Журнал неорганической химии, 2022, T. 67, № 11, стр. 1567-1574

ВВЕДЕНИЕ

Порфирины являются особым классом гетероциклических азотсодержащих соединений, которые в настоящее время нашли применение в ряде таких областей, как катализ, полупроводники, материалы для электроники, медицина [1–5]. Особое значение приобрело использование порфиринов в качестве фотосенсибилизаторов (ФС) для фотодинамической терапии (ФДТ) злокачественных новообразований и фотодинамической инактивации различных микроорганизмов [6, 7]. Молекулярный механизм фотодинамического действия основан на образовании активных форм кислорода фотосенсибилизатором при взаимодействии с источником света и кислородом, растворенным в клетках [8, 9]. В последнее десятилетие интерес к антимикробной фотодинамической терапии как к методу лечения инфекционных заболеваний значительно увеличился. Это вызвано тем, что широкое применение антибиотиков привело к развитию устойчивости патогенных организмов к противомикробным препаратам, что представляет серьезную проблему для общественного здравоохранения [10, 11].

ФС на основе катионных порфиринов, имеющих один или более положительных зарядов, показали свою эффективность в инактивации вирусов, бактерий и грибков [12–15]. Установлено, что наличие положительного заряда способствует сильному электростатическому взаимодействию тетрапиррольного макроцикла с отрицательно заряженными участками на поверхности бактерий, что повышает эффективность фотоинактивации последних [16–18]. Главными преимуществами использования порфиринов в качестве ФС для ФДТ являются их ароматическая стабильность, эффективное поглощение света в видимой области, высокий выход синглетного кислорода ¹O₂, легкость функциональной модификации и структурное разнообразие, длительное время жизни триплетного состояния и минимальная темновая токсичность [18].

Природа и количество катионных заместителей, наличие ионов металлов оказывают влияние на оптические и фотофизические свойства, а также в значительной мере влияют на степень гидрофобности исходного соединения [19].

Цель работы – синтез и изучение антибактериальной фотодинамической активности симметричных катионных мезо-арилпорфиринов типа транс-АВАВ. В работе приведен анализ влияния структуры соединений на их фотохимическую и антимикробную активность.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Материалы. В работе использовали коммерческие реагенты аналитической чистоты фирмы Sigma-Aldrich, силикагель для колоночной хроматографии (Macherey-Nagel), пластины для ТСХ, покрытые силикагелем 60 F254 (Macherey-Nagel). Также применяли органические растворители отечественного производства (ООО “Химмед Синтез”): хлористый метилен (х. ч.), гексан (х. ч.), этилацетат (х. ч.), метанол (х. ч.), этанол (х. ч.), очищенные по стандартным методикам.

Спектры ЯМР (¹H и ¹³C) растворов исследуемых веществ в CDCl₃ (CD₃OD) записывали на импульсном фурье-спектрометре Bruker MSL-300 (Германия) на частотах 300.3, 96.32 и 75.49 МГц соответственно с внутренней стабилизацией по дейтерию. В качестве внешних стандартов использовали тетраметилсилан или эфират трехфтористого бора.

MALDI масс-спектры регистрировали на Bruker autoflex speed time-of-flight (TOF) масс-спектрометре (Bruker Daltonics Inc., Германия), оснащенном твердотельным УФ-лазером с λ = = 355 нм (частота 1 кГц, 1000 импульсов для каждого образца) и рефлектроном, в режиме регистрации положительно заряженных ионов. Для регистрации масс-спектров MALDI использовали стальную мишень MTP 384 ground steel (Bruker Daltonics Inc., Германия).

Высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) и масс-спектрометрию высокого разрешения (МСВР) проводили на ультравысокоэффективной жидкостной хроматографической системе Vanquish, сопряженной с гибридным масс-спектрометром высокого разрешения Q-Exactive HF-X при ионизации электроспреем. Хроматографическое разделение осуществляли на обращенно-фазовой колонке Hypersil Gold C8 длиной 50 мм с внутренним диаметром 2.1 мм, диаметром частиц сорбента 1.9 мкм (Thermo Scientific, Германия, каталожный номер № 10238700). В качестве компонента А подвижной фазы использовали деионизированную воду Milli Q с удельным сопротивлением 18.2 Ом/см. В качестве компонента Б подвижной фазы использовали изопропиловый спирт для ВЭЖХ (Scharlau, Испания, каталожный номер № 603-117-00-0). Объемная скорость потока подвижной фазы 0.25 мл/мин. Температура колонки 40°С. Объем аликвоты, наносимой на колонку, 3 мкл. Режим элюирования градиентный. Градиент изменения состава подвижной фазы: 0.0–1.0 мин – компонент Б, 5%; 1.0–12.0 мин – линейное увеличение компонента Б до 95%; 12.0–14.0 мин – компонент Б, 95%; 14.0–14.1 мин – ступенчатое снижение копонента Б до 5%; 14.1–15.0 мин – компонент Б, 5%. Условия ионизации: напряжение на распыляющем капилляре ±4.0 кВ (в зависимости от полярности); расход распыляющего газа 35 у.е.; расход вспомогательного газа 15 у.е.; расход осушающего газа 5 у.е.; температура распыляющего капилляра 200°С; температура входного капилляра масс-спектрометра 350°С; температура вспомогательного газа 200°С; напряжение на входной линзе ионной оптики 50 В. Электронные спектры были записаны на спектрофотометре TermoSpectronic Helios Alpha или HACH DR-4000V в кварцевых кюветах с длиной оптического пути 1 см, стационарные спектры флуоресценции – на спектрофлуориметре Cary Eclipse (Agilent) или Perkin Elmer LS-50. Длина волны возбуждения соответствовала максимуму поглощения в полосе Соре.

Фотохимические эксперименты, в том числе оценку фотостабильности, проводили при облучении насыщенных воздухом спиртовых растворов порфиринов в кварцевых кюветах. В качестве источника освещения использовали осветительную систему, состоящую из галогенной лампы мощностью 150 Вт, трехлинзового сферического конденсора с отражателем, тепловым и УФ-фильтрами и светофильтра ЖС-16, пропускающего свет с λ ≥ 500 нм. Мощность светового потока составляла 10 мВт/см².

Эффективность фотосенсибилизированной генерации синглетного кислорода в растворах порфиринов оценивали по динамике снижения оптической плотности в полосе поглощения селективного акцептора ¹О₂ – 1,3-дифенилизобензофурана (DPBF) при 415 нм, который добавляли к раствору порфирина в этаноле непосредственно перед началом облучения (С_DPBF = 0.1 мМ). Во всех фотохимических экспериментах концентрацию порфиринов поддерживали на уровне 1.5 мкМ, при этом оптическая плотность растворов в области Q-полос поглощения не превышала 0.05 с целью минимизации эффекта светового фильтра. Расчеты квантового выхода синглетного кислорода (Φ_Δ) проводили по методике [18, 19] с использованием ТРР (Φ_Δ = 0.73) и ZnTPP (Φ_Δ = = 0.94) [18] в качестве стандартов.

Биологические исследования. Объектом изучения служил штамм 78 Staphylococcus aureus (Sa78), полученный из коллекции микроорганизмов ФГБУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздравсоцразвития России. Исследования проводили на экспериментальной установке на основе непрерывного светоизлучающего диода с длиной волны 420 нм. Интенсивность излучения составляла 3.9 мВт/см², экспозиции – 5, 10, 20, 40 мин (дозы облучения 1.2, 2.3, 4.7, 9.4 Дж/см² соответственно). S. aureus инкубировали в течение 12 ч при 37°C в питательном бульоне Brain Heart Infusion (Difco, США), разводили в фосфатно-солевом буфере до достижения оптической плотности (D₆₀₀), равной 1, что соответствует концентрации 10⁹ КОЕ/мл. Бактериальную суспензию (1 мл) дважды отмывали центрифугированием в стерильной дистиллированной воде (7000 об./мин, 3 мин) и ресуспендировали в 10 мл стерильной дистиллированной воды. До облучения суспензии клеток инкубировали с ФС в течение 10 мин в темноте при комнатной температуре. После облучения делали серию десятикратных разведений проб на агаризованной среде ГРМ-1 (Оболенск, Россия) и разливали в чашки Петри. Облученные и контрольные пробы инкубировали в термостате при 37°С. Учет результатов осуществляли путем подсчета колониеобразующих единиц (КОЕ) через 24 ч после инкубации при 37°С. В качестве контроля принимали значения колониеобразующей способности бактерий, не подвергавшихся облучению и не обработанных ФС. Бактерицидный эффект определяли как соотношение выживших бактерий в опыте и в контроле.

