРНК гена Htr2a [21, 22]. В связи с вышесказанным, обнаруженные нами в данной работе изменения в экспрессии генов рецепторов связаны именно c наличием дистального фрагмента (103.9–112.4 м.п.н.) хромосомы 13, содержащего ген 5-HT1A рецептора каталептической линии СВА, на фоне 1473G-аллеля гена Tph2.

При исследовании уровней мРНК ключевых генов серотониновой системы – Tph2, Maoa и Slc6а4, в среднем мозге было обнаружено повышение экспрессии только гена Maoa у мышей линии 1473GG-76C по сравнению с мышами линии 1473GG-76B. Это может являться ответом на повышенный уровень серотонина у этих мышей в среднем мозге и других структурах. С другой стороны, поскольку уровень 5-ГИУК во всех структурах снижен, повышение экспрессии Маоа может являться механизмом положительной обратной связи в ответ на снижение метаболита.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, присутствие дистального фрагмента (103.9–112.4 м.п.н.) хромосомы 13, содержащего ген Htr1a каталептической линии СВА на фоне G/G генотипа С1473G-полиморфизма гена Tph2 с приводит к повышению экспрессии генов Htr1a и Htr2a рецепторов в среднем мозге и гиппокампе, не оказывая существенного влияния на экспрессию гена Htr7. Также мыши линии 1473GG-76C характеризуются повышенным уровнем мРНК транскрипционных регуляторов экспрессии гена 5-НТ рецептора – гена Cc2d1a в гиппокампе и гена Cc2d1b в среднем мозге. Данные изменения экспрессии сопровождаются уменьшением обмена серотонина в мозге у мышей линии 1473GG-76C по сравнению с мышами 1473GG-76В.

Список литературы

  1. Murphy D.L., Andrews A.M., Wichems C.H., Li Q., Tohda M., Greenberg B. // The Journal of Clinical Psychiatry. 1998. V. 59 Suppl 15. P. 4–12.

  2. Fitzpatrick P.F. // Annual Review of Biochemistry. 1999. V. 68. P. 355–381.

  3. Osipova D.V., Kulikov A.V., Mekada K., Yoshiki A., Moshkin M.P., Kotenkova E.V., Popova N.K. // Genes, Brain, and Behavior. 2010. V. 9. № 5. P. 537–543.

  4. Kulikov A.V., Osipova D.V., Naumenko V.S., Popova N.K. // Genes, Brain, and Behavior. 2005. V. 4. № 8. P. 482–485.

  5. Куликов А.В., Осипова Д.В., Науменко В.С., Попова Н.К. // Доклады Академии наук. 2005. V. 402. № 4. P. 571–573.

  6. Bazhenova E.Y., Sinyakova N.A., Kulikova E.A., Kazarinova I.A., Bazovkina D.V., Gainetdinov R.R., Kulikov A.V. // Neurosci. Lett. 2017. V. 653. P. 264–268.

  7. Bazhenova E.Y., Bazovkina D.V., Kulikova E.A., Fursenko D.V., Khotskin N.V., Lichman D.V., Kulikov A.V. // Neurosci. Lett. 2017. V. 640. P. 105–110.

  8. Bazhenova E.Y., Fursenko D.V., Kulikova E.A., Khotskin N.V., Sinyakova N.A., Kulikov A.A. // Neurosci. Lett. 2019. V.699. P. 91–96.

  9. Pytliak M., Vargova V., Mechirova V., Felsoci M. // Physiological Research. 2011. V. 60. № 1. P. 15–25.

  10. Naumenko V.S., Popova N.K., Lacivita E., Leopoldo M., Ponimaskin E.G. // CNS Neurosci. Ther. 2014. V. 20. № 7. P. 582–590.

  11. Popova N.K., Naumenko V.S. // Reviews in the Neurosciences. 2013. V. 24. № 2. P. 191–204.

  12. Barnes N.M., Sharp T. // Neuropharmacology. 1999. V. 38. № 8. P. 1083–1152.

  13. Zifa E., Fillion G. // Pharmacological Reviews. 1992. V. 44. № 3. P. 401–458.

  14. Ou X.M., Jafar-Nejad H., Storring J.M., Meng J.H., Lemonde S., Albert P.R. // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. № 11. P. 8161–8168.

  15. Ou X.M., Lemonde S., Jafar-Nejad H., Bown C.D., Goto A., Rogaeva A., Albert P.R. // The J. Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 2003. V. 23. № 19. P. 7415–7425.

  16. Hadjighassem M.R., Austin M.C., Szewczyk B., Daigle M., Stockmeier C.A., Albert P.R. // Biol Psychiatry. 2009. V. 66. № 3. P. 214–222.

