Нейрохимия, 2021, T. 38, № 1, стр. 52-58

ВВЕДЕНИЕ

Расстройства аутистического спектра (РАС) представляют собой группу комплексных дезинтегративных нарушений психического развития, характеризующихся отсутствием способности к социальному взаимодействию, коммуникации, стереотипностью поведения, приводящим к социальной дезадаптации. На сегодняшний день среди различных гипотез патогенеза заболевания одними из основных являются нейрохимические гипотезы, которые рассматривают генез РАС как следствие нарушения формирования нейротрансмиттерных систем мозга в онтогенезе. В частности, выдвинута гипотеза о повреждающем действии дисбаланса возбуждающих (глутамат, аспартат) и тормозных (глицин) аминокислот на головной мозг в пренатальном развитии [1, 2]. Другая группа теорий рассматривает в качестве ключевого фактора формирования РАС нарушение онтогенетического развития моноаминергических систем мозга, в первую очередь серотонинергической [3]. По данным клинических исследований, у 30% (по некоторым данным, до 66%) от числа детей с диагностированным синдромом аутизма наблюдается существенное увеличение концентрации серотонина в плазме крови (гиперсеротонинемия). Функциональное состояние серотонинергической системы мозга зависит от скорости обратного захвата серотонина пресинаптическими нейронами, осуществляемого транспортером обратного захвата серотонина (СЕРТ) [4]. Генетически обусловленная высокая активность СЕРТ приводит к подавлению активности серотонинергической нейропередачи, проявляется повышенной агрессией и гиперактивностью [5, 6].

Данная информация послужила основанием для использования лекарственных средств, воздействующих на серотонинергическую систему, для лечения РАС [7]. Так, использование фенфлурамина, антидепрессанта, увеличивающего высвобождение серотонина и одновременно препятствующего обратному захвату, вызывало улучшение клинической картины у 30% пациентов с аутистическими расстройствами [8]. Рисперидон, антагонист серотониновых и дофаминовых рецепторов, также оказался эффективен в облегчении поведенческих симптомов аутизма, в том числе для снижения самоповреждений [9]. По данным Гориной и соавторов, у больных РАС в онтогенезе нарушается баланс моноаминергических нейромедиаторов серотонина, дофамина и норадреналина, особенно отчетливо это проявляется в возрасте 1 г. и 5 лет: в плазме крови наблюдается снижение содержания серотонина (в 4.9 раза), дофамина (в 2.8 раза) и норадреналина (в 1.2–1.4 раза). Развитие этих нарушений соответствует критическим периодам формирования различных структур головного мозга, что может приводить к проявлению симптомов аутизма [10, 11].

Целью данной работы являлось изучение изменений нейрохимических параметров мозга в онтогенезе мышей линии BALB/с в условиях введения вальпроата натрия (ВН) беременным самкам. Данная экспериментальная модель наиболее часто используется для моделирования РАС [12, 13]. Проводилось изучение состояния дофамин-, серотонин- и норадренергических систем в различных структурах мозга мышей-самцов линии BALB/с на 15, 42 и 64 день (соответственно Р15, Р42 и Р64) постнатального развития (ПНР) (т.е. вплоть до половозрелого состояния) контрольной группы (0.9% NaCl) и группы потомства самок, получавших ВН.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Животные. Опыты проведены на 31 самце мыши линии BALB/c массой тела 10–22 г, родительское поколение которых получено из питомника филиала “Столбовая” ФГБУН “Научный центр биомедицинских технологий ФМБА” (Россия), содержавшихся в условиях лабораторного вивария при 12-часовом световом режиме со свободным доступом к воде и стандартному корму. Для исключения влияния суточных биоритмов на скорость биосинтеза и метаболизма нейромедиаторов эксперименты проводили между 10 и 12 ч дня.

Препараты. Вальпроат натрия (ВН) вводили однократно, подкожно, в дозе 400 мг/кг самкам мышей на 12.5-й день беременности. Самки мышей, потомство которых составило контрольную группу, в эти же сроки получали физиологический раствор в эквивалентном объеме (0.1 мл на 10 г веса). Новорожденных мышат-самцов (31 особь: 14 контрольных и 17 пренатально получавших ВН) отлучали от самок на 21-е сутки жизни, рассаживая по 4–5 животных в клетку (43.5 × 27.5 × × 15.5 см).

Схема эксперимента. Животные были разделены на следующие экспериментальные группы (в скобках указано количество животных):

1. Контроль (потомство интактных самок, получавших физиологический раствор):

1а. Группа “Р15” (n = 4);

1б. Группа “Р42” (n = 6);

1в. Группа “Р64” (n = 4).

