Журнал неорганической химии, 2020, T. 65, № 10, стр. 1408-1415

ВВЕДЕНИЕ

Расширение списка материалов, отвечающих различным задачам современной медицины и максимально удовлетворяющих требованиям конкретного клинического случая, является одним из приоритетных направлений современного медицинского материаловедения. Исследования и разработка материалов для замены или регенерации костной ткани считаются наиболее перспективными. Такие материалы могут быть представлены биостеклами, биокерамикой, стеклокерамикой и композитами. Помимо биоактивных кальций-фосфатных материалов широкое распространение приобрели биоинертные керамические материалы, а также композиты, включающие биоинертную подложку и биоактивное покрытие. Легирование кальций-фосфатной биокерамики оксидами металлов, кремния или бора позволяет дополнительно придавать ей такие свойства, как антимикробная активность [1–3] и рентгеноконтрастность [4].

Оксид тантала используется как биоинертный компонент в составе покрытий титановых имплантов, а также в составе биостекол и биоцементов. В комбинации с фосфатами кальция оксид тантала улучшает прикрепление клеток к биоактивным материалам. В частности, в [5] отмечено, что присутствие Ta₂O₅ в составе композиционного покрытия на никелиде титана способствует большей адсорбции положительно заряженных белков из питательных сред, а более высокая плотность отрицательного заряда на поверхностях с покрытием гидроксиапатит-Ta₂O₅ способствует большей адсорбции ионов Ca²⁺ из SBF-раствора. Таким образом, комбинированное покрытие титановых имплантов благодаря слою из Ta₂O₅ обеспечивает хорошую устойчивость к коррозии, в то время как биологически активный наружный кальций-фосфатный слой дополнительно повышает биосовместимость in vitro [6]. Кроме того, оксид тантала в составе биоматериалов является рентгеноконтрастным агентом для высокоэффективной рентгеновской компьютерной томографии, что необходимо для визуализации процессов взаимодействия тканей организма с имплантами [7]. Препараты на основе наночастиц оксида тантала перспективны для локальной радиомодификации [8]. Установлено, что они образуют оболочки вокруг ядер клеток и повышают эффективность при лучевой терапии за счет генерации вторичных электронов [9]. Цементы, содержащие оксид тантала, показывают хорошую рентгеноконтрастность и биоактивность [10]. Пористая биоинертная керамика из оксида тантала может быть химически активирована щелочной гидротермальной обработкой. При этом на поверхности такой керамики в среде SBF образуются фосфаты кальция, что подтверждает биоактивность полученных образцов [11]. Обнаружено также, что введение оксида тантала в силикатную стеклокерамику, с одной стороны, улучшает ее механические свойства, а с другой – подавляет биоактивность [12]. Цикл работ [13–15] посвящен получению биоактивных стекол в системе SiO₂–ZnO–CaO–SrO–P₂O₅ путем замещения оксида цинка оксидом тантала. Авторы показали, что введение оксида тантала в сетку стекла делает его рентгеноконтрастным, а также приводит к изменению прочностных характеристик и растворимости. Полученные стекла обладают антибактериальной и противогрибковой активностью и не оказывают токсического действия по результатам теста на цитотоксичность.

Цель настоящей работы – разработка методов получения рентгеноконтрастной танталсодержащей стеклокерамики путем допирования стекла Bioglass 45S5, полученного из органических растворов, оценка биоактивности образцов in vitro, выяснение причин снижения биоактивности стекла с увеличением содержания оксида тантала.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

В работе использовали олеат натрия (C₁₈H₃₃O₂Na, 98%), олеат кальция (C₃₆H₆₆O₄Ca, 98%), скипидар (сульфатный очищенный для органического синтеза), тетраэтоксисилан (C₈H₂₀O₄Si, 99.5%), трибутилфосфат (C₁₂H₂₇O₄P, 99%), бензол (C₆H₆, 99.8%), окись тантала (Ta₂O₅, 99%). Органический раствор для стекла Bioglass 45S5 получали следующим образом. В раствор, содержащий олеат натрия в скипидаре и тетраэтоксисилан, добавляли раствор олеата кальция в скипидаре с бензолом и трибутилфосфатом.

