Журнал неорганической химии, 2021, T. 66, № 6, стр. 822-829

ВВЕДЕНИЕ

Материалы на основе оксидных соединений гафния находят широкое применение в различных отраслях промышленности, включая микроэлектронику, производство специальных стекол и огнеупоров, стержней для ядерных реакторов [1–3]. Широкий спектр областей промышленного применения таких соединений основан на их уникальных физических и химических свойствах, включающих в себя термическую устойчивость, высокую диэлектрическую проницаемость и высокое сечение захвата тепловых нейтронов [4, 5].

С недавних пор соединения гафния используются в ядерной медицине [6]. В частности, нанокристаллический диоксид гафния рассматривают в качестве перспективного радиосенсибилизатора в лучевой терапии онкологических заболеваний, поскольку он обладает комплексом необходимых свойств, включая эффективное поглощение рентгеновского и гамма-излучения, а также относительную биоинертность [7]. Основной принцип использования радиосенсибилизаторов заключается в их способности накапливаться в раковых клетках, а во время облучения эффективно поглощать ионизирующее излучение, вызывая локальные повреждения клеточных структур [8]. Благодаря этому удается снизить дозу ионизирующего излучения и локализовать его эффект в зоне опухолевого роста.

На сегодняшний день предложен ряд эффективных методов синтеза нанокристаллического диоксида гафния [9–13]. Отметим, что биомедицинское применение материалов на основе соединений гафния требует получения устойчивых водных золей, которые обеспечивают возможность прецизионного дозирования препарата, а также его эффективного накопления в зоне опухолевого роста и контроля локализации с помощью современных методов визуализации [14].

В рамках настоящей работы был создан новый биосовместимый материал на основе диоксида гафния, характеризующийся выраженными люминесцентными свойствами, проведено исследование его цитотоксичности и радиосенсибилизирующих свойств на культурах раковых клеток линий U-251, MCF-7 и MNNG/Hos, а также мезенхимальных стволовых клеток человека in vitro.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Синтез проводили в два этапа, которые включали получение гидратированного диоксида гафния и его последующую гидротермальную обработку в присутствии цитрата аммония. Гидратированный диоксид гафния получали добавлением аммиака (3 М) к водному раствору хлорида гафния (0.1 М) при постоянном перемешивании до достижения pH 9. Полученный осадок HfO₂ ⋅ xH₂O тщательно промывали дистилированной водой с промежуточным центрифугированием (~20 000g), полученную пасту не высушивали. Навески пасты HfO₂ · xH₂O (0.40 г в пересчете на безводный оксид) смешивали с раствором цитрата аммония (0.19 г) и добавляли аммиак таким образом, чтобы объем полученной суспензии составлял 8 мл, а pH суспензии – 6 или 10. Полученные суспензии помещали в стальные автоклавы емкостью 12 мл (степень заполнения ~67%) и проводили гидротермальную обработку при 160°С в течение 24 ч.

УФ-видимые спектры поглощения регистрировали на спектрофотометре СФ-2000 (ОКБ “Спектр”, Россия) с использованием дейтериевой лампы в диапазоне длин волн от 200 до 500 нм с шагом 0.1 нм, ширина оптической щели составляла 0.2 нм. В некоторых случаях перед проведением анализа образцы разбавляли дистиллированной водой.

Спектры люминесценции регистрировали с помощью люминесцентного спектрометра Perkin Elmer LS55 и модульной оптической системы Ocean Optics, включающей в себя спектрометр QE 65000. Спектры испускания регистрировали в диапазоне 420–550 нм, спектры возбуждения – в диапазоне 230–350 нм при комнатной температуре.

ИК-спектры нарушенного полного внутреннего отражения регистрировали в области 400–4000 см^–1 на ИК-спектрометре Bruker Alpha.

Рентгенофазовый анализ порошков, полученных высушиванием коллоидных растворов при 50°С, проводили с использованием дифрактометра Bruker D8 Advance (CuK_α-излучение, θ–2θ-геометрия) в диапазоне углов 10°–80° 2θ с шагом 0.02° и временем накопления сигнала не менее 0.3 с на точку.

Микроструктуру образцов изучали методом просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) на электронном микроскопе Leo912 AB Omega при ускоряющем напряжении 100 кВ.

Анализ распределения частиц по размерам в золях проводили методом динамического рассеяния света (ДРС) с помощью лазерного анализатора Photocor Complex, в качестве источника света использовали гелий-неоновый лазер (длина волны излучения 657.8 нм). Измерения проводили в одноразовых кюветах, объем измеряемой пробы составлял 3 мл.

