Неорганические материалы, 2019, T. 55, № 10, стр. 1123-1129

ВВЕДЕНИЕ

Гидроксиапатит (ГА) широко используют для заполнения дефектов костной ткани при хирургическом лечении болезней и травм опорно-двигательного аппарата. Часто процессы заживления и восстановления нормального функционирования кости в послеоперационный период осложнены возникновением инфекционно-воспалительных реакций, в связи с чем лечение сопровождают введением лекарственных средств, в основном антибиотиков. Использование биоматериала, обладающего антимикробной активностью, могло бы послужить альтернативой комплексу сложной и длительной терапии, которая в свою очередь может привести к появлению резистентности у микроорганизмов к используемым лекарственным препаратам.

Настоящая работа посвящена ГА с катионным замещением иона кальция на ион меди, как известно, обладающий антибактериальной активностью [1–4]. Количество вводимой в структуру ГА меди ограничивается вследствие возможности его разложения, а также вероятности цитотоксической реакции на клетки организма.

Целью настоящей работы явились синтез и изучение порошков и керамики медь-замещенных ГА с содержанием меди до 5 мол. % и исследование биологических свойств полученных материалов.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Медьсодержащие ГА (Cu-ГА) были синтезированы классическим методом осаждения из водных растворов нитрата кальция и гидрофосфата аммония [5], в качестве источника ионов Cu²⁺ использовали раствор нитрата меди. Расчет количества вводимых компонентов проводили согласно реакции (1), где х = 0, 0.1, 0.2 и 0.5; значение pH поддерживали на уровне 11 ± 0.5:

Продукт синтеза подвергали старению в маточном растворе в течение 24 ч; затем осадок фильтровали на воронке Бюхнера, промывали водой, переносили в спирт, дезагрегировали в нем и снова фильтровали на воронке Бюхнера. Осадок сушили при температуре 70–80°С и просеивали через сито с размером ячейки 100 мкм. Исследование полученных порошков проводили после термообработки на воздухе при 900, 1200, 1300 и 1400°С с выдержкой 1 ч.

Методом рентгенофазового анализа (РФА, Shimadzu XRD-6000) изучали фазовый состав материалов, рассчитывали параметры кристаллической решетки и размер областей когерентного рассеяния (ОКР). Содержание меди устанавливали методом атомно-эмиссионной спектрометрии c индуктивно-связанной плазмой (Jobin-Yvon Ultima 2). Удельную поверхность полученных порошков измеряли методом низкотемпературной адсорбции азота (БЭТ, Micromeritics, TriStar 3000). Методом ИК-спектрометрии (Nicolet Avatar-330) определяли наличие характерных функциональных групп. Спекание материалов изучали путем измерения непрерывной усадки на горизонтальном дилатометре (DIL 402C Netzsch) в атмосфере аргона при непрерывном повышении температуры до 1400°С с постоянной скоростью 10°С/мин. В качестве образцов использовали цилиндрические прессовки (давление 50 МПа) диаметром 5 и высотой 4 мм.

Керамику получали прессованием порошков в стальной пресс-форме с получением образцов в форме балочек с размерами 3 × 3 × 30 мм и последующим их обжигом в печи с SiC-нагревателями на воздухе со скоростью нагрева 5°С/мин и выдержкой в течение 1 ч при 1200, 1300 и 1400°С. По принятым стандартным методикам измеряли характеристики полученной керамики: усадку, плотность, пористость, прочность при изгибе; исследования микроструктуры проводили с использованием сканирующей электронной микроскопии (СЭМ, Carl Zeiss, LEO 1420).

Для биологических исследований in vitro изготавливали керамические пористые гранулы по технологии полимерных ячеистых реплик с последующим обжигом заготовок при 1300°С на воздухе. Цитосовместимость гранул Cu-ГА изучали на модели перевивной клеточной линии остеосаркомы человека MG-63 (Российская коллекция клеточных культур позвоночных, Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург). Проводили оценку острой цитотоксичности образцов экстракционным методом (ГОСТ 10993.5-99) и изучение матриксных свойств поверхности при совместном культивировании [6]. Жизнеспособность клеток на этапах культивирования определяли на сроках 1, 3, 7, 10 и 14 сут с помощью МТТ-теста. Материал считали цитосовместимым при отсутствии токсичности и наличии матриксных свойств поверхности: способности опытного образца материала поддерживать клеточную пролиферацию на уровне контрольных значений.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

По результатам химического анализа полученных порошков после их термообработки при 900°С содержание Cu соответствовало 0, 0.4, 0.8 и 2.4 мол.% – образцы 1, 2, 3, 4. Неполное вхождение расчетной меди в продукты синтеза, предположительно, связано с ее вымыванием в составе маточного раствора при фильтровании осадка. Удельная поверхность всех полученных порошков составила 100–110 м²/г, что соответствует среднему размеру частиц около 20 нм. В ИК-спектрах образцов всех составов присутствуют традиционные для ГА полосы поглощения. Следует отметить, что порошки после синтеза обладали окраской от белой (образец 1) до бледно-голубой (образцы 2 и 3) и голубой (образец 4). В результате термообработки материалы приобретали более насыщенную окраску: розовую (2), темно-розовую (3) и темно-малиновую (4). Известно, что наличие двухвалентной меди придает соединениям со структурой апатита интенсивный малиновый цвет, что делает перспективным использование Cu-ГА в качестве неорганических пигментов [7, 8]. При этом ионы меди в основном входят в гексагональные каналы апатита, замещая протоны, а не катионы кальция, с небольшим увеличением объема кристаллической решетки [7, 9].