Для допирования биостекла танталом использовали три различных метода.

I. В приготовленный органический раствор, содержащий кальций, кремний, натрий и фосфор, добавляли рассчитанные количества экстракта тантала. Экстракцию тантала проводили следующим образом. Исходную водную фазу готовили сплавлением 0.13 г Ta₂O₅ и 6 г K₂S₂O₇ при 800°С с последующим выщелачиванием сплава 6%-ным раствором H₂C₂O₄ · 2H₂O при нагревании. Экстрагент – 20%-ный бензольный раствор три-н-октиламина, предварительно обработанный 10%-ным водным раствором H₂SO₄. Полученный экстракт содержал 1.7 г/л тантала. После смешивания всех компонентов проводили отгонку растворителя при температуре 150–200°С. Полученную массу (прекурсор) переносили в тигель и подвергали пиролизу, нагревая в муфельной печи до 1300°С со скоростью 7 град/мин, затем выдерживали при этой температуре в течение 20 мин. После этого образец переносили в камеру отжига с температурой 520–550°С, выдерживали при этой температуре 2 ч, а затем охлаждали до комнатной температуры. Этим способом получены стекла, содержащие 1–4 мас. % Ta₂O₅.

II. В приготовленный органический раствор, содержащий кальций, кремний, натрий и фосфор, после частичной отгонки растворителя добавляли оксид тантала в необходимых количествах. Принцип получения танталсодержащего стекла – отгонка растворителя, пиролиз, охлаждение – аналогичен способу I. Получены стекла, содержащие 5–40 мас. % Ta₂O₅.

III. Из органического раствора при 1300°С получено биостекло Bioglass 45S5. Далее готовили смеси, содержащие рассчитанные количества стекла и оксида тантала, тщательно измельчали их и нагревали до 1300°С со скоростью 7 град/мин с выдержкой при этой температуре в течение 20 мин. Получены стекла, содержащие 5–40 мас. % Ta₂O₅. Содержание компонентов в образцах в пересчете на их оксиды представлено в табл. 1.

Рентгенофазовый анализ (РФА) образцов выполняли на дифрактометре D8 Advance (Bruker AXS, Германия) в CuK_α-излучении с графитовым монохроматором. Кристаллические фазы образующихся на разных стадиях синтеза стекол определяли с помощью программы поиска EVA по базе порошковых данных PDF-2. Для исследования качественного и количественного элементарного состава, а также морфологии образцов использовали метод растровой электронной микроскопии (РЭМ). РЭМ-изображения образцов и энергодисперсионные спектры получали на электронном сканирующем микроскопе S5500 Hitachi (Япония). Спектры ЯМР и MAS ЯМР ³¹P регистрировали на спектрометре Avance AV-300 фирмы Bruker (Германия) при температуре 305 K. Частота вращения образца в MAS-экспериментах составляла 7 кГц. Измерения химических сдвигов (ХС) резонансных линий проводили методом замещения с использованием в качестве стандарта 85%-ной H₃PO₄ (³¹P). Ошибка измерения ХС составляла 1.0 м.д. Разложение спектра на компоненты гауссовой формы проводили в самостоятельно разработанной программе с использованием модифицированного метода минимизации Ньютона. Ошибка подгонки кривой не превышала 8% от ее площади.

