Нейрохимия, 2021, T. 38, № 1, стр. 37-42

ВВЕДЕНИЕ

Боковой амиотрофический склероз (БАС) это одно из самых часто встречаемых возрастных заболеваний моторного нейрона, которое затрагивает спинной и головной мозг. С БАС связано множество генетических мутаций, основные из которых затрагивают Cu/Zn супероксиддимутазу (SOD1), а также РНК-связывающие белки – TDP-43 и FUS. Большинство случаев заболевания БАС связано с накоплением неправильно свернутых белков, а также их агрегатов [1]. Деградация таких белков при помощи убиквитинпротеасомной системы или аутофагосомного пути относится к потенциальным терапевтическим мишеням, поскольку эффективность этих механизмов снижается с возрастом [2, 3].

Шапероны (белки теплового шока) и кошапероны обеспечивают внутриклеточный гомеостаз и препятствуют повреждению клеточных белков при повышении температур и других стрессирующих воздействиях внешней среды, а также при старении. Они являются неотъемлемой частью системы протеостаза в эукариотических клетках, выполняя ключевую роль в процессах сворачивания и созревания белков, а также деградации белков с неправильной конформацией и агрегатов из них. К семейству белков теплового шока с молекулярной массой 70 кДА (БТШ70) относятся одни из самых распространенных и повсеместно экспрессируемых шаперонов, которые участвуют во многих биологических процессах [4].

В исследованиях, проведенных на клеточных и животных моделях, показано, что повышенная экспрессия БТШ70 способствует снижению олигомеризации α-синуклеина [5, 6], а также ингибирует аккумуляцию полиглутамина, характерную для болезни Хантингтона [7]. Было показано, что введение рекомбинантного человеческого стресс белка (БТШ70) животным с моделью нейродегенераци типа болезни Альцгеймера, а также при сепсисе способно уменьшать клинические проявления этих патологий [8]. Уровень БТШ70 в спинном мозге пациентов со спорадической формой БАС значительно снижен [9], из чего можно предположить его роль в предотвращении развития патогенетического процесса.

Результаты этого исследования также вносят вклад в понимание роли БТШ70 в развитие процесса протеинопатии.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Животные. Для этого исследования была создана новая гибридная линия животных с коэкспрессией аберрантного белка ΔFUS(1-359) [1] и БТШ70 человека [10]. Генотип животных подтверждали при помощи ПЦР. Для определения наличия трансгенных кассет использовался метод ПЦР с использованием коммерческого набора GenPak PCR Core (ISOGENE laboratory ltd., Россия). Для детекции вставки FUS использовалась смесь праймеров: FUS_for: TCTTTGTGCAAGGCCTGGGT, FUS_rev: TAATCATGGGCTGTCCCGTT (Evrogen, Россия, C = 100 мкм) – 0.2 мкл. Для детекции вставки HSP использовалась смесь праймеров: HSP_for: AAGACCCTCCTCCTGTATGG, HSP_rev: TCAGACGCAACTCAGCAC (Evrogen, Россия, C = 100 мкм) – 0.2 мкл.

Для исследования использовали только самцов. В качестве контроля использовали геми- и гомозиготных особей по трансгенной кассете FUS(1-359), а также животных с экспрессией человеческой изоформы белка теплового шока 70 кДа (HSPhet) и животных дикого типа (CD1).

Методы оценки локомоторных функций. Оценку моторных функций трансгенных животных проводили при помощи тестов: “сила хватки”, “перевернутая сетка”, а также анализировали изменение походки при помощи установки CatWalk (Noldus, США). Животных тестировали в возрастных точках 30, 60, 90 и 120 дней, соответствующих разным стадиям развития модельного заболевания. Силу хватки передними лапами оценивали при помощи динамометра, каждое животное тестировали 3 раза. В качестве результата представлена сумма сил хватки в трех попытках.

В тесте “перевернутая сетка” животное помещали на сетку (размер ячейки 1 × 1 см), которую затем поднимали на высоту 1 м и переворачивали на 180° таким образом, чтобы мышь оказалась снизу, и выдерживали в течение 60 с. Фиксировали время проведенное на сетке в трех последовательных попытках с разницей 30 мин. В качестве результата представлено среднее время удержания на сетке в трех попытках. В данном тесте оценивается выносливость животного.

Дополнительно был проведен анализ изменения координации и походки животных на установке CatWalk. Животных помещали в темный коридор, подсвеченный снизу, и давали возможность свободно проходить в любом направлении. Каждое животное должно было совершить 3 успешных пробежки (“успешность” определяется программным обеспечением Noldus).