Согласно данным РФА, кристаллической фазой всех синтезированных и термообработанных при 900°С образцов является ГА (рис. 1а). В образце 1 наряду с основной ГА-фазой присутствуют следы оксида кальция (5–10 мас. %); в образце 4 присутствует β-ТКФ (трикальцийфосфат гексагональной модификации) – около 10 мас. %. Повышение температуры обработки до 1200°C не привело к изменению фазового состава материалов, кроме образца 4, в котором весь β-ТКФ трансформировался в α-ТКФ (трикальцийфосфат моноклинной модификации) (рис. 1б). Термообработанные при 1300°С материалы по фазовому составу были идентичны обработанным при 1200°С. После прокаливания при 1400°С в образце 1 оксид кальция не обнаружен, однако присутствует тетракальциевый фосфат (Ca₄O(PO₄)₂, ТеКФ) – около 10 мас. %; появились следы α‑ТКФ в образцах 2 и 3 (до 5 мас. %), в образце 4 количество α-ТФК не изменилось; обнаружены следы β-ТКФ в образце 3 и до 10 мас. % в β-ТФК образце 4 (рис. 1в). Следует отметить, что α- и β-ТКФ являются двумя основными модификациями ТКФ, т.к. остаются стабильными при комнатной температуре. β-Фазу считают низкотемпературной, т.к. при нагревании выше 1180°С она начинает трансформироваться в высокотемпературную α-фазу, стабильную до 1430–1450°С [5, 8, 10]. В этой связи существование β-ТКФ после прокаливания при 1400°С свидетельствует о том, что медь входит в его решетку, предотвращая фазовый переход в α-фазу.

Рис. 1.

Дифрактограммы образцов 1–4, прокаленных при 900 (а), 1200 (б), 1400°C (в).

Поскольку ионный радиус меди (0.8 Å) меньше ионного радиуса кальция (1.06 Å) примерно на 25%, ожидалось, что при замещении размеры элементарной ячейки ГА будут уменьшаться. Однако при расчете параметров а и с кристаллических ячеек Cu-ГА, прокаленных при 900°С, прослеживается тенденция соответствия справочным данным для ГА с параметрами 9.418 и 6.884 Å (№ 090432) соответственно; только для образца 2 параметр а увеличен (9.425 Å) (табл. 1). Термообработка при 1200°С приводит к незначительному снижению параметра а образцов 1, 2 и 3 и увеличению для образца 4; параметр с изменяется в пределах ошибки расчетов. Прокаливание при 1400°С привело к увеличению параметров а и с. Размеры ОКР порошков увеличиваются примерно на 15–20% с ростом температуры обработки от 900 до 1200°С, от 3% (1) до 15% (4) с увеличением температуры от 1200 до 1400°С. В ряду увеличения концентрации меди величины ОКР колеблются в пределах ошибки измерений; наиболее интенсивный рост частиц с ростом температуры происходит для образца 4 (46 и 75 нм при 900 и 1400°С соответственно).

Полученные данные свидетельствуют о том, что при синтезе медь встраивается в структуру аморфных незакристаллизованных частиц ГА. Образование оксида кальция в чистом ГА и его отсутствие в Cu-ГА объясняется избытком ионов кальция в процессе осаждения в первом случае и его достаточным количеством во втором – при наличии ионов меди в исходном растворе. При термообработке в интервале 900–1300°С происходит кристаллизация и укрупнение частиц ГА, медь находится в решетке, возможно, с неравномерным распределением в объеме кристаллов. Термообработка при 1400°С приводит к частичному разложению ГА до α-ТКФ (до 5–10 мас. %) во всех образцах. Наличие моноклинной модификации ТКФ дает основание полагать, что медь осталась сконцентрированной в структуре ГА. В ином случае замещение приводит к наличию и термической стабильности при 1400°С низкотемпературной модификации β-ТКФ (4). Образование ТеКФ (CaO ⋅ Ca₃(PO₄)₂) в образце 1 связано с взаимодействием оксида кальция с образовавшейся фазой α-ТКФ при частичном разложении ГА.

В дальнейшем изучали спекание материалов путем измерения непрерывной усадки с постоянной скоростью 10°С/мин (рис. 2). До температуры около 700°С наблюдается небольшое увеличение усадки (2–3%), примерно одинаковое для всех образцов. Начало процесса активного спекания происходит при 770, 850, 920 и 970°С соответственно для образцов 1, 2, 3 и 4. При дальнейшем нагреве изменяется интенсивность спекания в следующем ряду: 1 > 2 > 3 > 4. Усадка при 1200°С составляет для указанных образцов 30, 27, 24 и 25%; при этом выше 1100°С ход кривых усадки образцов 3 и 4 примерно одинаков.