Ди(1Н-пиррол-2-ил)метан (1). Смесь 0.66 г (22 ммоль) параформа в 154 мл (2.21 ммоль) пиррола перемешивали в течение 10 мин в атмосфере аргона, затем смесь нагревали до 55°С и добавляли 0.49 г (22.12 ммоль) InCl₃. Реакционную массу перемешивали при нагревании в течение 7 ч, затем остужали и добавляли 0.49 г (12.25 ммоль) NaOH. Смесь концентрировали в вакууме. Продукт выделяли методом колоночной хроматографии на силикагеле G 60. Элюировали системой хлороформ : гексан = 1 : 1. Выход 108.1 мг (67%). ¹H ЯМР (300 МГц, CDCl₃, δ, м.д.): 7.78 (с, 2H), 6.64 (м, 2H), 6.16 (дд, J = 5.8, 2.8 Гц, 2H), 6.05 (м, 2H), 3.96 (с, 2H). ¹³C ЯМР (75 МГц, CDCl₃, δ, м.д.): 129.01, 117.25, 108.30, 106.36, 26.38.

4-(4-Бромбутокси)-3-метоксибензальдегид (2). К раствору 2 г (13 ммоль) ванилина и 3.37 г (15.6 ммоль) 1,4-дибромбутана в 20 мл ацетона добавляли при перемешивании 2.15 г (15.6 ммоль) K₂СО₃ и кипятили в течение 8 ч. Экстрагировали в системе хлороформ–вода. Для очистки вещества реакционную массу подвергали колоночной хроматографии на силикагеле G 60. Элюировали системой хлороформ : этилацетат = 125 : 1. Сушили в вакууме над P₂O₅. Выход 2.8 г (75%). ¹Н ЯМР (CDCl₃, δ, м.д.): 2.06 (4Н, м, СН₂–СН₂), 3.50 (2Н, т, J = 6.1 Гц, СН₂Br), 3.91 (3Н, с, ОСН₃), 4.13 (2Н, т, J = 5.6 Гц, ОСН₂), 6.96 (1Н, д, J = 8.1 Гц, 5‑(ArH)), 7.41 (1Н, д, J = 3.2 Гц, 6-(ArH)), 7.44 (1Н, с, 2-(ArH)), 9.84 (1Н, с, СHO).

5,15-Ди(4-(4-бромбутокси)-3-метоксифенил)порфирин (3а). В 100 мл хлористого метилена растворяли 0.146 г (1 ммоль) дипирролилметана и 0.287 г (1 ммоль) бензальдегида 2. Реакционную массу насыщали инертным газом при перемешивании в течение 15 мин, после чего добавляли 74.5 мкл (1 ммоль) трифторуксусной кислоты. Раствор перемешивали 1 ч 40 мин в токе инертного газа при комнатной температуре в темноте, затем добавляли 227 мг (1 ммоль) DDQ и продолжали перемешивание еще 2 ч. Реакционную массу концентрировали в вакууме, экстрагировали в системе хлористый метилен/вода с добавлением водного раствора аммиака. Целевой продукт очищали колоночной хроматографией на силикагеле G 60, элюировали системой хлористый метилен : триэтиламин = 100 : 0.1. Выход 135 мг (32.8%). ЭСП (λ, нм, lg ε): 411 (5.33), 505 (4.16), 541 (3.87), 577 (3.80), 630 (3.54). ¹H ЯМР (300 МГц, ДМСО-d6, δ, м.д.): 10.34 (с, 2H, мезо-10, 20), 9.42 (д, J = 4.6 Гц, 4H, Н3, Н7, Н13, Н17), 9.18 (д, J = 5.6 Гц, 4H, Н2, Н8, Н14, Н18), 9.13 (д, J = 4.6 Гц, 4H), 8.71 (т, J = = 7.8 Гц, 2H), 8.29 (t, J = 7.0 Гц, 4H), 7.77 (д, J = 8.1 Гц, 2H), 7.46 (д, J = 8.1 Гц, 2H), 4.89 (t, J = 7.0 Гц, 4H), 4.36 (т, 4H), 3.96 (с, 6H), 2.40–2.23 (м, 4H), 1.96 (м, 4H), –3.20 (с, 2H). По данным МСВР рассчитано для С₄₂H₄₀Br₂N₄O₄, вычислено для С₄₂H₄₀Br₂N₄O₄ 823.1489 [M + H]⁺.

