Журнал общей биологии, 2019, T. 80, № 3, стр. 187-199

Флуоресцентный метод определения реактивности фотосинтетического аппарата листьев растений

Т. В. Нестеренко 1*, В. Н. Шихов 1, А. А. Тихомиров 1

1 Институт биофизики СО РАН
660036 Красноярск, Академгородок, 50/50, Россия

* E-mail: tv-nesterenko@mail.ru

Поступила в редакцию 08.05.2018
После доработки 20.08.2018
Принята к публикации 01.11.2018

Полный текст (PDF)

Аннотация

В настоящее время наиболее перспективным направлением изучения, прогнозирования и повышения устойчивости организмов к экстремальным воздействиям считается оценка исходного функционального состояния регуляторных систем организма. Для решения проблем устойчивости фотосинтетического аппарата (ФСА) к экстремальным воздействиям на уровне такой сложной функциональной системы как лист растения необходимо оценивать интегральные реакции ФСА листа в целом. При этом более простые и универсальные показатели могут иметь определенные преимущества. Флуоресценция хлорофилла является одним из основных быстро регистрируемых показателей фотосинтетической активности растений. Один из подходов может заключаться в использовании для оперативной интегральной оценки активности ФСА параметров, введенных для кривых медленной стадии индукции флуоресценции хлорофилла (ИФХ). Особый интерес вызывают временные xаpактеpиcтики ИФX. Наиболее простой показатель Т0.5 (время полуспада интенсивности флуоресценции хлорофилла в течение медленной фазы ИФX) представляет собой интегральную xаpактеpиcтику cкоpости активации pяда фотоассимиляционных и фотозащитных процессов в лиcте. На основании ранее проведенных исследований и литературных данных в работе анализируется поведение параметра Т0.5 в сравнении с другими характеристиками ИФХ (qN – коэффициентом нефотохимического тушения флуоресценции хлорофилла, ETR –потоком электронов через фотосистемы, ΦPSII – квантовым выходом фотохимической реакции в ФС II и отношением Fp/FТ) в разных ситуациях. Рассмотрено влияние старения листьев растений, изменения интенсивности возбуждающего ИФХ света, слабого обезвоживания растений и восстановления их водного дефицита. Наблюдаемые в экспериментах особенности в поведении Т0.5 и сравнение его с другими показателями ИФХ дают основания предложить применение Т0.5 для косвенной оценки изменения активности ФСА в ситуациях, когда необходим оперативный интегральный контроль за состоянием ФСА. Для установления количественных закономерностей между активностью ФСА и флуоресцентным параметром T0.5 в конкретных стрессовых условиях необходимы дальнейшие исследования.

Для оперативного мониторинга экосистем в условиях резких климатических изменений и антропогенных воздействий оценка состояния фитоценозов имеет особое значение из-за высокой чувствительности фотосинтеза растений к изменениям окружающей среды. Показано, что наиболее чувствительными к действию стрессовых факторов среды физиологическими процессами у растений являются первичные процессы фотосинтеза (Lichtenthaler, Rinderle, 1988; Сааков, 2000; Кочубей и др., 2006). Все стрессовые факторы, действующие на какую-либо часть растения, прямо или косвенно влияют на активность фотосинтетического аппарата (ФСА) на уровне листа (Мокроносов, 1981). Одной из наиболее сложных задач при исследовании устойчивости растительных объектов является определение “нормы” реагирования биосистемы на действующий фактор (Булгаков, 2002; Нестеренко и др., 2007). В этом отношении большие возможности открывает применение в экологии метода индукции флуоресценции хлорофилла (ИФХ), позволяющего более оперативно оценивать состояние фотосинтетического аппарата растений и его реакции на неблагоприятные воздействия разной природы (Lichtenthaler, Rinderle, 1988; Nesterenko et al., 2006; Шихов и др., 2011; Ashraf, Harris, 2013).