Протоколы экспериментального исследования на животных и методы эвтаназии согласованы с Комиссией по биоэтике ИФАВ РАН (протокол заседания Комиссии по биоэтике № 30 от 15.04.2019 г.).

Иммуногистохимия. Для иммуногистохимического анализа брали шейный отдел спинного мозга, как у животных гибридной линии FUS(1-359)^Het-hHSP^Het, так и у FUS(1-359)^Het в качестве контроля. Ткани забирали в двух временных точках – 60 и 90 дней, каждая группа состояла из трех животных. Образцы ткани были зафиксированы раствором параформальдегида 4% и заключены в парафин. Проводили иммунофлуоресцентное окрашивание трансгенной аберрантной формы FUS(1-359), которую визуализировали с помощью антител против N-концевого фрагмента белка FUS (Abcam, Великобритания). Эндогенный FUS белок визуализирован с помощью окрашивания антителами против C-концевого фрагмента белка FUS (SantaCruzBiotech, США), который отсутствует у FUS(1-359).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Начиная с возраста 60 дней, животных ежедневно осматривали для детектирования начала симптоматической стадии болезни. Кривая выживаемости Каплан–Майера показывает, что у двойных трансгенов FUS(1-359)^Het-hHSP^Het средний возраст гибели был выше по сравнению с контрольными животными линии FUS(1-359)^Het и FUS(1-359)^Homo (рис. 1). Эти данные также коррелируют со средним возрастом начала манифестаций и продолжительности симптомов (рис. 2).

Рис. 1.

Сравнение кривых выживаемости (по Каплану-Мейеру) между группами модельных животных с двойным трансгеном FUS(1-359)^Het-hHSP^Het (n = 40), FUS(1-359)^Het (n = 42), FUS(1-359)^Homo (n = 45) и животными дикого типа линии CD1 (n = 11).

Рис. 2.

Манифестация и продолжительность клинических симптомов у трансгенных животных. Средний возраст начала (а) и продолжительности симптоматического периода (б) у животных с двойным трансгеном FUS(1-359)^Het-hHSP^Het (n = 39), гемизиготных FUS(1-359)^Het (n = 60) и гомозиготных FUS(1-359)^Homo (n = 53). Уровень достоверности оценивался согласно непараметрическому t-критерию Вилкоксона–Манна–Уитни: * p < 0.05; ** p < 0.01.

Другим важным физиологическим параметром, отражающим общую оценку здоровья, является прирост массы. Как правило, здоровые животные имеют стабильный прирост, тогда как начало патологического процесса часто коррелирует с флуктуациями в массе животных. В нашем исследовании было установлено, что прирост массы мышей двойных трансгенов FUS(1-359)^Het-hHSP^Het схож с приростом массы мышей дикого типа и трансгенных животных с экспрессией человеческой изоформы hHSP^Het, тогда как у трансгенных гемизиготных животных FUS(1-359)^Het этот показатель снижен. Было установлено, что пик падения прироста массы для двойных трансгенов (FUS(1-359)^Het-hHSP^Het) приходится на возраст 140 дней, тогда как у животных FUS Het – на 130 день.

Сила хватки у животных FUS(1-359)^Het-hHSP^Het в возрастной группе 60 дней достоверно превышала значения группы животных FUS(1-359)^Het в этом же возрасте. Однако с возрастом сила хватки к 120 дню снижалась у животных FUS(1-359)^Het-hHSP^Het и достоверно не отличалась от животных FUS(1-359)^Het, тогда как показатели в двух других контрольных группах (контрольные животные дикого типа WT и животные с экспрессией hHSP^Het) неуклонно росли (рис. 3а). Такого рода данные могут свидетельствовать о потенциальном терапевтическом эффекте БТШ70 на ранних стадиях заболевания, когда в тканях трансгенных животных с развивающейся протеинопатией еще не детектируются отложения. Вероятнее всего, с возрастом накопление внутриклеточных FUS-позитивных отложений приводит к гибели мотонейронов и прогрессии протеинопатии.

Рис. 3.

Результаты теста “сила хватки” (а) и среднее время удерживания на перевернутой сетке (б) для групп FUS(1-359)^Het-hHSP^Het (n = 13), FUS(1-359)^Het (n = 9), дикого типа CD1 (WT) (n = 7), а также hHSP^Het (n = 11). Уровень достоверности оценивался согласно непараметрическому t-критерию Вилкоксона–Манна–Уитни: * p < 0.05.

Результаты теста “перевернутая сетка” показали, что достоверные отличия были обнаружены у животных FUS(1-359)^Het-hHSP^Het и FUS(1-359)^Het в возрастных группах 30 и 90 дней (рис. 3б), что свидетельствует о том, что животные гибридной линии с экспрессией человеческой изоформы hHSP^Het были выносливее трансгенных животных линии FUS(1-359)^Het.