Комплекс Zn(II)5,15-ди(4-(4-бромбутокси)-3-метоксифенил)порфирина (3b). К 30 мг (0.036 ммоль) порфирина 3а в 5 мл хлороформа добавляли 118 мг (0.54 ммоль) ацетата цинка дигидрата в 5 мл метанола. Реакционную смесь кипятили в течение 24 ч. О завершении реакции судили по данным спектрофотометрического анализа. Реакционную массу экстрагировали в системе хлороформ–вода. Продукт сушили в вакууме над P₂O_5. Выход 31 мг (99%). ЭСП (λ, нм, lg ε): 411 (5.28), 537 (4.07), 572 (3.56). С₄₂H₃₈Br₂N₄O₄Zn, [M + H]⁺ = = 885.0624.

5,15-Ди(4-(4-пиридилбутокси)-3-метоксифенил)порфирин дибромид (4а). Порфирин 3а (50 мг, 0.061 ммоль) растворяли в 4 мл пиридина. Реакция протекала при кипячении в течение 8 ч. Полученный осадок отфильтровывали и очищали с помощью перекристаллизации из диэтилового эфира в метаноле. Выход 51 мг (85%). ЭСП (λ, нм, lg ε): 413 (5.47), 506 (4.28), 543 (4.01), 581 (3.80), 634 (3.58). ¹H ЯМР (300 МГц, ДМСO, δ, м.д.): 10.66 (с, 2H), 9.70 (д, J = 4.7 Гц, 4H), 9.34 (д, J = 5.6 Гц, 4H), 9.17 (д, J = 4.7 Гц, 4H), 8.74 (т, J = 7.8 Гц, 2H), 8.39–8.27 (м, 4H), 7.97 (с, 2H), 7.81 (д, J = 8.1 Гц, 2H), 7.50 (д, J = 8.3 Гц, 2H), 4.93 (т, J = 7.3 Гц, 4H), 4.40 (т, J = 6.0 Гц, 4H), 4.00 (с, 6H), 2.43–2.27 (м, 4H), 2.08–1.93 (м, 4H), J = 3.16 (с, 2H). ¹³C ЯМР (75 МГц, ДМСО, δ, м.д.): 148.91, 148.49, 147.69, 146.56, 145.87, 145.59, 134.05, 133.38, 131.79, 129.17, 128.53, 119.79, 119.56, 112.76, 106.57, 69.00, 61.56, 56.84, 29.08, 26.25. [M – 2Br]⁺ = 824.2604.

Комплекс Zn(II)5,15-ди(4-(4-пиридилбутокси)-3-метоксифенил)порфирина дибромида (4b). Металлокомплекс 3b (50 мг, 0.056 ммоль) растворяли в 4 мл пиридина. Реакция протекала при кипячении в течение 8 ч. Полученный осадок отфильтровывали и очищали с помощью перекристаллизации из диэтилового эфира в метаноле. Выход 52 мг (89%). ЭСП (λ, нм, lg ε): 419 (5.62), 548 (4.25), 586 (3.70). ¹H ЯМР (300 МГц, ДМСO, δ, м.д.): 10.39 (с, 2H), 9.54 (д, J = 4.5 Гц, 4H), 9.33 (д, J = 5.7 Гц, 4H), 9.07 (д, J = 4.4 Гц, 4H), 8.75 (т, J = 7.8 Гц, 2H), 8.39–8.26 (м, 4H), 7.88 (с, 2H), 7.77 (д, 2H), 7.46 (д, J = 8.2 Гц, 2H), 4.93 (т, J = 7.1 Гц, 4H), 4.40 (т, J = 5.9 Гц, 4H), 3.98 (д, J = 1.8 Гц, 6H), 2.45–2.25 (м, 4H), 2.09–1.93 (м, 4H). ¹³C ЯМР (75 МГц, ДМСО, δ, м.д.): 150.43, 149.77, 148.49, 147.98, 146.57, 145.88, 136.28, 132.85, 132.69, 129.18, 124.81, 119.77, 119.73, 112.34, 106.81, 69.03, 61.60, 56.79, 29.11, 26.28. [M – 2Br]⁺ = 885.3000