Рис. 2.

Кривые усадки образцов 1–4 при непрерывном подъеме температуры со скоростью 10°С/мин.

На рис. 3 представлены микрофотографии поверхности скола керамики Cu-ГА, полученной обжигом при 1200°С. Образец 1 состоит из однородных по размеру кристаллитов около 1 мкм с выраженной органенностью, угол встречи границ 120°. Поры преимущественно межкристаллические, наблюдаются в единичных количествах. Для керамических образцов 2, 3, 4 характерна заметная неравноосность кристаллов поверхности, вероятно, вследствие образования слоистости материала в процессах прессования. Кристаллы неоднородные по размеру и форме, размером от 0.5 до 2.0 мкм. Межкристаллических пор больше, и они более крупные, чем в образце 1. На рис. 4 представлены изображения поверхности скола керамических образцов 1 и 4, полученных обжигом при 1300 (рис. 4а, 4в) и 1400°С (рис. 4б, 4г). В образце 4 наблюдается более интенсивный рост кристаллов – от 2–5 при 1300°С до 10–15 мкм при 1400°С; присутствуют межкристаллические крупные поры – до 0.5–1.0 мкм.

Рис. 3.

Микрофотографии поверхности скола керамики, полученной при 1200°С: образцы 1 (а), 2 (б), 3 (в), 4 (г).

Рис. 4.

Микрофотографии поверхности скола керамических образцов 1 (а, б), 4 (в, г), полученных при 1300 (а, в), 1400°С (б, г).

Наибольшие показатели относительной плотности, прочности при изгибе и минимальные величины открытой пористости наблюдаются для материалов, обожженных при 1300°С (рис. 5). По-видимому, это связано с более полным спеканием при этой температуре с одновременным проявлением термической стабильности фазового состава материалов. При 1400°С образование дополнительных фаз во всех материалах (ТКФ в Cu-ГА и ТеКФ в ГА) приводит к увеличению пористости и снижению плотности образцов, что особенно заметно для образцов 1 и 4 с наиболее измененным фазовым составом. Наибольшая прочность при изгибе 46 МПа наблюдается на обожженном при 1300°С образце 4, для образца 3 величина составляет 40 МПа, для 2 – 25 МПа, для 1 – 21 МПа; величина открытой пористости для всех образцов находится в интервале от 0.5 до 1.5%, относительной плотности – от 95 до 99%.

Рис. 5.

Зависимости относительной плотности (а), открытой пористости (б), прочности при изгибе (в) образцов 1–4 от температуры обжига.

Таким образом, с увеличением количества меди в составе материала происходит замедление спекания, увеличение размера кристаллитов и их неоднородности по размерам, увеличение количества межкристаллитных пор. Это свидетельствует о снижении диффузионной подвижности в высокотемпературных процессах, возможно, вследствие сегрегации меди по границам зерен и наличия деформаций решетки за счет различия в радиусах ионов меди и кальция. На заключительной стадии спекания идут одновременно процессы перераспределения фаз и рост кристаллов.

Биологические исследования in vitro на керамических гранулах медьзамещенных ГА показали, что значения pH вытяжки из всех образцов находились в физиологических пределах (7.4–7.8). Установлено, что все материалы нетоксичны в отношении клеток линии остеосаркомы человека MG-63. Количество жизнеспособных клеток, культивированных на опытных образцах 1–3, к третьим суткам было больше, чем в контрольной культуре (клетки, культивированные на поверхности культурального пластика) (табл. 2). И, несмотря на неравномерность роста, к 14-м суткам наблюдения разница достигала 24–26%. Количество жизнеспособных клеток, культивированных на образце 4, на начальных сроках наблюдения было значительно меньше по сравнению с контрольным значением. Однако при равномерном росте к 14-м суткам на образцах наблюдалось на 45.5% больше жизнеспособных клеток, чем в контрольной культуре. Таким образом, опытные образцы поддерживают клеточную пролиферацию на более высоком уровне, чем в контрольном образце, что свидетельствует о выраженных матриксных свойствах поверхности, а также о цитосовместимости медьзамещенных ГА.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Осаждением из растворов получены порошки ГА с замещением иона кальция на ион меди в количествах 0, 0.4, 0.8 и 2.4 мол. %. Введение меди более 0.8 мол. % снижает термическую устойчивость ГА, приводя к образованию ТКФ моноклинной модификации при 1200°С, ТКФ гексагональной модификации при 1400°С с возможным концентрированием в ней меди. Введение меди в структуру приводит к снижению интенсивности спекания ГА наряду с ростом кристаллов и пористости.

Керамика из медьсодержащих ГА с наиболее оптимальными показателями свойств была получена обжигом при 1300°С. Прочность при изгибе таких материалов возрастает от 21 до 46 МПа в ряду увеличения количества меди.

Биологические исследования показали, что все медьзамещенные ГА цитосовместимы и проявляют выраженные матриксные свойства поверхности. Полученные результаты могут быть использованы в технологии биокерамики для костной хирургии.