Нейрохимия, 2021, T. 38, № 2, стр. 177-185

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Пациенты. Критериями включения были: диагноз БАС согласно переработанным критериям El Escorial [7], возраст старше 20 лет, быстрые или медленные темпы прогрессирования заболевания (см. далее), бульбарная, шейно-грудная или пояснично-крестцовая формы БАС, наличие подписанного информированного согласия на участие в исследовании. Критериями исключения были: наличие хронических воспалительных заболеваний, онкологической патологии, других неврологических заболеваний, острое инфекционное заболевание в течение месяца до включения в исследование, прием препаратов, действующих на иммунную систему (кортикостероиды, цитостатики и др.). На основании критериев исключения в группу не вошли 7 пациентов, потенциально подходивших по критериям включения. Один пациент был исключен из анализа в связи с тем, что не пройден контроль качества при анализе экспрессии генов нейровоспаления. В результате в исследовании приняли участие 22 пациента с БАС и 12 здоровых добровольцев. Пациенты были набраны в 2 подгруппы, в зависимости от темпов прогрессирования заболевания в течение 12 месяцев до включения в исследования: 1. медленно прогрессирующие – снижение балла по шкале функциональной оценки при БАС ALS-FRS-R не более 2 баллов; быстро прогрессирующие – снижение балла по шкале ALS-FRS-R на 10 и более. Пациенты не страдали хроническими аутоиммунными, инфекционными и онкологическими заболеваниями, не переносили острых инфекций по крайней мере в течение месяца до включения в исследование.

Выделение РНК. РНК была выделена из мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC). Забор крови производился в пробирки BD Vacutainer с ЭДТА (BD, USA), материал обрабатывался в течение часа после забора. PBMC выделяли с помощью градиента плотности с использованием фиколла Histopaque-1077 (Sigma-Aldrich, USA). Образцы крови были аккуратно нанесены на слой фиколла в пробирке объемом 15 мл. Пробирки были центрифугированы при 400 g в течении 30 мин при комнатной температуре. Полученный в результате центрифугирования слой PBMC переносился в стерильную пробирку и отмывался в 10 мл фосфатного буфера (1% FBS), после чего центрифугировался в течение 10 мин при 300 g. Надосадок удалялся, клетки ресуспендировались в 1 мл клеточной среды RPMI и считались. Аликвоты по 3–5 × 10⁶ PBMC были заморожены при –80°C до изоляции РНК. РНК была изолирована из одной аликвоты с помощью набора для выделения РНК Total RNA Purification Plus Kit (Norgern Biotek, Canada) согласно инструкции производителя. Концентрация РНК измерялась с помощью NanoDrop2000C (ThermoScientific) и корректировалась до 60 нг/мкл с помощью вакуумного концентратора. Соотношение OD_260/280 для всех образцов составляло 1.72–2.10. Образцы РНК хранились до использования при –80°C, но не более 1 мес.

Мультиплексный анализ экспрессии генов нейровоспаления. Анализ экспрессии генов нейровоспаления проводился с помощью методики NanoString (NanoString Technologies, WA). Технология основана на уникальном прямом баркодировании целевой РНК с помощью флуоресцентных проб. В нашем исследовании была использована стандартная панель генов нейровоспаления nCounter Human Neuroinflammation panel, состоящая из 770 генов, включая 758 сигнатурных генов и 12 конститутивных генов. Образцы анализировались на приборе nCounter Analysis System (NanoString Technologies) согласно инструкции производителя. Каждый образец содержал по меньшей мере 300 нг РНК. Первичная обработка данных проводилась с помощью программного обеспечения nSolver package (version 4.0). Нормализация первичных данных проводилась по 6 положительным контролям и 12 конститутивным генам, включенным в панель. Фон оценивался по 6 отрицательным контролям, также присутствующим в панели. Для дальнейшего анализа экспрессии использовался модуль Advanced Analysis module. Данные, полученные с помощью системы nCounter, выражены в условных единицах, отражающих концентрацию таргетных молекул РНК в образце. Образцы были заслеплены: экспериментатор не знал о принадлежности образцов пациентам определенных групп.