Дополнительно был проведен анализ изменения координации и походки животных на установке CatWalk. Ранее были определены критерии, которые позволяли оценить основные параметры моторной дисфункции, отличающиеся у контрольных животных дикого типа и трансгенных животных линии FUS(1-359)^Het. Однако, несмотря на большое количество выявленных критериев, наиболее физиологически релевантным оказалось изменение средней скорости движения животного. Достоверные отличия скорости движения в группах FUS(1-359)^Het и FUS(1-359)^Het-hHSP^Het наблюдались во всех возрастных группах (рис. 4). Однако стоит отметить, что показатели скорости животных в группе FUS(1-359)^Het-hHSP^Het достоверно отличались во всех тестируемых возрастных группах относительно контрольной группы животных дикого типа. Это может свидетельствовать о том, что нейропротекторный эффект БТШ70 был недостаточным для полного восстановления двигательных функций до значений, наблюдаемых у контрольной группы.

Рис. 4.

Результаты характеристики средней скорости движения животных в установке NoldusCatwalk у трансгенных животных в разных возрастных группах (60, 90 и 120 дней). Количество животных с двойным трансгеном FUS(1-359)^Het-hHSP^Het (n = 13), FUS(1-359)^Het (n = 9), животных дикого типа линии CD1 (WT, n = 7) и животных с экспрессией человеческой изоформы БТШ70 (HSP, n = 11). Уровень достоверности оценивался согласно непараметрическому t‑критерию Вилкоксона–Манна–Уитни: * p < 0.05.

Для определения роли БТШ70 в накоплении FUS(1-359)-позитивных отложений провели иммунофлуоресцентный анализ гистопатологических отложений в спинном мозге трансгенных животных. Оказалось, что у гибридной линии трансгенных животных FUS-HSP общая плотность FUS(1-359)-позитивно окрашенных клеток ниже по сравнению с трансгенными животными линии FUS Het в обеих возрастных точках, выбранных для анализа. Для количественной оценки этого параметра использовали отношение плотности сигнала эндогенного белка FUS к экзогенному (рис. 5).

Рис. 5.

Сравнение отношения флуоресцентного сигнала эндогенного белка FUS к экзогенному у животных с двойным трансгеном FUS(1-359)^Het-hHSP^Het и FUS(1-359)^Het. Уровень достоверности оценивался согласно непараметрическому t-критерию Вилкоксона–Манна–Уитни: * p < 0.05; *** p < 0.001.

Известно, что белки теплового шока играют важную роль в обеспечении гомеостаза организма, а также являются частью нейропротекторной системы. Возрастные изменения совпадают с нейродегенеративными процессами, связанными с накоплением в нервной системе различных белковых отложений. Поведенческая характеристика и фенотипирование новой гибридной линии животных выявили, что экспрессия белка БТШ70 человека способствует увеличению продолжительности жизни в условиях развивающейся протеинопатии. Это один из первых важных результатов, указывающих на возможность использования препаратов на основе БТШ70 в качестве лекарственного средства для лечения нейродегенеративных расстройств. Полученные результаты по оценке возраста манифестации и продолжительности симптоматической фазы (оба значения увеличивались) у FUS(1-359)^Het-hHSP^Het животных могут свидетельствовать о болезнь-модифицирующих свойствах привнесенного БТШ70. Это также поддерживает вывод об основной роли БТШ70 в качестве нейропротекторного агента при развивающейся FUS-протеинопатии, что подтверждается результатами иммуногистохимического окрашивания срезов спинного мозга.

Можно отметить, что биологическая роль БТШ70 при развивающейся протеинопатии на физиологическом уровне заключается в увеличении выносливости, мышечной силы и улучшении координации трансгенных животных, моделирующих нейродегенеративное заболевание.

При детальном анализе отложений было выявлено, что нейроны в передних рогах шейного отдела спинного мозга (в зоне от третьего сегмента L3 до пятого L5) у трансгенных животных линии FUS Het образуют гистопатологические включения, которые не встречаются в этих же сегментах спинного мозга у гибридной линии животных FUS-HSP. Вполне возможно, что наличие трансгенной человеческой изоформы БТШ70 может влиять на формирование сложных внутриклеточных отложений, являющихся причиной развивающейся протеинопатии. Следовательно, наличие человеческой изоформы БТШ70 в трансгенных животных может выполнять функцию шаперона, которая препятствует формированию белковых отложений, тем самым проявляя нейропротекторные свойства.