Понятие реактивности фотосинтетического аппарата в настоящее время имеет качественный характер, как и многие биологические понятия. Однако имеются методические подходы для характеристики реактивных свойств отдельных функциональных систем. Реактивность может характеризоваться при этом не одним, а несколькими параметрами, в том числе и временными. Широко применяемый в мировой практике метод ИФХ уже давно зарекомендовал себя как объективный и оперативный способ определения физиологического состояния фотосинтетического аппарата растений в нормальных и стрессовых условиях (Гольцев и др., 2016; Kalaji et al., 2017). Явление индукции флуоресценции хлорофилла или эффект Каутского (Govindjee, 1995) косвенно связано со всеми этапами световой фазы процесса фотосинтеза: фотолизом воды, переносом электронов, генерацией градиента рН на мембранах тилакоидов и синтезом АТФ (Kalajet et al., 2014; Гольцев и др., 2016; Lyu, Lazár, 2017a, b). Однако, несмотря на большие потенциальные возможности метода ИФХ, участие его в оценке состояния растений по шкале “норма–патология” в стрессовых условиях пока еще остается недостаточно активным из-за сложности реакции исследуемых объектов (Тарчевский и др., 1975; Lichtenthaler, Rinderle, 1988; Бухов, 2004; Лысенко и др., 2014) и ряда технических трудностей при регистрации ИФХ (Nesterenko et al., 2006; Алексеев и др., 2012; Nesterenko et al., 2015; Шихов и др., 2016а).

В статье мы попытались отразить сложность ситуации с точной оценкой реактивности ФСА и обосновать возможность использования простых параметров медленной стадии индукции флуоресценции хлорофилла (ИФХ), ранее уже предложенных, но, к сожалению, пока мало используемых в мониторинге состояния ФСА в стрессовых условиях.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для количественной оценки показателей ИФX Fp/FT и Т0.5 листьев растений на старение и изменения интенсивности света анализировали экспериментальные данные, полученные с использованием растений огурца, редиса, пшеницы. Объектами исследования были высечки разновозрастных листьев пшеницы линии 232 селекции Лисовского (лист 5-го яруса снизу); редиса сорта “Вировский белый” (3-й лист), огурца сорта “Московский тепличный” (лист 3-го яруса). Растения выращивали в условиях светокультуры в вегетационных камерах методом гидропоники на керамзите при уровне облученности 100 Вт/м2 фотоcинтетичеcки активной радиации (ФАP) (Tikhomirov, Sid’ko, 1982). Для растений пшеницы и редиса использовали непрерывное облучение, для огурца – фотопериод: 10 ч темноты, 14 ч света. Температура воздуха поддерживалась при 20 ± 1°С, содержание СО2 – в пределах 0.3–0.8%; относительная влажность воздуха – на уровне 70–80%. Эксперименты были проведены в 3-кратной повторности. Регистрацию кривых ИФХ проводили на однолучевой установке (Nesterenko et al., 2012). Время регистрации кривой ИФХ составляло 3–5 мин, время темновой адаптации растений – 30 мин.

Для оценки степени изменений значений параметров ИФХ Т0.5, ETR и ΦPSII листьев при водном дефиците и репарации анализировали данные, полученные на растениях листовой капусты сорта Бансэй Маруба (Шихов и др., 2016б). Растения выращивали в условиях светокультуры на вегетационной установке закрытого типа. Для освещения использовали комбинацию ламп ДРФ-1000 и ДРЛ-1000. Освещенность в камере составляла порядка 100 Вт/м2 ФАР. Температура воздуха поддерживалась на уровне 24 ± 1°С, влажность воздуха – около 70%. Растения выращивали в двух раздельных вегетационных сосудах. Полив осуществлялся автоматически один раз в сутки. Концентрация СО2 была атмосферная. Флуоресцентные измерения проводили на интактных листьях с помощью флуориметра PAM-2100 производства фирмы Walz (Германия). Темновая адаптация перед измерениями составляла 30 мин (Шихов и др., 2016a). Интенсивность действующего белого света от внутреннего галогенного источника составляла около 200 Вт/м2 ФАР. Измерения флуоресценции проводили ежедневно в четырех повторностях для каждого исследуемого варианта на зрелых листьях, находящихся в верхней части растительного ценоза. По достижении растениями возраста 21 сут один из вегетационных сосудов был отключен от системы полива с целью создания стрессовых условий водного дефицита. Стрессовые условия длились до полной потери тургора листьев и контролировались при помощи системы видеомониторинга. На 4-е сутки полив был возобновлен (Шихов и др., 2016б).