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Разработка новых ФС с повышенной селективностью и биодоступностью является путем к развитию метода фотодинамической инактивации различных микроорганизмов [20–22]. В связи с этим в данной работе был разработан подход к синтезу катионных порфиринов с дополнительными гидрофильными метоксигруппами на периферии макроцикла, способствующими повышению амфифильных свойств порфиринов.

Ранее нами был предложен подход к получению катионных мезо-арилпорфиринов типа А4, согласно которому предварительно получают ω-бромзамещенные бензальдегиды для реакции монопиррольной конденсации, а далее полученные бромзамещенные порфирины кватернизуют в пиридине [23, 24]. Подобный подход был применен нами для получения новых транс-АВАВ порфиринов и их комплексов Zn(II), содержащих пиридиниевые заместители на периферии макроцикла. Целевые транс-А2В2 порфирины могут быть получены реакцией конденсации дипирролилметанов и соответствующих бензальдегидов в условиях, предложенных авторами [25]. Нами также было решено использовать данный подход, предварительно получив исходные реагенты.

Дипирролилметан 1 получали по методу [26] с использованием трихлорида индия с выходом 67%, бензальдегид – реакцией алкилирования 4‑гидрокси-3-метоксибензальдегида соответствующим дибромалканом в присутствии K₂CO₃ в ацетоне при кипячении в течение 8 ч с выходом 75%. Соединение 3а получали конденсацией дипирролилметана 1 и бензальдегида 2 в стехиометрических соотношениях в хлористом метилене в инертной атмосфере аргона. В качестве катализатора использовали TFA, а в качестве окислителя – DDQ. Далее реакция протекала в течение 2 ч на воздухе (схема 1 ). Образование порфиринов было подтверждено данными электронной спектроскопии. В электронном спектре на границе УФ- и видимой области в районе 415 нм находилась полоса Соре, в видимой области спектра (517–650 нм) присутствовали также четыре полосы поглощения, что свидетельствовало об образовании порфириновой системы.

Схема 1. Реагенты и условия проведения реакций: i – TFA, CH₂C_l2, Ar; ii – DDQ; iii – ZnOAc₂ для 3b, CH₂Cl₂/CH₃OH; iv – Py, t, °C.

Целевой порфирин 3а выделяли колоночной хроматографией. На рис. 1 представлены масс-хроматограмма и масс-спектр соединения 3a при регистрации положительно заряженных ионов. В спектре ¹Н ЯМР наблюдаются сигналы синглета при 10.33 м.д., соответствующего двум протонам незамещенного мезо-положения, а также два дублета при 9.42 и 9.18 м.д., соответствующие СН-пиррольным протонам с интегральной интенсивностью (4 : 4), свидетельствующие о наличии симметричной порфириновой системы.

Рис. 1.

Масс-хроматограмма и масс-спектр 3a при регистрации положительно заряженных ионов [M + H]⁺ = 823.1489.

Металлокомплекс 3b получали взаимодействием 1 экв. свободного основания порфирина 3a с 15 экв. ацетата цинка (схема 1 ). Для получения комплекса c цинком 3b реакцию проводили при кипячении в течение 24 ч. Контроль за ходом реакции осуществляли по данным спектрофотометрического анализа. Продукт выделяли из реакционной смеси при помощи экстракции в системе хлористый метилен–вода.

Целевые катионные производные порфиринов 4а, 4b получали реакцией кватернизации пиридина (схема 1 ). Для этого соединения 3а, 3b [21] кипятили в пиридине в течение 8 ч. Продукты реакции очищали перекристаллизацией из диэтилового эфира в метаноле. Индивидуальность и химическую структуру полученных соединений 3, 4а, 4b подтверждали данными ТСХ, ¹Н, ¹³С ЯМР-спектроскопии и ESI масс-спектрометрии.