2. Опыт (потомство самок, получавших ВН):

2а. Группа “Р15” (n = 8);

2б. Группа “Р42” (n = 3);

2в. Группа “Р64” (n = 6).

Нейрохимические исследования. На 15, 42 или 64 день ПНР животных декапитировали, после чего структуры мозга (гипоталамус, стриатум и гиппокамп) извлекали на льду, замораживали в жидком азоте и взвешивали. Пробы хранили в жидком азоте. Перед экспериментами по определению содержания нейротрансмиттеров пробы размельчали в гомогенизаторе Поттера (тефлон–стекло) в 1 мл 0.1 N HСlO₄ с добавлением 3,4-диоксибензиламина (0.5 нмоль/мл) в качестве внутреннего стандарта. Пробы центрифугировали при 10 000 g в течение 10 мин. Содержание моноаминов и их метаболитов (норадреналина (НА), дофамина (ДА), 3,4-диоксифенилуксусной кислоты (ДОФУК), гомованилиновой кислоты (ГВК), серотонина (5-окситриптамина, 5-ОТ) и 5-оксииндолуксусной кислоты (5-ОИУК)) определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией (ВЭЖХ/ЭД) на хроматографе LC-304T (ВАS, США) с аналитической колонкой ReproSil-Pur ODS (C18, 100 × 4 мм, 3 мкм) (Dr.Maisch, Германия) при скорости элюции подвижной фазы 1.0 мл/мин и давлении до 200 атм. Мобильная фаза состояла из: 0.1 M цитратно-фосфатного буфера, содержащего 1.1 mM октансульфоновой кислоты, 0.1 mM ЭДТА и 9%-го ацетонитрила (pH 3.0). Измерение проводили с помощью электрохимического детектора LC-4B (BAS, США) на двойном стеклоугольном электроде (+0.85 V) против электрода сравнения Ag/AgCl. Регистрация образцов проводилась с применением аппаратно-программного комплекса “Мультихром” 1.5 (“Амперсенд”) [14]. Все использовавшиеся для анализа реактивы были высокой степени чистоты: о. с. ч. или analytical grade.

После проверки на нормальность распределения по критерию Шапиро–Уилка достоверность отличий между группами определяли методом двухфакторного дисперсионного анализа (АNOVA) с последующим post-hoc тестом Ньюмана–Кейлса, используя в качестве анализируемых факторов возраст животных и используемые вещества (GraphPad Prizm 8.0, GraphPad Software, Inc. США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Было показано, что на 15 и 42 сут ПНР нейрохимический профиль структур мозга существенно отличается от показателей зрелых животных возрастом 64 дня, при этом отличия носили разнонаправленный характер. Так, показатели метаболизма ДА-ДОФУК/ДА, ГВК + 3-МТ/ДА и ДОФУК + ГВК + 3-МТ/ДА в гипоталамусе были существенно выше, чем у взрослых (64 дней) животных (на 100–150%), и снижались с увеличением возраста животных, что говорит об активации скорости метаболизма и сдвиге баланса в сторону накопления нейротрансмиттера по мере созревания мозга (рис. 1). Показатель скорости утилизации серотонина – 5-ОИУК/5-ОТ – в той же структуре был ниже в группах “Р42” и “Р64” по сравнению с тем же параметром 15-дневных животных. Интересно отметить, что показатели указанных групп практически не отличались друг от друга, что может свидетельствовать о созревании серотонинергической системы гипоталамуса к 42-му дню. Сходный паттерн развития последней отмечался и в гиппокампе (рис. 1).

Рис. 1.

Динамика изменения метаболизма моноаминов в гиппокампе и гипоталамусе мышей линии BALB/C, матерям которых вводили вальпроат натрия (400 мг/кг, п/к). Черный цвет – контроль. Серый цвет – вальпроат натрия. Цифрами обозначен возраст животных: 1 – 15 дней; 2 – 42 дня; 3 – 64 дня. *; **; *** р < 0.05; <0.01; <0.001 по сравнению с контролем (15 дней). #; ##; ### р < 0.05; <0.01; <0.001 по сравнению с вальпроатом натрия (15 дней). ^; ^^; ^^^ р < 0.05; <0.01; <0.001 по сравнению с вальпроатом натрия (42 дней). $; $$; $$$ р < 0.05; <0.01; <0.001 по сравнению с контролем той же возрастной группы.