Статистическая обработка данных. Статистическая обработка данных проводилась с помощью IBM SPSS Statistics 23 и GraphPad Prizm 8. Данные были заслеплены: клинические характеристики и принадлежность к той или иной группе были закодированы, экспериментатор не имел доступа к данным о пациентах во время статистического анализа. Для анализа использовались Log2-данные. Проверка на нормальность распределения проводилась с помощью критерия Колмогорова–Смирнова. Поскольку проверка на нормальность подтвердила нормальное распределение данных внутри групп здоровых добровольцев (0), пациентов с медленным прогрессированием и быстрым прогрессированием БАС, а также внутри групп пациентов с профилями экспрессии 1 и 2, для выявления дифференциально экспрессируемых генов (ДЭГ) в этих группах применялся однофакторный дисперсионный анализ c проведением поправки на пол и возраст. Критерием выявления ДЭГ было значение р < 0.05. Для исключения ложноположительных результатов проводилась поправка на множественность сравнений Беньямини–Хохберга (показатель q), пороговым значением для выявления ДЭГ было значение q < 0.05. Для ДЭГ был проведен post-hoc анализ с попарными сравнениями между группами и поправкой Бонферрони. Различия между группами считались статистически значимыми при р < 0.05. Для выявления корреляций между экспрессией генов и клиническими характеристиками заболевания был использован коэффициент ранговой корреляции Спирмена. Корреляции считались значимыми при р < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Клиническая характеристика пациентов. В исследование были включены 22 пациента с БАС: 11 с быстрыми темпами прогрессирования за последний год (снижение по ALSFRS-R на более 10 баллов), 11 с медленными темпами прогрессирования (снижение балла по ALSFRS-R за год на 1–2 балла) и 12 здоровых добровольцев. Клиническая характеристика групп исследования представлена в табл. 1. Статистически значимых различий по полу, возрасту, частоте встречаемости различных форм заболевания, жизненной емкости легких (ЖЕЛ), индексу массы тела (ИМТ) между группами не выявлено. В группе пациентов с быстрым темпом прогрессирования была отмечена меньшая длительность заболевания (p = 0.002), ниже значение балла по шкале ALSFRS-R (p < 0.001) и большее значение стадии заболевания (p < 0.001), что говорит о худшем функциональном состоянии пациентов этой группы. В группе пациентов с быстрым темпом прогрессирования было большее количество больных с бульбарной формой и меньшее количество пациентов с пояснично-крестцовой формой, чем в группе с медленным темпом прогрессирования, что представляется логичным, поскольку дебют заболевания с бульбарных нарушений считается прогностически неблагоприятным [7]. Тем не менее, в связи с общностью патофизиологических процессов, анатомический уровень, на котором дебютировало заболевание не влияет на однородность групп и статистическую обработку результатов.

Экспрессия генов нейровоспаления у пациентов с БАС. Различия экспрессии генов нейровоспаления были визуализированы с помощью тепловой карты, согласно которой есть большой пул генов, различающихся у здоровых добровольцев и пациентов с БАС. Также видны группы генов, различающихся по экспрессии между пациентами с различными темпами прогрессирования БАС (рис. 1). Однако при проведении статистического анализа различий экспрессии генов нейровоспаления в группах пациентов с быстрым и медленным течением БАС и здоровыми добровольцами было выявлено всего 14 генов со статистически значимым различием экспрессии: BAX, CLN3, PLEKHM1, AKT1, LAMP1, RAC2, VAV1, MPG, TFG, BRD2, CSK, MSN, GBA, VIM (табл. 2). Наиболее широко представленными функциональными группами со статистически значимым различием экспрессии были гены, связанные с аутофагией (CLN3, AKT1, LAMP1, RAC2, VAV1, CSK, MSN), апоптозом (BAX, AKT1, TFG, GBA), приобретенным иммунитетом и факторами роста (AKT1, RAC2, VAV1, CSK). Попарное сравнение групп показало, что экспрессия всех указанных генов, кроме BRD2, различается между пациентами с БАС и здоровыми добровольцами, но не между пациентами с быстрым и медленным темпами прогрессирования БАС. Экспрессия гена BRD2 была повышена в группе пациентов с быстрым прогрессированием заболевания, по сравнению с пациентами с медленным прогрессированием БАС и здоровыми добровольцами. Ген BRD2 функционально относится к генам, связанным с эпигенетическим регулированием. Ранее BRD2 не был ассоциирован с БАС, его связывали с развитием нервной системы в процессе эмбриогенеза, с ювенильной миоклонической эпилепсией, ожирением и определенными гемобластозами [8–10].