Биоактивность полученных образцов оценивали in vitro с помощью модельной среды – SBF-раствора. Процедура приготовления SBF-раствора аналогична методу, предложенному в работе [16]. К модельному раствору, полученному растворением в дистиллированной воде соответствующих реагентов (табл. 2), при температуре 37°С приливали раствор HCl до pH 7.4. Раствор по минеральному составу идентичен плазме крови. Образцы выдерживали в растворе в течение 14 и 25 сут в термостате при температуре 37°С. Раствор обновляли каждые 48 ч.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Использование неводных сред позволяет избегать дробной кристаллизации при упаривании растворов и обеспечивает заданный состав продуктов, в частности биологически активных материалов [17, 18]. Для получения биостекол нами ранее разработан метод пиролиза органических растворов [17]. В качестве растворимых в органических растворителях компонентов стекла были использованы тетраэтоксисилан, трибутилфосфат и олеаты натрия и кальция. Отмечен ряд преимуществ получения биостекол этим методом. Он позволяет вводить в стекло допирующие компоненты, изменяющие свойства стекол. Для придания биостеклам рентгеноконтрастных свойств в состав стекла вводят оксиды тяжелых металлов. Их удобно вводить в виде экстрактов в органических растворителях. К сожалению, экстракция тантала из оксалатно-сульфатных растворов не позволяет получать высококонцентрированные экстракты. Это ограничивает возможность получения стекла с содержанием Ta₂O₅ более 4 мас. %. Для получения биостекол с высоким содержанием тантала мы вводили оксид тантала в прекурсор или готовое стекло.

Ранее [17] нами показано, что образцы с содержанием Ta₂O₅ до 4 мас. % биоактивны и рентгеноконтрастны. Согласно [12], механические и физические свойства стекла могут быть улучшены добавлением Ta₂O₅, но при этом снижается биологическая активность материала. Сделан вывод, что Ta₂O₅ подавляет образование апатита – при добавлении его в образец в количестве 3 мол. % (или 18 мас. %) апатитовый слой не наблюдается при погружении образца в SBF-раствор даже в течение 30 сут. Для выяснения причины подавления биоактивности стекол получены образцы с содержанием оксида тантала до 40 мас. % и исследовано их поведение в SBF-растворе.

Данные РФА показывают, что пиролиз прекурсора после отгонки растворителя для состава, соответствующего Bioglass 45S5, при 600–1000°С приводит к образованию смеси рентгеноаморфной фазы с кристаллическими фазами различных силикатов натрия и кальция (табл. 3). В отличие от данных, полученных в работах [2, 19], образование гидроксиапатита или оксиапатита в этом температурном интервале не наблюдается. При 1300°С образец становится рентгеноаморфным. На дифрактограммах образцов, содержащих оксид тантала, при температурах 600–1000°С помимо указанных фаз обнаруживается кристаллическая фаза СаTa₂O₆, но отсутствуют кристаллические фазы фосфатов натрия и кальция (табл. 3, рис. 1). При 1300°С образцы, содержащие <20% Ta₂O₅, становятся рентгеноаморфными. В образцах с более высоким содержанием Ta₂O₅ сохраняются кристаллы СаTa₂O₆, что, очевидно, связано с ограниченной растворимостью танталата кальция в стекле. Разницы в дифрактограммах образцов с одинаковым содержанием оксида тантала, полученных II и III способами, не отмечено.

Рис. 1.

Дифрактограммы продуктов обжига прекурсора при 1300°С, содержащих 5 (1), 10 (2), 20 (3) и 30 мас. % Ta₂O₅ (4).

Образцы, содержащие до 10% Ta₂O₅, прозрачны и однородны (рис. 2а). Образцы с 20%-ным содержанием оксида тантала прозрачны, но выявлено присутствие отдельных кристалов СаTa₂O₆. Образцы с более высоким содержанием Ta₂O₅ непрозрачны, состоят из кристаллической фазы, равномерно распределенной в стеклофазе (рис. 2б). Тонкозернистая структура в полученных ситаллах характеризуется наличием кристаллов кубической формы с длиной ребра 0.5–1 мкм. Аналогичный процесс кристаллизации при допировании стекла Bioglass 45S5 оксидом вольфрама показан в работе [4]. Установлено, что образование вольфраматов кальция и натрия начинается при содержании в образце 9 мас. % W (или 11 мас. % WO₃).

Рис. 2.

Микрофотографии стекла, содержащего 10 (а) и 40 мас. % Ta₂O₅ (б).