УСТОЙЧИВОСТЬ И РЕАКТИВНОСТЬ ФСА РАСТЕНИЙ

“Устойчивость растений при действии экстремальных факторов определяется как их максимальная способность к сохранению гомеостаза и основных функций, обеспечивающих жизнедеятельность в этих условиях, к эффективной компенсации нарушенных функций, а также к максимально быстрому и эффективному их восстановлению после прекращения экстремального воздействия” (Удовенко, 1988, стр. 5). Устойчивость организма тесно связана с его реактивностью, понимаемой как способность к максимально быстрой перестройке сложившегося действующего на данный момент функционального стереотипа в ответ на любые изменения внешней среды (Тарчевский и др., 1975; Шабала, Войнов, 1994). “Формирование ответной реакции ФСА на внешнее воздействие обусловлено свойствами отдельных элементов (частными реакциями) и характером взаимодействия между ними” (Тарчевский и др., 1975, стр. 9). При исследовании механизмов реактивности фотосинтезирующих систем изучают либо ответную реакцию как реактивность системы в целом, либо исследуют свойства и взаимоотношения отдельных частных реакций. Последний подход нашел более широкое распространение в исследованиях экологии и физиологии растений с помощью метода ИФХ (Mohammed et al., 1995; Fracheboud, Leipner, 2003; Kalajet et al., 2014, Гольцев и др., 2016). Однако, несмотря на широкое применение флуоресценции хлорофилла для фундаментальных и прикладных исследований, для оперативной оценки состояния фитоценозов более важны методы оценки реактивности системы в целом. В связи с этим разработка оперативных методов оценки устойчивости растений в фитоценозах и определение их интегральных реакций на неблагоприятные внешние воздействия является актуальной проблемой для экологической системы контроля фитоценозов и для фундаментальных исследований реактивности растений в природной среде. Для исследования состояния реактивности используют различные подходы и методические приемы: обычно учитывают изменение одного или нескольких показателей, характеризующих степень и особенности действия фактора на определенную функцию (Тарчевский и др., 1975; Удовенко, 1988; Lichtenthaler, Rinderle, 1988). Особый интерес вызывает развитие во времени ответной реакции фотосинтетического аппарата на действие неблагоприятного фактора (Веселовский и др., 1993; Шабала, Войнов, 1994). Изучение реактивности фотосинтетического аппарата представляет интерес по нескольким причинам: во-первых, оно позволяет обнаружить связи между различными процессами и приблизиться к пониманию механизмов регуляции различных функций ФСА. Под регуляцией понимается “такая внутренняя перестройка сложной системы при получении определенной сигнальной информации, которая направлена на обеспечение необходимого режима функционирования в новых условиях” (Рубин, 2007, стр. 5). Биофизический подход к решению проблем регуляции состоит в анализе динамического поведения ФСА в ответ на внешние воздействия. Детально исследовать временной характер изменения свойств системы и прогнозировать характер ее ответа на внешние воздействия позволяет математическое моделирование динамики исследуемого процесса (Ризниченко, Рубин, 2007). Во-вторых, интегральные показатели, характеризующие реактивность регуляторных систем, тесно связаны с устойчивостью растений в неблагоприятных условиях (Веселова и др., 1993; Ушаков и др., 2007).