Рис. 1.

Экспрессия генов нейровоспаления в группах пациентов с БАС и здоровых добровольцев. В столбцах представлены усредненные значения экспрессии генов групп пациентов: 0 – здоровые добровольцы; 1 – пациенты с медленным прогрессированием БАС в последние 12 мес.; 2 – пациенты с быстрым прогрессированием БАС в последние 12 мес. Строки представляют уровень экспрессии отдельных генов: черный – среднее значение экспрессии по общей выборке пациентов; красный – повышенный уровень экспрессии по сравнению со средним; зеленый – пониженный уровень экспрессии.

Корреляции экспрессии генов нейровоспаления с клиническими характеристиками. В ходе корреляционного анализа были проанализированы взаимосвязи экспрессии генов нейровоспаления с клиническими характеристиками заболевания у 22 пациентов с БАС, принявших участие в исследовании. Была выявлена статистически значимая умеренная положительная (r = 0.5–0.75) корреляция экспрессии генов BRD2 (r = 0.535, p = 0.01), связанного с эпигенетической регуляцией, и FYN (r = 0.575, p = 0.005), участвующего в каскадах врожденного и приобретенного иммунитета, функционировании микроглии, факторов роста, ангиогенеза и аутофагии, со стадией заболевания. Значение балла по шкале ALSFRS-R имело умеренную отрицательную корреляцию с экспрессией генов KDM3A (r = –0.623, p = 0.002), связанного с эпигенетической регуляцией, PILRB (r = –0.512, p = = 0.015), участвующего в реакциях врожденного иммунитета, и TSPAN18 (r = –0.529, p = 0.011), связанного с функцинированием микроглии; уменьшение балла по шкале ALSFRS-R за последние 12 мес. имело положительную корреляцию с экспрессией BRD2 (r = 0.588, p = 0.004), CTSW (r = 0.526, p = 0.012), секретируемого цитотоксическими клетками, и KDM3A (r = 0.542, p = = 0.009). Наибольшее количество статистически значимых корреляций было выявлено между экспрессией генов нейровоспаления и длительностью заболевания. Экспрессия генов C6 (r = 0.547, p = 0.008), CCNG2 (r = 0.514, p = 0.014), CD47 (r = = 0.543, p = 0.009), CLDN5 (r = 0.501, p = 0.017), CLIC4 (r = 0.628, p = 0.002), COA5 (r = 0.501, p = = 0.018), COL6A3 (r = 0.527, p = 0.012), DNA2 (r = = 0.510, p = 0.015), ESAM (r = 0.525, p = 0.012), IKBKB (r = 0.516, p = 0.014), PROS1 (r = 0.651, p = = 0.001), RAB6B (r = 0.629, p = 0.002), TMEM64 (r = 0.675, p = 0.001) положительно коррелировала с длительностью заболевания. Среди них наиболее широко представлены гены, связанные с активацией микроглии и ремоделированием матрикса. Экспрессия DDB2, связанным с повреждением ДНК, имела отрицательную корреляцию с длительностью заболевания.