Анализ цитотоксичности и радиосенсибилизирующих свойств золей в условиях воздействия рентгеновского излучения проводили с использованием МТТ-теста на четырех клеточных культурах человека: мезенхимальных стволовых клетках (нормальные клетки, использовали в качестве контроля), аденокарциномы молочной железы линии MCF-7, глиобластомы линии U-251, остеосаркомы линии MNNG/Hos. Клетки высевали в плотности 30 тыс/см² в культуральную среду ДМЕМ/Ф12, содержащую 10% эмбриональной телячьей сыворотки и комплекса антибиотиков (пенициллин и стрептомицин 5000 ед.) и культивировали в условиях СО₂ инкубатора при 5% СО₂ и температуре 37°С. Через 12 ч после посева среду заменяли на свежую, содержащую анализируемые коллоидные растворы различной концентрации (1.25–15 мкг/мл в пересчете на безводный диоксид гафния), далее после 6 ч культивирования клетки подвергали воздействию рентгеновского излучения в дозе 15 Гр с использованием медицинской терапевтической установки РУТ-15. Через 96 ч после облучения жизнеспособность клеточных культур определяли с помощью стандартного МТТ-теста.

Анализ внутриклеточной локализации и механизма проникновения наночастиц диоксида гафния выполняли методом конфокальной флуоресцентной микроскопии на микроскопе Zeiss Cell Observer A1, используя функцию Z-stack.

Статистическая обработка данных была проведена с использованием GraphPad 8.5 и Origin 7.0. Для выявления достоверных различий применяли t-критерий Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Гидротермальный синтез коллоидных растворов проводили при 160°С в течение суток, используя в качестве исходных соединений гидратированный диоксид гафния и цитрат аммония. Были получены коллоидные растворы HfO₂CitNH₄ (гидротермальная обработка суспензии при pH 6) и HfO₂CitNH₄(NH₃) (гидротермальная обработка суспензии при pH 10). Дополнительно гидротермальной обработкой были получены коллоидные растворы HfO₂CitNH₄×5 и HfO₂CitNH₄×10, для синтеза которых в исходные суспензии HfO₂ ⋅ xH₂O добавляли увеличенное в 5 или 10 раз количество цитрата аммония, а обработку проводили при pH 6. Концентрация диоксида гафния во всех полученных коллоидных растворах, определенная гравиметрическим методом, составляла ~7 г/л.

Согласно данным рентгенофазового анализа, наночастицы в полученных золях являются рентгеноаморфными, на дифрактограммах наблюдаются гало с максимумами при ~30° и ~55° 2θ, что может свидетельствовать о наличии в полученном материале аморфного гидратированного диоксида гафния. Известно, что в гидротермальных условиях скорость кристаллизации диоксида гафния является достаточно низкой даже при повышенных температурах (до 250°С) [10].

Отличительной особенностью всех полученных коллоидных растворов является их интенсивная синяя люминесценция при облучении ультрафиолетовым светом. Наиболее вероятно, что в ходе гидротермальной обработки гидратированного диоксида гафния в присутствии цитрата аммония происходит разложение последнего с формированием производных цитразиновой кислоты [15], в том числе так называемых органических квантовых точек. Органические квантовые точки были ранее получены нами [16] путем термолиза лимонной кислоты в присутствии мочевины. Гидротермальная обработка солей лимонной кислоты в относительно мягких условиях (160–180°С) также приводит к формированию органических квантовых точек, причем полученные материалы, как правило, характеризуются высокой стабильностью оптических свойств и достаточно высоким квантовым выходом (>20%) [17, 18].

На рис. 1а приведены спектры поглощения золей HfO₂CitNH₄ и HfO₂CitNH₄(NH₃), из которых видно, что максимум поглощения в УФ-области соответствует 345 нм, что хорошо согласуется с оптическими характеристиками органических квантовых точек [16]. Эта длина волны была выбрана для анализа люминесцентных характеристик коллоидных растворов. На рис. 1б представлены спектры люминесценции золей HfO₂CitNH₄ и HfO₂CitNH₄(NH₃), характеризующиеся широкой полосой испускания с максимумом около 450 нм (2.8 эВ), что полностью соответствует люминесцентным характеристикам органических квантовых точек [16]. Данные ДРС полученных золей (табл. 1) указывают на наличие в них двух фракций частиц с размерами порядка 10 и 100 нм, которые, вероятнее всего, соответствуют индивидуальным частицам и их агрегатам. Отметим, что данные ДРС удовлетворительно коррелируют с результатами ПЭМ образцов.

Рис. 1.

УФ-видимые спектры поглощения золей, синтезированных при различных значениях рН (а) и спектры их фотолюминесценции (б): 1 – HfO₂CitNH₄, 2 – HfO₂CitNH₄(NH₃).

