Нейрохимия, 2021, T. 38, № 4, стр. 355-363

ВВЕДЕНИЕ

Одна из новейших технологий редактирования генома, основанная на системе CRISPR–Cas9, уже привела к прогрессу в области биотехнологии и медицины. В классическом варианте системы используется сконструированная единая направляющая РНК (sgRNA), чтобы направлять нуклеазу Cas9 в таргетную область по принципу комплементарности. Затем Cas9 расщепляет ДНК и образует двухцепочечные разрывы (ДЦР), репарация которых приводит к вставкам или делециям (инделам) в целевых геномных локусах [1]. Этот подход – нокаут гена – редко может быть применен для генной терапии, когда важно восстановить нормальную последовательность гена. В этом случае в процессе репарации важно участие гомологичной матрицы ДНК, роль которой может играть как гомологичная хромосома, так и искусственно добавленная молекула.

Как и для классических подходов генной терапии, для геномного редактирования остро стоит вопрос доставки этого генетического инструмента в клетки. Важно, чтобы компоненты CRISPR–Cas9 с высокой эффективностью попали в таргетные клетки, но в то же время не попали в другие (или при попадании не функционировали); чтобы быстро начинали свое действие внутри клетки и не персистировали в ней.

Наиболее частыми формами доставки CRISPR‒Cas9 являются плазмидная ДНК (пДНК), матричная РНК (мРНК) или рибонуклеопротеиновый комплекс (RNP) [2]. Мировые данные [2–5] свидетельствуют о том, что эффективность доставки CRISPR–Cas9 в клетки можно повысить, используя RNP, который состоит из белка Cas9 в комплексе с синтезированной in vitro sgRNA. Прямая доставка RNP комплекса позволяет избежать многих нежелательных эффектов, связанных с пДНК или мРНК доставкой [5–8]. Одно из преимуществ доставки в форме RNP заключается в том, что редактирование гена начинается сразу, без процесса внутриклеточного синтеза компонентов и сборки системы CRISPR, также RNP достаточно быстро деградирует, что способствует снижению потенциального неспецифического действия CRISPR–Cas9 [7]. Все это в свою очередь позволяет повысить эффективность коррекции мутаций при геномном редактировании.

Целью работы явилось сравнение эффективности внесения инделов в ген EGFP и коррекции путем гомологичной репарации мутации с.337delG в этом гене при доставке CRISPR–Cas9 в виде плазмид и RNP с помощью липидных наночастиц.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Этическое одобрение. Для данного исследования этическое одобрение не требовалось, так как в рамках него не проводилось каких-либо исследований с использованием животных или с участием людей в качестве объектов.

Клеточные культуры. Эксперименты проводили на двух клеточных культурах: HEK293T (предоставлена к. б. н. М.Ю. Скобловым, лаборатория функциональной геномики ФГБНУ “МГНЦ”, Москва) и HEK293T-GFPmut. Последнюю получали путем лентивирусной трансдукции. Ген EGFP с мутацией с.337delG был амплифицирован с плазмиды pEGFP-mut (см. далее) и клонирован в плазмиду pLVT_turboRFP635. Вирионы были получены в HEK293T (60 мм чашка) из трех плазмид: 2 мкг pR8.91, 0.6 мкг pMD.G и (2 мкг) pLVT_turboRFP635-eGFPmut (все плазмиды были любезно предоставлены Didier Trono, https:// www.epfl.ch/labs/tronolab/). Среду с вирусом пропускали через 0.45 мкм фильтр и использовали ее для заражения клеток HEK293T (5–7 MOI). С помощью клеточной сортировки были отобраны позитивные по красной флуоресценции клетки.

За день до трансфекции клетки высевали в 12-луночный планшет по 200 тысяч клеток на лунку и культивировали в DMEM (ПанЭко, Россия) с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки (Thermo Fisher Scientific, USA), 100 мкг/мл пенициллин/стрептомицина (ПанЭко, Россия) и 4 мМ L-глутамина (ПанЭко, Россия). В день трансфекции конфлюентность составляла 60–70%.

Клонирование плазмид. Исходная плазмида для CRISPR–Cas9 еSpCas9(1.1) была любезно предоставлена Feng Zhang (Addgene #71814). Направляющие РНК (sgRNA) были подобраны с помощью свободного программного обеспечения, разработанного Broad Institute (США) (http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design). sgRNA GFP1 (на последовательность EGFP дикого типа) и GFP2 (на последовательность EGFP с мутацией с.337delG) были клонированы в исходную плазмиду – Cas9(1.1)-GFP1 и Cas9(1.1)-GFP2. Плазмида pEGFP-mut была получена из pEGFP-C1 (Clontech, США) путем внесения мутации с.337delG сайт-направленным мутагенезом.