Воспалительный профиль экспрессии у части пациентов. При анализе тепловой карты и вулканных диаграмм экспрессии генов нейровоспаления пациентов с БАС были визуализированы два профиля экспрессии: профиль 1 (12 пациентов) и 2 (7 пациентов) (рис. 2). Был проведен статистический анализ экспрессии генов нейровоспаления у пациентов с профилем 1, профилем 2 и здоровых добровольцев, который выявил 292 дифференциально экспрессируемых гена. При попарном post-hoc сравнении групп выявлено, что наиболее выраженное отличие от остальных групп имеет профиль 2: обнаружено 208 генов, по которым профиль 2 статистически значимо различался с профилем 1, и 262 гена, различавших его с группой здоровых добровольцев. Напротив, профиль 1 различался с профилем здоровых добровольцев лишь по 49 генам. Основными функциональными группами генов, по которым профиль 2 отличался от остальных профилей экспрессии, были гены, связанные с врожденным и приобретенным иммунитетом, функционированием микроглии, апоптозом, аутофагией и факторами роста. При анализе клинических характеристик пациентов, имевших профили экспрессии 1 и 2, существенных различий выявлено не было. Темпы прогрессирования заболевания также не были связаны с профилем экспрессии.

Рис. 2.

Различные профили экспрессии генов нейровоспаления у пациентов с БАС. (а) Тепловая карта экспрессии генов нейровоспаления у пациентов с БАС. В столбцах представлены значения экспрессии генов отдельных пациентов. Строки представляют уровень экспрессии отдельных генов: черный – среднее значение экспрессии по общей выборке пациентов; красный – повышенный уровень экспрессии по сравнению со средним; зеленый – пониженный уровень экспрессии. Первый столбец представляет собой результаты пациента, который был исключен из исследования в связи тем, что образец не прошел контроль качества. (б) Вулканная диаграмма, представляющая сравнение изменение экспрессии генов, ассоциированных с нейровоспалением, в группе с профилем 1 по сравнению со здоровыми добровольцами. По оси абсцисс – кратность изменения экспрессии, по оси ординат – отрицательный десятичный логарифм уровня значимости р. (в) Вулканная диаграмма, представляющая сравнение изменение экспрессии генов, ассоциированных с нейровоспалением, в группе с профилем 2 по сравнению со здоровыми добровольцами. По оси абсцисс – кратность изменения экспрессии, по оси ординат – отрицательный десятичный логарифм уровня значимости р. Синим выделены гены, достоверно различающиеся между группами.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В нашем исследовании были выявлены гены, связанные с нейровоспалением, экспрессия которых различается в мононуклеарных клетках периферической крови у больных с БАС и здоровых людей – это были гены, связанные с аутофагией, апоптозом, реакциями приобретенного иммунитета и сигнальными каскадами факторов роста. У больных с БАС было обнаружено 2 различных профиля экспрессии генов нейровоспаления. Один из них был схож с профилем экспрессии здоровых людей, в другом отличалась экспрессия генов, связанных с врожденным и приобретенным иммунитетом, функцией микроглии, аутофагией и апоптозом, каскадами факторов роста.

В последние годы все больше исследований указывают на роль системного воспаления и иммунных реакций у пациентов с БАС [11–13]. Показано, что при БАС происходит активация микроглии и астроцитов, что имеет нейропротективное значение на ранних этапах заболевания и провоспалительное на поздних стадиях. В зонах гибели мотонейронов в ЦНС среди основных патологических изменений описывается активация микроглии и периваскулярная инфильтрация моноцитами и Т-клетками [14]. При прижизненной позитронной эмиссионной томографии головного мозга у пациентов с БАС выявляются признаки распространенной активации микроглии [15]. Активированные в результате других патологических реакций, связанных с БАС, астроциты и микроглия способствуют ускорению темпов гибели нейронов. Провоспалительные цитокины, секретируемые ими, содействуют процессам глутаматной эксайтотоксичности, связывая между собой нейровоспаление и гибель нейронов, ассоциированную с эксайтотоксичностью [16].