Наиболее динамичное онтогенетическое развитие нейротрансмиттерных систем наблюдалось в стриатуме. Так, содержание ДА в этой структуре выросло почти в 2 раза в период с 15 по 42 сут ПНР, после чего уже к 64 дню развитие практически не изменялось (рис. 2). При этом содержание ДОФУК с 15 по 64 день плавно снижалось. Уровень ГВК сокращался похожим образом, но после 42 дня изменений уже не наблюдалось. Напротив, концентрация 3-МТ к 42 дню ПНР резко возросла (с 3.75 до 11.5 нмоль/г), а к 64 дню она незначительно снизилась. Динамика изменений всех показателей метаболизма ДА (ДОФУК/ДА, ГВК/ДА, ГВК + 3-МТ/ДА и ДОФУК + ГВК + 3-МТ/ДА) имела сходный паттерн – максимальное снижение в период с 15 по 42 сут онтогенеза, затем более плавное уменьшение к 64 дню. Показатель скорости утилизации серотонина изменялся по той же схеме.

Рис. 2.

Динамика изменения содержания моноаминов и их метаболитов (нмоль/г ткани) в стриатуме мышей линии BALB/C, матерям которых вводили вальпроат натрия (400 мг/кг, п/к). Черный цвет – контроль. Серый цвет – вальпроат натрия. Цифрами обозначен возраст животных: 1 – 15 дней; 2 – 42 дня; 3 – 64 дня. *; **; *** р < 0.05; <0.01; <0.001 по сравнению с контролем (15 дней). #; ##; ### р < 0.05; <0.01; <0.001 по сравнению с вальпроатом натрия (15 дней). ^; ^^; ^^^ р < 0.05; <0.01; <0.001 по сравнению с вальпроатом натрия (42 дней). $; $$; $$$ р < 0.05; <0.01; <0.001 по сравнению с контролем той же возрастной группы.

Иная картина онтогенетических изменений нейрохимических параметров структур мозга наблюдалась в группе мышей, матерям которых на 12.5 сут беременности вводили ВН. В гипоталамусе ВН практически не влиял на показатели ДА-ергической системы, за исключением параметра ДОФУК/ДА группы “Р15”, который был более низким по сравнению с контролем. Показатель метаболизма серотонина 5-ОИУК/5-ОТ постепенно снижался с 15 по 42 сут ПНР. Подобное снижение этого параметра наблюдалось и в другой структуре – гиппокампе (рис. 1).

ВН в стриатуме вызывал достоверное снижение уровня ДА у мышат на 15 день ПНР по сравнению с контролем, при этом паттерн увеличения содержания этого нейротрансмиттера в этот период был более плавным, чем на 42 и 64 сут ПНР (рис. 2). Интересно отметить, что уровни ДОФУК и ГВК в той же структуре были также ниже соответствующих значений контрольной группы, при этом достоверно различались лишь показатели на 15 сут ПНР. Профиль изменения прочих показателей ДА-ергической передачи (ДОФУК/ДА, ГВК/ДА, ГВК + 3-МТ/ДА и ДОФУК + ГВК + 3‑МТ/ДА) не отличался от динамики изменений в группах контрольных мышей, при этом четко прослеживаются отличия на уровне 15 сут ПНР. Паттерн онтогенетических изменений концентраций 5-ОТ, 5-ОИУК и показателя 5-ОИУК/5-ОТ не отличался от динамики развития контрольной группы значений, при этом максимальные различия по всем указанным параметрам отмечались на 64 ПНР, когда содержание 5-ОТ и 5-ОИУК возрастало на 20–30% (рис. 2).

Полученные результаты свидетельствуют о том, что уровень как катехоламинов, так и серотонина в структурах мозга мышат в возрасте 15 сут существенно ниже, чем у взрослых животных (64 дня ПНР). Как известно, созревание моноаминергических систем мозга крысиного плода происходит начиная с третьего триместра беременности и охватывает первые три недели постнатального периода [15]. У крыс содержание моноаминов в центральной нервной системе при рождении составляет 8–12% от концентрации у взрослых особей [16–18]. Уровень ДА в мозге к 2-недельному возрасту соответствует примерно 50% от содержания у взрослых. К 4-недельному возрасту содержание ДА находится в пределах от 80 до 100% от значений этого параметра у взрослых крыс. Наблюдавшееся нами увеличение показателей метаболических характеристик ДА-ергической системы на 15 день ПНР можно объяснить недостаточной регуляторной активностью Д2 ауторецепторов в этом возрасте. То же самое можно отнести и к серотониновой системе. Показано, что плотность Д2-рецепторов при рождении колеблется в диапазоне 5–18% от плотности у взрослых [19], к концу первой недели жизни возрастает до 25–45% и к концу 2 нед. жизни достигает значений концентрации у взрослых особей [20, 21].