Важной отличительной чертой любого биологического организма является наличие обширной иерархической системы обратных связей (Чернышов, Гаджиев, 1983). Их наличие обуславливает возможность поддерживать ритмические режимы в системах физиологической регуляции, взаимную координацию и подстройку различных метаболических процессов, протекающих в одном и том же компартменте с различными скоростями (Ашофф, 1984). “Реализация фотосинтеза в растении определяется, с одной стороны, высокой функциональной активностью структур низких порядков (фотосинтетическая единица, хлоропласт, клетка), а с другой – сложной системой интеграции и кооперативных связей фотосинтеза с другими физиологическими функциями растительного организма” (Мокроносов, 1981, стр. 3). “Совокупность динамических регуляторных реакций, основанных на принципах отрицательной и положительной обратной связи, обеспечивает длительное функционирование хлоропласта и высокую стабильность при различных условиях освещения таких параметров, как отношения НАДФН/НАДФ+ и АТФ/АДФ в строме хлоропласта, а также скорости переноса электронов между фотосистемами, необходимых для согласованного протекания двух стадий фотосинтеза…” (Бухов, 2004, стр. 834). “…адаптивные возможности организма, определяющие его уровень устойчивости, могут оцениваться по многим физиологическим параметрам. Однако не все физиологические параметры четко отражают устойчивость. Поэтому для диагностических целей следует использовать оценку изменений таких характеристик организма, которые играют существенную роль именно в реализации потенциала его устойчивости” (Удовенко, 1988, стр. 6). Существует мнение, что “чем более раннее звено в цепи фотосинтетических реакций повреждается в результате воздействия какого-нибудь экстремального фактора, тем большие нарушения будут обнаруживаться в работе ФСА в целом. Если же повреждение затрагивает лишь одно из последних звеньев, это приведет к меньшим нарушениям фотосинтетической функции. Для суждения о функционировании ФСА в целом необходимо использовать интегральные показатели. Если говорить строго, то можно говорить лишь о реактивности целостной системы (организма)" (Тарчевский и др., 1975, стр. 9).

В последнее время внимание исследователей при исследовании устойчивости организмов к стрессовым воздействиям привлекают интегральные показатели, прежде всего характеризующие реактивность регуляторных систем организмов (Ушаков и др., 2007). “Уже на уровне листьев растений проявляется интегрированная надклеточная система управления. Природа этой системы управления еще недостаточно исследована и включает процессы межклеточных взаимодействий, действие гормональных, ингибиторных и электрофизиологических сигналов” (Мокроносов, 1981, стр. 3). Биофизический подход к решению проблем регуляции сложных систем заключается в анализе динамического поведения системы в ответ на внешние воздействия. Считается, что “ответ сложной системы в основном определяется изменением ее общих динамических свойств, а взаимодействия между отдельными элементами системы играют подчиненную роль” (Рубин, 2007, стр. 5).

ФЛУОРЕСЦЕНЦИЯ ХЛОРОФИЛЛА

В последние два десятилетия метод ИФХ в разных вариантах широко применяют для оценок устойчивости растений к некоторым видам стресса (Lichtenthaler, Rinderle, 1988; Roháček, 2002; Корнеев, 2002; Fracheboud, Leipner, 2003; Mohammed et al., 2003; Sayed, 2003). Благодаря неспецифическому характеру изменений ИФХ при действии на растения различных стрессоров, с помощью измерения флуоресценции хлорофилла можно определять наличие стресса, но не его тип, поскольку многие стрессоры действуют на функцию фотосистемы 2 подобным образом (Lichtenthaler, Rinderle, 1988; Lichtenthaler, 1990; Сааков, 2000; Mohammed et al., 2003; Sayed, 2003). Метод основан на эффекте Каутского (Lichtenthaler, 1992; Govindjee, 1995). После освещения адаптированных к темноте листьев растений первоначально в течение секунды наблюдается резкий подъем интенсивности флуоресценции хлорофилла – быстрая фаза (стадии O-I-D-P), а затем в течение нескольких секунд и минут постепенное снижение через определенные стадии P-S-M-T (медленная фаза) к стационарному уровню T (Kooten, Snel, 1990). Наибольший интерес для понимания механизмов устойчивости и мониторинга состояния фотосинтетического аппарата растений в экстремальных условиях представляют параметры медленной стадии (P-S-M-T) ИФХ, так как они в большей степени связаны с биохимическими процессами фотосинтеза и вследствие своей природы – с более интегральным процессом – интенсивностью газообмена СО2 на уровне листьев растений (Караваев и др., 1988; Lichtenthaler, Rinderle, 1988; Нестеренко, Сидько, 1993; Рубин, 2007). В одном из последних обзоров (Гольцев и др., 2016) приведена достаточно подробная информация о современном методе изучения фотосинтеза растений in vivo, основанном на измерении и анализе индукции флуоресценции хлорофилла. На основе параметров ИФХ дана мультипараметрическая оценка стрессовой реакции, учитывающая широкий спектр процессов, протекающих в растительной клетке. Для определения функционального состояния ФСА листьев растений и оценки степени изменений активности ФСА, как правило, используется комплекс характеристик, определяемых на основании измерений амплитудных параметров кривой ИФХ листьев растений с применением так называемых PAM-флуориметров (Roháček, Barták, 1999; Roháček, 2002; Гольцев и др., 2016).