С помощью модельной среды оценивали биоактивность образцов, содержащих от 1 до 40 мас. % оксида тантала. Образец сравнения – стекло, содержащее 0% Ta₂O₅, полученное из органических растворов (Bioglass 45S5). В энергодисперсионном спектре стекла Bioglass 45S5 содержатся все компоненты: кремний, кислород, натрий, кальций и фосфор (рис. 3а). Энергодисперсионный спектр этого образца после выдержки в модельной среде состоит преимущественно из кальция и фосфора (рис. 3б). Содержание этих элементов по сравнению с кремнием и натрием на поверхности стекла возросло, что свидетельствует об образовании кальций-фосфатного слоя.

Рис. 3.

Энергодисперсионный спектр биостекла 45S5 (а) и покрытия на нем (б).

После пребывания образцов в модельном растворе в течение 14 сут обнаружено, что на поверхности образца стекла 45S5 образовалось плотное покрытие, имеющее вид растрескавшейся корки (рис. 4а). На поверхности образцов, содержащих 1–5% Ta₂O₅, образовались неплотные покрытия, имеющие вид островков разного размера (рис. 4б). Энергодисперсионные спектры покрытий соответствуют фосфатам кальция. На остальных образцах кальций-фосфатного покрытия не обнаружено. Установлено, что чем больше содержание оксида тантала в образце, тем меньшую площадь поверхности образца занимает кальций-фосфатное покрытие при прочих равных условиях.

Рис. 4.

Микрофотографии стекла 45S5 (а) и стекла, содержащего 3 мас. % Ta₂O₅ (б), после пребывания в SBF-растворе в течение 14 сут.

После пребывания в модельном растворе образцов с содержанием 10–40% Ta₂O₅ в течение 25 сут на поверхности образца, содержащего 10% Ta₂O₅, наблюдаются отдельные кальций-фосфатные частицы размером ∼1 мкм (рис. 5а). Образец, содержащий 20% Ta₂O₅, не имеет кальций-фосфатного покрытия. Полученные результаты подтверждают, что биоактивность образцов снижается с увеличением количества Ta₂O₅ в составе стекла 45S5. Образцы, содержащие 30 и 40 мас. % Ta₂O₅, после пребывания в SBF-растворе в течение 25 сут значительно изменились. Стеклянная фаза на поверхности образца растворилась, остались кристаллы CaTa₂O₆ (рис. 5б).

Рис. 5.

Микрофотография стекла после пребывания в SBF-растворе в течение 25 сут образцов, содержащих 10 (а) и 40 мас. % Ta₂O₅ (б).

Принято считать [20], что биологическая активность стекла 45S5 обусловлена гидролизом силикатной сетки с появлением на поверхности стекла силанольных групп (Si–OH), которые сорбируют ионы кальция из SBF-раствора с последующим формированием слоя гидроксиапатита. Очевидно, что биоактивность не может быть обусловлена только сорбционными свойствами Si–OH-групп, иначе максимальной биоактивностью обладал бы силикагель с высокоразвитой поверхностью. В процессе образования слоя гидроксиапатита на поверхности стекла должны принимать участие катионы кальция и анионы ${\text{РО}}_{{\text{4}}}^{{{\text{3}}--}},$ которые выщелачиваются из стекла при растворении фосфатно-силикатной сетки и создают условия для перенасыщения раствора фосфатами кальция в приповерхностном слое. Одной из возможных причин подавления биоактивности стекол с ростом содержания Ta₂O₅ может быть замещение Р₂О₅ и удаление в процессе варки из состава стекол фосфора в виде фосфорного ангидрида, способного возгоняться при достаточно низких температурах. Для проверки этого предположения нами были исследованы спектры ЯМР ³¹Р.

Спектры ЯМР ВМУ ³¹P исследованных стекол представляют собой асимметричные двухкомпонентные линии. Соотношение интегральных интенсивностей компонент, их химические сдвиги и общая интенсивность сигнала ЯМР различаются для разных образцов. Как известно, ХС сигналов в спектрах ЯМР ³¹P фосфатных стекол зависят от степени деполимеризации фосфатных групп [21].