  17. Hadjighassem M.R., Galaraga K., Albert P.R. // Eur. J. Neurosci. 2011. V. 33. № 2. P. 214–223.

  18. Rogaeva A., Albert P.R. // Eur. J. Neurosci. 2007. V. 26. № 4. P. 965–974.

  19. Rogaeva A., Galaraga K., Albert P.R. // J. Neurosci. Res. 2007. V. 85. № 13. P. 2833–2838.

  20. Albert P.R., Le Francois B., Millar A.M. // Molecular Brain. 2011. V. 4. P. 21.

  21. Kulikova E.A., Bazovkina D.V., Akulov A.E., Tsybko A.S., Fursenko D.V., Kulikov A.V., Naumenko V.S., Ponimaskin E., Kondaurova E.M. // British J. Pharmacology. 2016. V. 173. № 13. P. 2147–2161.

  22. Kulikova E.A., Bazovkina D.V., Antonov Y.V., Akulov A.E., Kulikov A.V., Kondaurova E.M. // Neurosci. Res. 2017. V. 117. P. 14–21.

  23. Osipova D.V., Kulikov A.V., Popova N.K. // J. Neurosci. Res. 2009. V. 87. № 5. P. 1168–1174.

  24. Zhang X., Beaulieu J.M., Sotnikova T.D., Gainetdi-nov R.R., Caron M.G. // Science 2004. V. 305. № 5681. P. 217.

  25. Куликов А.В., Базовкина Д.В., Маузан М.П., Мормед П. // Доклады Академии наук. 2003. V. 393. № 1. P. 134–137.

  26. Kulikov A.V., Naumenko V.S., Voronova I.P., Tikho-nova M.A., Popova N.K. // J. Neurosci. Methods. 2005. V. 141. № 1. P. 97–101.

  27. Naumenko V.S., Kulikov A.V. // Molekuliarnaia Biologiia. 2006. V. 40. № 1. P. 37–44.

  28. Naumenko V.S., Osipova D.V., Kostina E.V., Kulikov A.V. // J. Neurosci. Methods. 2008. V. 170. № 2. P. 197–203.

  29. Moisan M.-P. // Neurobehavioral Genetics. Methods and Applications / Eds. Jones B.C., Mormede P. Boca Raton: CRC Press, 1999. P. 71–91.

  30. Hicks P.B. // Life Sci. 1990. V. 47. № 18. P. 1609–1615.

  31. Wadenberg M.L. // Neurosci. Biobehav. Rev. 1996. V. 20. № 2. P. 325–339.

  32. Egashira N., Koushi E., Mishima K., Iwasaki K., Oishi R., Fujiwara M. // J. Pharmacological Sciences. 2007. V. 105. № 4. P. 361–366.

  33. Hensler J.G., Truett K.A. // Neuropsychopharmacology. 1998. V. 19. № 5. P. 354–364.

  34. Valdez M., Burke T.F., Hensler J.G. // Brain Res. 2002. V. 957. № 1. P. 174–182.

  35. Zhang Y., D’Souza D., Raap D.K., Garcia F., Battaglia G., Muma N.A., Van de Kar L.D. // The J. Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 2001. V. 21. № 20. P. 7919–7927.

  36. Zhang Y., Gray T.S., D’Souza D.N., Carrasco G.A., Damjanoska K.J., Dudas B., Garcia F., Zainelli G.M., Sullivan Hanley N.R., Battaglia G., Muma N.A., Van de Kar L.D. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 2004. V. 310. № 1. P. 59–66.

  37. Попова Н.К., Понимаскин Е.Г., Науменко В.С. // Российский физиологический журн. им. И.М. Сеченова. 2015. Т. 101. № 11. С. 1270–1278.

  38. Naumenko V.S., Bazovkina D.V., Kondaurova E.M., Zubkov E.A., Kulikov A.V. // Genes, Brain, and Behavior. 2010. V. 9. № 5. P. 519–524.

  39. Borroto-Escuela D.O., Narvaez M., Ambrogini P., Ferraro L., Brito I., Romero-Fernandez W., Andrade-Talavera Y., Flores-Burgess A., Millon C., Gago B., Narvaez J.A., Odagaki Y., Palkovits M., Diaz-Cabiale Z., Fuxe K. // Molecules. 2018. V. 23. № 6. P. 1341.

  40. Kulikov A.V., Bazovkina D.V., Kondaurova E.M., Popova N.K. // Genes, Brain, and Behavior. 2008. V. 7. № 4. P. 506–512.

  41. Kulikov A.V., Bazovkina D.V., Moisan M.P., Mormede P. // Dokl. Biol. Sci. 2003. V. 393. P. 531–534.

  42. Kondaurova E.M., Bazovkina D.V., Kulikov A.V., Popova N.K. // Genes, Brain, and Behavior. 2006. V. 5. № 8. P. 596–601.

  43. Науменко В.С., Кондаурова Е.М., Куликов А.В., Попова Н.К. // Докл. Акад. наук. 2006. Т. 409. № 1. С. 133–135.

Дополнительные материалы отсутствуют.