Измеряемые флуоресцентные параметры: F0 – минимальная флуоресценция, зарегистрированная, когда все реакционные центры ФС II открыты; FM – максимальная флуоресценция, излучаемая объектом, в котором все реакционные центры ФС II закрыты; Fp – максимальная флуоресценция хлорофилла в условиях ненасыщающего света; Ft – флуоресценция, излучаемая в момент времени t, с момента включения действующего света (ДС); FT – стационарная флуоресценция. Параметр FT (иногда обозначается как FS) представляет интенсивность флуоресценции хлорофилла, которая излучается фотосинтезирующими объектами в условиях стационарного освещения. После темновой адаптации достижение стационарного состояния на индукционной кривой флуоресценции хлорофилла (уровень FT) занимает около 3–5 мин.

Несмотря на то, что уровень флуоресценции хлорофилла определяется редокс-состоянием первичного акцептора ФС 2, основную роль в регуляции активности ФС 2 играет редокс-состояние пластохинонового пула (Веселовский, Веселова, 1990; Корнеев, 2002). В свою очередь редокс-состояние пластохинонового пула определяется соотношением скоростей реакций фотосинтеза, темнового и светового дыхания и других метаболических процессов в растительной клетке (Семихатова, 1990).

Основная часть определяемых с помощью широко распространенных в настоящее время модулирующих флуориметров (так называемых PAM-флуориметров) показателей ИФХ оценивают работу подсистем ФСА листа (Корнеев, 2002; Roháček, 2002). Однако для решения проблем устойчивости ФСА на уровне листьев растений к экстремальным воздействиям этих показателей оказывается недостаточно, особенно когда необходимо определять характер изменений в ФСА листьев растений с точки зрения обратимости повреждений (Lichtenthaler, Rinderle, 1988; Нестеренко и др., 2007). Для быстрого тестирования более простые и интегральные показатели могут иметь определенные преимущества при изучении реакций ФСА на неблагоприятные воздействия такой сложной функциональной системы, как лист растения.

В обзоре В.Н. Гольцева с соавт. (2016) анализируются и возможности ряда интегральных показателей, таких как

1) показатель квантовой эффективности фотосинтеза – отношение вариабельной флуоресценции к максимальной: Fv/Fm, где Fv = Fm F0, причем Fm измеряется в момент мощной вспышки, насыщающей фотосинтез;

2) индекс спада флуоресценции Rfd = (FpFТ)/FT, известный также как индекс жизнеспособности, где Fр – максимальная (в пределах фотоиндукционной кривой) флуоресценция хлорофилла в условиях ненасыщающего света. Величина Rfd более чувствительна к внешним воздействиям, чем величина Fv/Fm, и хорошо коррелирует с удельной скоростью фотосинтетической фиксации СO2 в нормальных зеленых тканях (Lichtenthaler, Rinderle, 1988; Roháček, 2002). Часто вместо Rfd используют отношение Fp/Fт = Rfd + 1 (Lichtenthaler, Rinderle, 1988; Нестеренко, Сидько, 1993; Kharuk et al.,1994; Sestak, Siffel, 1997; Нестеренко и др., 2007);