Введение ВН (400 мг/кг, п/к) на 12.5 день гестации самкам мышей не вызывало значительных изменений в структурах мозга потомства на 15 сут ПНР, за исключением стриатума, в котором отмечалось снижение величины всех параметров моноаминергической нейропередачи. Отличие в метаболитической активности от соответствующей контрольной группы, возможно, связано со снижением активности тирозингидроксилазы – фермента, лимитирующего скорость синтеза ДА под влиянием ВН. В дальнейшем, к 42 сут ПНР, общий паттерн изменения концентраций нейротрансмиттеров не отличался от динамики созревания нейротрансмиттерных систем контрольной группы соответствующей стадии ПНР. Исключение составляла только концентрация серотонина и его метаболита в стриатуме, которая превышала аналогичный показатель группы “Р42” контроля. К 64 дню уровни 5-ОТ и 5-ОИУК в группе мышей, получавших ВН, также были выше величин этих параметров в стриатуме мышей контрольной группы. Уровень катехоламиновых нейротрансмиттеров изменялся в онтогенетическом развитии значительно медленнее, при этом существенных отличий параметров мышей групп, пренатально получавших ВН, от показателей контроля не наблюдалось, за исключением содержания ДА, значительно возросшего в стриатуме в период с 42 по 64 день, тогда как в группе контроля уровень ДА в этот промежуток времени увеличивался более плавно.

Таким образом, полученные нами данные позволяют предполагать, что введение ВН беременным самкам отражается, в первую очередь, на функциональном состоянии дофаминергической системы мозга потомства, вызывая снижение ее активности в стриатуме к 15 сут ПНР. В дальнейшем уровень ДА компенсируется и к 64 сут не отличается от показателей контрольной группы. Параметры серотонинергической системы изменяются по сходной схеме, однако содержание 5-ОТ достигало максимума к 42 дню с последующим небольшим снижением к 64 дню, тогда как уровень 5-ОИУК в стриатуме увеличивался постепенно, и максимальные отличия наблюдались к 64 дню ПНР, т.е. к возрасту половой зрелости.

Следует отметить, что бóльшая часть существующих публикаций, посвященных исследованию вальпроатной модели аутизма, касается либо изучения электрофизиологических параметров нейронов [22], либо определения содержания нейротрансмиттеров в микродиализных образцах [23]. Комплексное изучение влияния ВН на содержание моноаминов и их метаболитов в различных структурах мозга до настоящего времени практически не проводилось. Однако сравнительно недавно появился ряд работ, выполненных коллективом Hara и соавторов, посвященных изучению влияния ВН на параметры ДА-ергической нейропередачи [24]. Если на первых этапах исследования эффекты ВН на содержание ДА, НА и 5-ОТ в ПФК и стриатуме не наблюдались [25], то в дальнейшем ими было продемонстрировано снижение активности ДА-ергической системы префронтальной коры в условиях данной модели [26]. При этом было обнаружено, что как острое, так и хроническое введение атипичных нейролептиков рисперидона и арипразола потомству самок, которым вводили ВН, вызывает ослабление социальной изоляции на поведенческом уровне, а также увеличение внеклеточного содержания ДА и возрастание экспрессии гена C-fos в префронтальной коре [27]. В то же время влияние ВН на динамику изменений активности нейротрансмиттерных систем мозга в онтогенезе практически до настоящего времени не изучалось. Только недавно (6.2020) появилась работа Adam et al., посвященная иммуноцитохимическому и морфологическому гистохимическому изучению состояния дофаминергической системы мозга потомства самок мышей возрастом 7 дней, получавших ВН [28]. При этом было показано отсутствие каких-либо изменений содержания ДА в структурах нигростриарной системы (вентральная область покрышки, дорсолатеральный стриатум) при существенном уменьшении количества дофаминсодержащих нейронов в образованиях, относящихся к мезолимбической системе (прилежащее ядро). По всей видимости, срок между 7 и 15 днями ПНР является ключевым для проявления изменений активности стриатной дофаминергической системы, вызванной ВН.

Таким образом, результаты наших экспериментов представляют определенный интерес и могут использоваться для разработки стратегии фармакотерапии аутистических расстройств.