Важным свойством полученных коллоидных растворов является сохранение их оптических характеристик после высушивания (при 50°С в течение суток) и последующего редиспергирования в дистиллированной воде. В частности, это иллюстрируют приведенные на рис. 2 спектры поглощения и люминесценции золя HfO₂CitNH₄×10 до и после редиспергирования, из которых следует, что положение максимумов поглощения и люминесценции, а также форма соответствующих максимумов в результате редиспергирования не изменяются. Параметры распределения частиц по размерам в исходном и редиспергированном золе, определенные по данным динамического рассеяния света, также остаются практически неизменными (табл. 2). Из результатов, приведенных в табл. 2, также следует, что увеличение концентрации цитрата аммония в исходной реакционной смеси в 10 раз приводит к увеличению гидродинамического радиуса коллоидных частиц в получаемых золях примерно в 3 раза.

Рис. 2.

Спектры фотолюминесценции золя HfO₂CitNH₄×10 до (1) и после (2) редиспергирования (а), соответствующие УФ-видимые спектры поглощения (б). Для сравнения приведен спектр фотолюминесценции золя HfO₂CitNH₄ (3).

Из рис. 2 также следует, что интенсивность люминесценции золя HfO₂CitNH₄ существенно ниже, чем аналогичная характеристика золя HfO₂CitNH₄×10 при той же концентрации по гафнию. На рис. 3 приведены спектры возбуждения и испускания золей HfO₂CitNH₄, HfO₂CitNH₄×5, HfO₂CitNH₄×10, характеризующихся одинаковой концентрацией оксида гафния. Спектры возбуждения, зарегистрированные для соответствующих полос люминесценции, существенно не различаются для всех исследованных золей и характеризуются одной интенсивной полосой при 450 нм. Из приведенных данных следует, что интенсивность люминесценции коллоидных растворов практически линейно зависит от концентрации цитрата аммония в исходной реакционной смеси. Это, очевидно, обусловлено возрастанием концентрации органических квантовых точек, образующихся в гидротермальных условиях.

Рис. 3.

Спектры возбуждения (а) и испускания (б) золей, полученных при различный концентрации цитрата аммония в исходной реакционной смеси: HfO₂CitNH₄ (1), HfO₂CitNH₄×5 (2), HfO₂CitNH₄×10 (3). Справа приведены соответствующие зависимости интенсивности возбуждения и испускания от относительного количества цитрата аммония в исходной реакционной смеси.

На рис. 4 приведены данные ИК-спектроскопии полученных образцов. В ИК-спектре образца диоксида гафния, полученного в гидротермальных условиях при 160°С в течение 1 сут (контрольный образец, синтезирован по идентичной методике в отсутствие цитрата аммония при pH 6), наблюдаются полосы поглощения, соответствующие литературным данным для кристаллического гидратированного диоксида гафния [19]. Две низкочастотные полосы с максимумами при 763 и 652 см^–1 соответствуют модам валентных колебаний HfO₂ (моноклинная модификация) [20]. В области 3000–3500 см^–1 наблюдается малоинтенсивная широкая полоса, характерная для молекул воды и гидроксогрупп.

Рис. 4.

ИК-спектры образцов HfO₂ ⋅ xH₂O (а), цитрата аммония (б) и HfO₂CitNH₄ (в).

В ИК-спектре образца HfO₂CitNH₄ положение полос, отвечающих валентным колебаниям Hf–O, несколько смещено относительно ИК-спектра образца гидратированного диоксида гафния (779 и 681 см^–1), что указывает на присутствие оксокомплексов гафния в анализируемом материале. Для ИК-спектра образца HfO₂CitNH₄ также характерно меньшее расщепление полос валентных колебаний –COO (1574 и 1351 см^–1) по сравнению с цитратом аммония (1595 и 1330 см^–1), что указывает на образование бидентатных или мостиковых карбоксильных комплексов гафния. В ИК-спектре образца HfO₂CitNH₄ также присутствует широкая полоса валентных колебаний гидроксогрупп, но на нее накладываются полосы валентных (2500–3300 см^–1) и деформационных (1350–1500 см^–1) колебаний N–H-групп, характерных для иона аммония. Наиболее вероятно, что в составе органических продуктов поликонденсации лимонной кислоты часть карбоксильных групп выступает в качестве лигандов по отношению к металлоцентрам (гафнию), а часть остается в свободном виде, образуя ионные связи с катионами аммония.