Сборка RNP комплексов. Исходный белок Cas9 (NEB, USA) готовили в буфере того же производителя, добавляли sgRNA, синтезированную набором Guide-it™ sgRNA In Vitro Transcription Kit (Takara Bio, Japan) по протоколу производителя, в соотношении 1 : 5 (мкг) в среде Gibco Opti-MEM (Thermo Fisher Scientific, США). Для in vitro транскрипции использовали праймеры sgGFP1: 5'‑GTCGCCCTCGAACTTCACCT-3' и sgGFP2: 5'-TGTCGCCCTCGAACTTCACT-3'. Далее создавали липидные комплексы с Lipofectamine CRISPRMAX (Thermo Fisher Scientific, США) по протоколу производителя, после чего производили трансфекцию.

Сборка плазмидных комплексов. Для внесения инделов в плазмидный локус EGFP использовали таргетную плазмиду pEGFP-C1 (Clontech, США) в количестве 0.6 мкг на 200 тыс. клеток в сочетании либо с RNP (Cas9 + sgRNA GFP1), либо с плазмидой Cas9(1.1)-GFP1 в количестве 5.8 мкг. Для восстановления правильной последовательности EGFP использовали таргетную плазмиду pEGFP-mut в количестве 0.6 мкг на 200 тыс. клеток в сочетании либо с RNP (Cas9+sgRNA GFP2), либо с плазмидой Cas9(1.1)-GFP2 в количестве 5,8 мкг. При этом использовали донорную молекулу ssODN-GFP длиной 120 нуклеотидов (5'-TTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCC- GCGCCGAGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCT- GGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCG-ACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGG-3') в количестве 100 пмоль на 200 тыс. клеток. Все плазмиды и ssODN трансфицировали в клетки с помощью Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific, США) по протоколу производителя.

Флуоресцентная микроскопия. Через 72 ч после трансфекции оценивали эффективность редактирования с помощью флуоресцентной микроскопии на микроскопе ZEISS Axio Vert.A1 (Carl Zeiss Microscopy, Германия).

Проточная цитофлуориметрия и сортировка клеток. Эффективность трансфекции оценивали в лунках, трансфицированных комбинацией исходной плазмиды еSpCas9(1.1) и pEGFP-C1 в соотношении 10 : 1 (5.8 мкг и 0.6 мкг, соответственно) с помощью проточной цитофлуориметрии на приборе Partec FloMax через 72 ч после трансфекции. Эффективность редактирования оценивали в экспериментальных лунках так же. GFP-положительные клетки были отсортированы на клеточном сортере S3e (Bio-Rad Laboratories, США).

Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Амплификацию проводили методом ПЦР на амплификаторе “Терцик” (ДНК-технология, Москва). Последовательность праймеров:

eGFP65_f – 5'-ACGTAAACGGCCACAAGTTCA-3';

eGFP527_r – 5'-CTGCCGTCCTCGATGTTGT-3'.

Условия ПЦР: начальная денатурация – 95°С, 5 мин; 35 циклов амплификации со следующими параметрами: 1) денатурация – 95°С, 30 с; 2) отжиг – 61°С, 20 с; 3) синтез – 72°С, 30 с; 4) инкубация при 72°С в течение 3 мин.

Секвенирование по Сэнгеру. Амликоны секвенированили по Сэнгеру с использованием праймеров для ПЦР в качестве праймеров для секвенирования на приборе ABI Prism 3130XL genetic analyzer (Applied Biosystems, США) по протоколу производителя.

TIDE/TIDER. Полученные хроматограммы после секвенирования были проанализированы с помощью программы Tracking Indels for Decomposition (https://tide.nki.nl). Приложение позволяет оценить уровни гомологичной репарации или негомологичного соединения концов ДНК. Вариант программы TIDER позволяет статистически оценить процент правильно восстановленных последовательностей и весь процент восстановленных последовательностей.

Статистический анализ. Для статистической обработки данных использовали критерий Манна–Уитни и t-тест. Статистическую обработку проводили в программе STATISTICA версия 10.0 (StatSoft, США). Различие считалось значимым, если значение p было меньше 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Внесение инделов в EGFP. На первом этапе вносили инделы в EGFP (схема эксперимента приведена на рис. 1a) с помощью CRISPR–Cas9. Эффективность разрушения (нокаутирования) EGFP оценивали проточной цитофлуориметрией с нормализацией на эффективность трансфекции. Контрольное (исходное) количество флуоресцентных клеток принимали за 100%. При нокаутировании EGFP наблюдали уменьшение доли флуоресцентных клеток (рис. 1в). На этом этапе были апробированы несколько протоколов (разное количество Cas9 в RNP, одновременное введение RNP и pEGFP-C1, а также отсроченное на 6 и 24 ч введение pEGFP-C1 после RNP). Различия во времени внесения плазмид и RNP обусловлены тем, что комплексу CRISPR–Cas9 необходимо время для синтеза и сборки внутри клетки (не менее 6 ч для RNP и 24 ч для редактирующей плазмиды). При одновременной трансфекции компонентов в клетку белок EGFP успевает накопиться до начала работы CRISPR–Cas9. В этом случае не исключены ложноотрицательные результаты редактирования и, как следствие, недостаточное снижение флуоресценции. Если разнести по времени внесение Cas9(1.1)-sgGFP_1 или RNP и pEGFP-C1wt, то комплекс CRISPR–Cas9 успевает собраться и сразу начинает вносить разрезы в рEGFP-С1wt.