3) коэффициент адаптации к стрессу – параметр Ар, который определяют при измерении параметра Rfd одновременно на двух длинах волн (на 690 и 730 нм) (Lichtenthaler, Rinderle, 1988; Гольцев и др., 2016). Кроме этих показателей важными характеристиками активности ФСА листьев растений являются показатели ΦPSII – квантовый выход фотохимической реакции в ФС II и ETR – поток электронов через фотосистемы.

(1)
${{\Phi }_{{{\text{PSII}}}}} = ({{F}_{{{\text{M'}}}}}--{{{{F}_{{\text{T}}}})} \mathord{\left/ {\vphantom {{{{F}_{{\text{T}}}})} {{{F}_{{{\text{M'}}}}}}}} \right. \kern-0em} {{{F}_{{{\text{M'}}}}}}} = {{\Delta F} \mathord{\left/ {\vphantom {{\Delta F} {{{F}_{{{\text{M'}}}}}}}} \right. \kern-0em} {{{F}_{{{\text{M'}}}}}}}.$

ΦPSII – наиболее популярный и важный параметр, который представляет собой соотношение числа квантов, используемых в фотохимических превращениях, к общему числу поглощенных квантов ФАР (Genty et al., 1989).

В лабораторных условиях обнаружена линейная зависимость между значениями параметра ΦPSII и скоростью фиксации двуокиси углерода в процессе фотосинтеза. Расхождения между этими параметрами может произойти в условиях стресса в связи с изменениями эффективности карбоксилирования при активировании фотодыхании или появлении псевдоциклического переноса электрона (Fryer et al., 1998). Как правило, при засухе происходит закрывание устьиц и снижение эффективности реакции ассимиляции CO2 и как следствие – сокращение потребления АТФ и НАДФ Н. Это оказывает влияние на замедление переноса электронов в обеих фотосистемах и должно привести к снижению величины параметра ΦPSII (Гольцев и др., 2016). ETR – поток электронов через фотосистемы, определяемый по формуле:

(2)
${\text{ETR }} = {{\Phi }_{{{\text{PSII}}}}} \times 0.84{\text{ }} \times 0.50 \times {\text{PPFD}}.$

Параметр ETR является произведением квантового выхода (ΦPSII) и плотности потока освещения (PPFD), измеряемого в мкмоль (фотонов ФАР)/м2 · с, умноженных на коэффициент 0.50. Стрессовые факторы снижают значение этого параметра, например, скорость электронного транспорта в картофеле в условиях засухи была значительно ниже, чем в контрольной группе (Basu et al., 1998).

Однако в работе В.Н. Гольцева с соавт. (2016) не рассматриваются возможности временных параметров, в том числе параметра времени полуспада кривой медленной стадии ИФХ Т0.5 (Kharuk et al., 1994; Šesták, Šiffel, 1997; Nesterenko et al., 2012; Птушенко и др., 2013). В то же время в ряде работ (Птушенко и др., 2013; Лысенко и др., 2014) отмечается, что кинетические характеристики фотосинтетических процессов в листьях растений (времена фотоиндуцированного окисления P700, временные параметры кривой ИФХ) более чувствительны к условиям произрастания растений, чем стационарные показатели.