Таким образом, совокупность полученных данных указывает, что в результате гидротермальной обработки гидратированного диоксида гафния в присутствии цитрата аммония происходит образование оксосоединений гафния, координационно связанных с органическими квантовыми точками. Известно, что материалы на основе органических квантовых точек обладают не только выраженными люминесцентными свойствами, но и характеризуются высокой биосовместимостью, низкой токсичностью, эффективным эндоцитозом клетками эукариот и стабильностью физико-химических характеристик [16]. В связи с этим нами была проанализирована цитотоксичность полученных материалов (на примере образца HfO₂CitNH₄) на различных культурах клеток in vitro. Для оценки внутриклеточной локализации наночастиц был использован метод конфокальной микроскопии в режиме Z-stack, который позволяет анализировать локализацию наночастиц непосредственно в цитоплазме, а не на поверхности клетки. Согласно полученным данным, наночастицы эффективно поглощались клетками аденокарциномы молочной железы линии MCF-7, глиобластомы линии U-251 и остеосаркомы линии MNNG/Hos, что подтверждалось яркой флуоресценцией цитоплазмы уже через 2 ч после внесения наночастиц. Эндоцитоз наночастиц мезенхимальными стволовыми клетками происходил в незначительной степени (<20%) в сравнении с раковыми культурами U-251, MNNG/Hos и MCF-7, что подтверждалось методом конфокальной флуоресцентной микроскопии (рис. 5).

Рис. 5.

Поглощение наночастиц золя HfO₂CitNH₄ клетками культуры мезенхимальных стволовых клеток, аденокарциномы молочной железы линии MCF-7, глиобластомы линии U-251, остеосаркомы линии MNNG/Hos через 2 ч после внесения. Данные представлены как средняя интенсивность флуоресценции цитоплазмы клеток через 24 ч после инкубации. n = = 15, *** p ≤ 0.001, t-test.

Анализ цитотоксичности и радиосенсибилизирующих свойств наночастиц аморфного диоксида гафния, модифицированного органическими квантовыми точками, проводили в концентрациях от 1.25 до 15 мкг/мл (рис. 6). Облучение клеточных культур осуществляли рентгеновским излучением в дозе 15 Гр, которая была заранее подобрана [21] с учетом плотности посева клеточной культуры и времени анализа жизнеспособности после облучения, с целью выявления величины ЛД₅₀. Облучение достоверно снижало жизнеспособность клеточных культур раковых линий MCF-7 и U-251, в то время как культура клеток остеосаркомы MNNG/Hos не показала снижения жизнеспособности. Предварительная обработка наночастицами культур клеток MCF-7 и U-251 не показала достоверного снижения их жизнеспособности, однако при сочетанном воздействии наночастиц в концентрациях выше 2.5 мг/мл и рентгеновского излучения в дозе 15 Гр происходило снижение жизнеспособности более чем на 30%. Мезенхимальные стволовые клетки человека лишь незначительно снижали свою жизнеспособность (не более чем на 10%) при внесении наночастиц в высоких концентрациях (свыше 10 мг/мл), но при этом сочетанное воздействие наночастиц и рентгеновского облучения не приводило к гибели клеток. Такой различный отклик клеточных культур, по всей видимости, связан с различной эффективностью интернализации наночастиц диоксида гафния в цитоплазму нормальных и раковых клеток. При этом стоит отметить, что клетки остеосаркомы проявляют более низкую радиочувствительность в присутствии наночастиц диоксида гафния при относительно высокой эффективности их эндоцитоза в сравнении с клетками аденокарциномы и глиобластомы человека, что требует дальнейшего детального изучения молекулярных механизмов проникновения и процессинга наночастиц аморфного диоксида гафния, модифицированного органическими квантовыми точками, для данного типа клеток.

Рис. 6.

Жизнеспособность культуры мезенхимальных стволовых клеток (нормальные клетки в качестве контроля), культуры аденокарциномы молочной железы линии MCF-7, культуры глиобластомы линии U-251, культуры остеосаркомы линии MNNG/Hos в присутствии золя HfO₂CitNH₄ через 96 ч после облучения рентгеновским излучением в дозе 15 Гр.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Предложен метод получения водных золей аморфного диоксида гафния, модифицированного органическими квантовыми точками. Синтезированные золи с концентрацией ~7 г/л в пересчете на диоксид гафния демонстрируют интенсивную люминесценцию (450 нм при возбуждении УФ-излучением с длиной волны 345 нм), при этом оптические характеристики золей не изменяются при их высушивании и последующем редиспергировании в воде. Показан селективный эндоцитоз наночастиц раковыми клетками глиобластомы, остеосаркомы и аденокарциномы человека по сравнению с мезенхимальными стволовыми клетками человека. Показан селективный радиосенсибилизирующий эффект полученных наночастиц по отношению к культурам глиобластомы и аденокарциномы человека.

Таким образом, предложен метод получения гибридного материала на основе аморфного диоксида гафния, модифицированного органическими квантовыми точками, проявляющего избирательный цитотоксический эффект в отношении некоторых линий раковых клеток при совместном действии рентгеновского излучения.