Как видно из рис. 6, как в спектре MAS ЯМР ³¹P исходного стекла, так и в спектре стекла с танталом наблюдается по два сигнала, соответствующих полностью деполимеризованным группировкам ${\text{РО}}_{{\text{4}}}^{{{\text{3}}--}}$ (P⁽⁰⁾, сигналы с большими значениями сдвига) и группировкам P⁽¹⁾, сохраняющим связь P–O–P и входящим в состав фосфатной стекольной сетки. Относительные интегральные интенсивности указанных сигналов в этих стеклах (рис. 6, табл. 4) практически совпадают. Смещение сигнала ЯМР в слабое магнитное поле для стекла, содержащего тантал, вероятно, обусловлено изменением степени полимеризации фосфатных групп. Таким образом, удаление фосфора из стекла с ростом концентрации тантала не подтверждается данными ЯМР и не может являться причиной подавления биоактивности.

Рис. 6.

Спектры ЯМР ВМУ ³¹P исследованных стекол: биостекло 45S5 + 40% Ta₂O₅ (1), биостекло 45S5 (2), прекурсор 45S5 + 40%Ta₂O₅ (3).

Еще одной причиной снижения биологической активности стекол с ростом концентрации тантала может быть выведение из стекла кальция. Как показывают результаты РФА, в процессе замещения SiO₂ на Ta₂O₅ в стекле происходит образование кристаллов CaTa₂O₆. Процесс образования кристаллической фазы можно представить схемой:

{(SiO₂)_{1 –x}, Na₂O, CaO, P₂O₅} + xTa₂O₅ → → {(SiO₂)_{1 –x}, Na₂O, P₂O₅} + хCaTa₂O₆.

В предельном случае при х → 1 может получиться образец, содержащий фазы танталата кальция и растворимые в воде фосфаты и силикаты натрия.

Как следует из данных, приведенных в табл. 1, с ростом содержания оксида тантала в образцах снижается содержание кальция. Необходимо отметить, что в данном случае это общее содержание кальция, присутствующего как в сетке стекла, так и в составе кристаллов CaTa₂O₆. Содержание кальция только в стекле можно определить с помощью анализа энергодисперсионных спектров образцов. Как видно из рис. 7, при увеличении содержания тантала происходит постепенное снижение концентрации кальция на поверхности стекла за счет выведения катионов кальция из сетки стекла в кристаллическую фазу. В результате этого у образцов с содержанием более 30% Ta₂O₅ стеклофаза становится растворимой в SBF-растворе (рис. 5б). Таким образом, одной из основных причин подавления биоактивности стекол с увеличением содержания Ta₂O₅ является постепенное снижение концентрации кальция в стекле за счет образования нерастворимых кристаллов CaTa₂O₆, в результате чего в поверхностном слое не происходит пересыщения раствора SBF катионами кальция и кальций-фосфатный слой перестает осаждаться на поверхности образца. Образцы, содержащие в составе до 10 мас. % Ta₂O₅, являются одновременно и рентгеноконтрастными, и биоактивными, а значит, могут применяться в качестве материалов для восстановительной хирургии.

Рис. 7.

Содержание кальция в образцах в зависимости от содержания оксида тантала: общее содержание кальция (1), содержание кальция на поверхности стекла по данным РЭМ (2).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На основе биостекла 45S5 получены и охарактеризованы методами ЯМР на ядрах ³¹Р, РФА и РЭМ рентгеноконтрастные стекла и стеклокерамика, содержащие 1–40 мас. % Ta₂O₅. Проведена in vitro оценка биоактивности полученных образцов с помощью модельной среды (SBF-раствора). Установлен механизм подавления биологической активности стекла с увеличением содержания оксида тантала. Основной причиной подавления биоактивности стекол названо снижение концентрации кальция в стекле за счет образования нерастворимых кристаллов CaTa₂O₆.

Образцы, содержащие до 10 мас. % Ta₂O₅, представляют перспективу для современной медицины в качестве материалов для восстановления костной ткани. Рентгеноконтрастное вещество в составе биоматериала дает возможность контролировать процесс регенерации костной ткани.