Рис. 1.

а – схема эксперимента. Внесение инделов в гене EGFP в результате двухцепочечного разрыва и последующий нокаут гена. б – сравнение эффективности разрушения (нокаутирования) EGFP. Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего (*p < 0.05 – доставка с помощью RNP по сравнению с плазмидной доставкой). в – микроскопия экспериментальных лунок через 72 ч после трансфекции.

Как видно из гистограммы (рис. 1б), наиболее эффективное внесение инделов было достигнуто при добавлении 2.5 мкг Cas9 и трансфекции плазмиды pEGFP-C1 через 24 ч после RNP (p < 0.05 по сравнению с плазмидной доставкой). Доля флуоресцентных клеток при этих условиях уменьшилась в 5 раз. На следующих этапах работы использовали 2.5 мкг Cas9.

Восстановление последовательности EGFP. Восстановление правильной последовательности EGFP проводили в двух клеточных культурах: в культуре HEK293T, в которую трансфицировали плазмиду EGFP-mut, и в культуре HEK293T-GFPmut, в геном которой была встроена последовательность EGFP с той же мутацией с.337delG. Для восстановления последовательности использовали донорную молекулу ssODN. В случае восстановления правильной последовательности наблюдали флуоресценцию.

В культуре HEK293T эффективность коррекции мутации составила почти 28% при использовании RNP, по сравнению с плазмидной доставкой (5%, p < 0.05) (рис. 2б. 1). Последующая отработка протокола трансфекции плазмид и RNP комплексов позволила еще больше увеличить эффективность коррекции мутации в EGFP – практически до 17% для плазмид и 35% для RNP (p < 0.05) (рис. 2б. 2).

Рис. 2.

а – схема эксперимента. Восстановление последовательности EGFP с использованием донорной молекулы ssODN. б. 1 и 2 – сравнение эффективности восстановления EGFP. Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего (*p < 0.05, **p < 0.05 – доставка с помощью RNP по сравнению с плазмидной доставкой). в – микроскопия экспериментальных лунок через 72 ч после трансфекции. г – секвенограмма восстановленного EGFP.

Рис. 2.

Окончание

На последнем этапе работы были проведены эксперименты по восстановлению EGFP в клеточной культуре HEK293T-GFPmut. Вопреки ожиданиям, редактирование геномного локуса EGFP было менее эффективным, как с доставкой CRISPR–Cas9 в виде RNP, так и в виде плазмид. При этом доля флуоресцентных клеток при использовании RNP была в 3.6 раза ниже, чем при плазмидной доставке (p < 0.05) (рис. 3).

Рис. 3.

а – сравнение эффективности восстановления EGFP в HEK293T-GFPmut. Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего (*p < 0.05 – доставка с помощью RNP по сравнению с плазмидной доставкой). б – микроскопия экспериментальных лунок через 72 ч после трансфекции. в – секвенограмма GFP-положительных клеток после сортировки. г – результаты, обработанные с помощью TIDER (*p < 0.05 – доставка с помощью RNP по сравнению с плазмидной доставкой).

ОБСУЖДЕНИЕ

Классический вариант CRISPR–Cas9 с использованием нуклеазы считается довольно эффективным методом, особенно при нокаутировании генов или вырезания фрагментов генов. Однако нуклеаза способна создавать двуцепочечные разрывы не только в таргетном локусе, но и в других, тем самым потенциально внося дополнительные мутации в геном. Часто нецелевые эффекты наблюдаются в исследованиях с использованием плазмидной формы доставки [9, 10]. В свою очередь эти нецелевые эффекты могут приводить к нарушениям функций генов, что усложняет переход технологии редактирования генома в клиническую практику. Разработка безопасных и эффективных способов доставки системы CRISPR–Cas9 к тканям или клеткам-мишеням в организме человека отчасти может решить эту проблему. RNP представляет собой комплекс белка Cas9 с sgRNA, который формируется в пробирке и вносится в клетку уже готовым. Время жизни такого комплекса в клетке меньше, чем плазмидной ДНК, что позволяет снизить частоту неспецифического действия CRISPR–Cas9.