В ¹Н ЯМР-спектре соединений 4а, 4b наблюдаются сигналы синглета при 10.63 м.д., соответствующего двум протонам незамещенного мезо-положения, два дублета при 9.32 и 9.14 м.д., соответствующие СН-пиррольным протонам с интегральной интенсивностью (4 : 4), свидетельствующие о наличии симметричной порфириновой системы, а также три сигнала пиридиниевых групп (9.66, 8.71, 8.27 м.д.) (рис. S7 -8, S11-12).

Спектральные параметры и фотофизические свойства полученных катионных порфиринов приведены в табл. 1. Так, в спектре поглощения 4а имеется пять полос: интенсивная полоса Соре в области 420 нм и четыре менее интенсивные Q-полосы. Исследуемые соединения относятся к этио-типу, интенсивности Q-полос: εI > εII > εIII > > εIV. Для цинкового металлокомплекса 4b характерно наличие трех полос поглощения, а также батохромный сдвиг полос на 6 нм [27]. Спектры флуоресценции показаны на рис. S17. При возбуждении в полосу Соре или любую из Q-полос полученные спектры испускания были идентичны. Квантовые выходы флуоресценции были измерены по сравнению с ТФП (возбуждение 513 нм) в толуоле.

Высокая эффективность комплекса 4b в генерации синглетного кислорода приводит к аутосенсибилизации и, как следствие, к низкой фотостабильности данного металлокомплекса. Средняя скорость фотообесцвечивания в этаноле составляет 3%/мин при облучении видимым светом с λ > 500 нм и мощностью 10 мВт/см². Аналогичное значение для свободного лиганда 4а составляет всего 0.25%/мин (рис. 2).

Рис. 2.

Кинетические кривые фотообесцвечивания соединений 4а и 4b в этаноле (а) и фотосенсибилизированного окисления DPBF синглетным кислородом в присутствии соединений 4а и 4b (б).

Биологические испытания. Для целевых катионных порфиринов 4a и 4b было проведено исследование светоиндуцированной активности по отношению к штамму Staphylococcus aureus 78, в результате которого выявлено, что цинковый комплекс 4b оказывает антибактериальное воздействие во всем тестируемом диапазоне концентраций при минимальной дозе облучения 2.3 Дж/см² по сравнению с 4а, показавшим меньшую эффективность даже при максимальной дозе облучения. На рис. 3а показано изменение численности (КОЕ, %) S. aureus 78 при фотодинамической инактивации веществами 4а и 4b относительно выживших бактерий в контроле. Несмотря на то, что ранее нами была показана большая эффективность для незамещенных порфиринов [21, 22], в данной работе эффективность металлокомплексов оказалась выше (рис. 3б). В первую очередь это явление связано с растворимостью целевых соединений. Так, соединение 4b лучше растворяется в водной среде в исследуемом диапазоне концентраций по сравнению с 4а, что также согласуется с полученными данными по фотохимической активности целевых соединений. Следует отметить, что незамещенный метиленовый мостик при атомах H10, H20 порфиринового кольца приводит к большей гидрофобности транс-5,15-дизамещенных порфиринов по сравнению с тетрафенилзамещенными порфиринами.

Рис. 3.

Фотоинактивация Staphylococcus aureus 78 (КОЕ/мл × 10⁸) при фотодинамической инактивации комплексов 4a (а) и 4b (б) относительно выживших бактерий в контроле при облучении светодиодом с длиной волны 420 нм.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Cинтезированы новые катионные 5,15-дизамещенные порфирины. Полученные соединения охарактеризованы физико-химическими методами анализа, изучены их фотофизические свойства. В экспериментах по инактивации бактерий in vitro установлено, что цинковый комплекс 4b эффективно ингибирует рост грамположительных бактерий S. aureus в суспензии при световом облучении (J = 2.3 Дж/см²) в диапазоне концентраций от 2 × 10^–6 до 1 × 10^–5 М. В тех же условиях в случае порфирина 4а наблюдается гораздо менее выраженный эффект: через 40 мин облучения фотоинактивация бактерий составляет 70–90%.