При БАС описаны мутации в множестве генов, экспрессируемых как в нейронах, так и в микроглии, приводящие к нарушению аутофагии, активации воспалительных путей в микроглии и астроглии и гибели двигательных нейронов [1, 17]. Но даже у пациентов со спорадическим БАС без известных генетических изменений отмечается увеличение численности провоспалительных макрофагов и дисфункциональных Т-регуляторных клеток [13, 18]. В ряде исследований отмечено снижение экспрессии основного маркера Т-регуляторных клеток фактора транскрипции FOXP3 у пациентов с БАС и их способности подавлять пролиферацию других Т-лимфоцитов, что приводило к активации провоспалительных реакций. Эти изменения были наиболее выраженными у пациентов с быстрыми темпами прогрессирования заболевания. Интересно отметить, что при культивировании Т-регуляторных клеток, полученных от пациентов с БАС, со временем их функциональные способности восстанавливались [18, 19].

При анализе транскриптома у близнецов, среди которых только один болен БАС, определялось различие экспрессии 750 генов, принадлежащих к 74 сигнальным путям. Среди них отмечалось повышение экспрессии генов принадлежащих к 25 путям, связанным с иммунными функциями и передачей сигнала в клетках [20]. Изменение экспрессии генов, связанных с нейровоспалением было обнаружено и в фибробластах, полученных от пациентов с БАС, по сравнению с фибробластами здоровых людей, – наиболее выраженными были отличия экспрессии генов, принадлежащим к сигнальным путям Toll- и NOD-подобных рецепторов [12]. При анализе экспрессии генов нейровоспаления циркулирующих моноцитов пациентов с БАС был выявлен специфический провоспалительный профиль, включающий IL1B, IL8, FOSB, CXCL1 и CXCL2. Научной группой Zhao W. и соавт. в моноцитах пациентов с быстропрогрессирующим течением БАС было выявлено большее число генов с отличающейся от здоровых добровольцев экспрессией, чем в моноцитах больных с медленно прогрессирующим течением. Подобное провоспалительное состояние врожденной иммунной системы указывает на возможную роль моноцитов/макрофагов в патогенезе БАС [13]. В нашем исследовании существенных различий между профилями экспрессии генов нейровоспаления у пациентов с быстро и медленно прогрессирующим течением БАС не обнаружено. Такое расхождение результатов может быть связано с использованием другого набора исследуемых генов и биологического материала, а также других критериев оценки темпов прогрессирования БАС. В то же время у пациентов с отличающимся профилем экспрессии генов нейровоспаления (профиль 2) в нашей работе более быстрого темпа прогрессирования заболевания отмечено не было. Клинические характеристики, связанные с провоспалительным профилем экспрессии генов в РВМС у части пациентов с БАС в нашем исследовании, еще предстоит уточнить.

Каким образом провоспалительные миелоидные клетки могут быть связаны с прогрессированием БАС пока неясно. Возможно они мигрируют в ЦНС, поскольку при БАС и в моделях БАС показано нарушение целостности гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) [21]. Оказывая провоспалительное воздействие в ЦНС, они могут способствовать нейродегенерации. Даже если они не проникают в ЦНС они могли бы модулировать течение заболевания за счет увеличения выраженности периферического воспаления: проникая в селезенку, лимфатические узлы и контактируя с клетками периферической крови, они могут модулировать провоспалительный статус Т-клеток [22], дендритных клеток и натуральных киллеров, оказывая непрямое влияние на воспалительные процессы в ЦНС.

ВЫВОДЫ

Таким образом, полученные нами результаты свидетельствуют об активации воспалительного процесса в периферических иммунных клетках, по сравнению со здоровыми людьми. Много данных указывают на то, что реакции воспаления являются одним из механизмов, способствующих прогрессированию нейродегенерации как при БАС, так и при других нейродегенеративных заболеваниях. Считается, что развитие БАС является многоступенчатым процессом, включающим большое количество патогенетических каскадов. Каждый шаг в этом процессе привносит свои патофизиологические изменения и таким образом является неотъемлемым элементом в развитии и прогрессировании заболевания. В нашем исследовании выявлена группа пациентов с особенно выраженным изменением экспрессии генов, связанных с нейровоспалением. Может ли рассматриваться экспрессия генов, ассоциированных с нейровоспалением, в качестве потенциального прогностического биомаркера, пока непонятно. Дальнейшее изучение воспалительных реакций при БАС может стать основой для разработки новых терапевтических подходов, которые позволят снизить темпы прогрессирования заболевания.