Кроме того, в своих работах исследователи используют не только разные способы доставки, но и разные нуклеазы [11–13]. Тогда можно предположить, что эффективность редактирования и снижение неспецифического действия варьируются именно по этой причине, независимо от способа доставки. Однако, согласно литературным данным, специфическая активность модифицированных форм нуклеаз (eSpCas9 с “повышенной специфичностью” –1.0, 1.1, HF) сохраняется на таком же уровне, что и WT-Cas9 (дикого типа) [13]. Поэтому мы считаем, что полученные достоверные отличия при использовании как RNP, так и плазмид связаны как раз со способом доставки.

Несмотря на все достоинства RNP комплексов, существуют и особые требования в выборе материалов и стратегий для их внутриклеточной доставки. Главным образом это зависит от свойства заряда системы – необходимо учитывать ее положительный заряд, в отличие от мРНК и пДНК. Хотя RNP могут быть доставлены в клетки млекопитающих с относительно высокой эффективностью с помощью электропорации, тем не менее липид-опосредованная трансфекция пользуется большей популярностью благодаря простоте использования, низкой стоимости и адаптации к системе с высокой пропускной способностью.

Геномное редактирование в нейронах и других неделящихся клетках имеет ряд ограничений, связанных, не только с доставкой CRISPR–Cas9, а также с невозможностью рекомбинации эндогенной ДНК с донорной молекулой. Известно, что направленная гомологичная репарация, один из механизмов репарации ДЦР, происходит лишь в фазы клеточного цикла G2/M [14]. Отсутствие митозов в клетках приводит к тому, что все ДЦР репарируются по другому механизму – негомологичному соединению концов, который не позволяет встроить правильную последовательность ДНК в место разрыва. Таким образом, в нейронах можно внести инделы в таргетную область генома, что может быть использовано для нокаутирования генов. Однако коррекцию мутаций и восстановление правильной последовательности гена с помощью классического CRISPR–Cas9 в этом случае сделать не получится. Для этих целей можно использовать появившиеся недавно модификации CRISPR–Cas9 – редакторы оснований [15, 16] и праймированное редактирование [17].

Проблема эффективной доставки CRISPR–Cas9 в нейроны остается такой же актуальной, как и для других типов клеток. Данные опубликованных исследований показывают возможность и успешность доставки CRISPR–Cas9 в виде RNP в клетки мозга in vivo. Для этих целей RNP доставляли с помощью различных наночастиц, например, с помощью наноклубков ДНК [18], нанолистов фосфора [19], карбоксилированного разветвленного поли(β-аминоэфира) [20], а также коммерчески доступного Lipofectamine CRISPRMAX, Thermo Fisher Scientific [21]. Для этого исследования был выбран последний упомянутый способ доставки.

В своей работе мы использовали рибонуклеиновые комплексы и плазмидные векторы для трансфекции белка Cas9 и направляющей молекулы sgRNA. В результате можно увидеть, что эффективность внесения инделов в ген EGFP и коррекции мутации с.337delG в этом гене существенно увеличиваются при доставке CRISPR–Cas9 в виде RNP комплексов. Однако это справедливо только в случае с использованием клеточной культуры HEK293T и плазмиды для редактирования pEGFP-C1mut. Повторение эксперимента, но уже с клеточной линией HEK293T-GFPmut не показало нам значительного повышения эффективности коррекции мутации.

Подобная разница в эффективности на разных линиях создает почву для размышлений. С одной стороны, возможно влияние числа копий гена, которые редактируются: в случае с плазмидами мы имеем большое число копий на клетку и тогда здесь эффективность должна быть ниже, поскольку необходимо исправить как можно больше копий. Но при этом, чем больше копий, тем чаще происходит их “встреча” с компонентами CRISPR–Cas9. В случае исправления геномного локуса ситуация обратная – у нас нет такого большого числа копий – а значит и эффективность должна быть выше. Однако система редактирования может сталкиваться со сложной пространственной организацией геномного локуса, в отличие от более доступного локуса плазмиды. Кроме того, качество получаемых рибонуклеиновых комплексов во много определяет результат редактирования. И тогда менее эффективное редактирование геномного локуса EGFP может быть связано с тем, что в работе использовалась sgRNA, синтезированная в результате in vitro транскрипции. Таким образом необходима дальнейшая проработка этого вопроса и оптимизация протокола трансфекции с учетом всех нюансов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Эффективность коррекции однонуклеотидной делеции в гене EGFP в плазмидном локусе достоверно увеличивается до 35% при использовании доставки CRISPR-Cas9 в виде RNP. Полученные результаты создают основу для разработки методов коррекции мутаций, приводящих к наследственным заболеваниям человека.