В работе Т.В. Нестеренко с соавт. (2007) был сделан анализ параметров ИФХ, применяемых для определения состояния ФСА листьев растений и диагностики общей устойчивости растений к длительным стрессовым воздействиям. Рассмотрены перспективы использования ИФХ для определения перехода от обратимых к необратимым структурно-функциональным изменениям ФСА растений при длительном стрессе. На основании наших экспериментов и литературных данных мы предложили онтогенетический подход для определения общей устойчивости растений к длительным стрессовым воздействиям. Представленное в работе исследование включало изучение динамики параметра Fp/Fт (как пример) и интегральных физиологических листовых характеристик (скорости фотосинтеза, ростовых характеристик листа) в контролируемых условиях светокультуры. Величины флуоресцентных отношений Fv/Fm, Rfd и FP/FТ наиболее часто используются для сравнительных исследований различий между полностью активными и находящимися в состоянии стресса растениями. Однако по характеру изменений отношений Fv/Fm, Rfd и Fp/FТ трудно оценивать степень необратимых изменений ФСА при старении и при стрессах (Lichtenthaler, Rinderle, 1988; Венедиктов и др., 1999), так как величины этих флуоресцентных отношений изменяются с возрастом листа (Šesták, Šiffel, 1997; Нестеренко, Тихомиров, 2003, 2005). Считается, что при слишком большом наборе переменных, которые используются параллельно и конкурируют за место наиболее адекватного, предпочтение надо отдавать таким показателям, которые удовлетворяют требованиям интегральности, неспецифичности отклика на воздействие, возможности однозначной физиологической интерпретации (Булгаков, 2002). В работе Нестеренко с соавт. (Nesterenko et al., 2019) был поставлен вопрос: возможна ли интегральная экспресс-оценка состояния ФСА по минимальному набору флуоресцентных параметров и какими свойствами эти параметры или характеристики должны обладать? По-видимому, 1) величина их не должна слишком меняться в онтогенезе листа, по крайней мере, после формирования листа и до начала его старения; 2) величина должна быть достаточно стабильной при вариации по интенсивности возбуждающего флуоресценцию света в широком диапазоне (Nesterenko et al., 2012, 2015); 3) предлагаемый параметр должен быть чувствительным к изменению активности ФСА при стрессовых воздействиях и восстановлению состояния ФСА после прекращения воздействия (Li et al., 2013; Шихов и др., 2016б).

Мы предположили, что в число таких параметров может войти параметр T0.5 (Нестеренко, Сидько, 1984; Kharuk et al.,1994; Nesterenko et al., 2012; Птушенко и др., 2013; Nesterenko et al., 2019), представляющий время полуспада интенсивности флуоресценции хлорофилла в течение медленной стадии индукции флуоресценции. По-видимому, его можно рассматривать как наиболее простой показатель реактивности регуляторных систем ФСА листа. Спад кpивой ИФХ отражает регуляторные процессы фотосинтеза: а) усиление нефотохимического тушения флуоресценции, связанное с увеличением диссипации поглощаемой энергии в ФC II, б) активацию цикла Кальвина, приводящую к ускорению оттока электронов от ФC I, в) перераспределение светособирающего антенного комплекса между ФC II и ФC I (Adams, Demmig-Adams, 2004). Медленные изменения флуоресценции хлорофилла связаны не только с фотохимическим использованием света, но также содержат информацию о механизмах, вовлеченных в защиту ФСА от повреждения радикалами, механизмах регуляции тепловой деградации поглощенной световой энергии (Бухов, 2004; Хебер и др., 2007; Jahns, Holzwarth, 2012). “Время полуспада кривой ИФХ (T0.5), таким образом представляет собой интегральную характеристику скорости активации ряда фотоассимиляционных и фотозащитных процессов в листе” (Птушенко и др., 2013). “Целостная система первичных процессов фотосинтеза (ППФ), обладающая функциональной автономией и сложной организацией, характеризуется своеобразными механизмами переноса электрона и динамическими способами саморегуляции своего состояния” (Рубин, 2007, стр. 426). “Запуская” светом последовательность фотосинтетических процессов, можно “тестировать” систему и наблюдать кинетику переходных процессов состояний отдельных ее компонентов (Ризниченко, Рубин, 2007, стр. 166).

“Наиболее перспективным направлением изучения, прогнозирования и повышения устойчивости организмов к стрессовым воздействиям считается оценка исходного функционального состояния регуляторных систем организма, сопоставление их реакций на тестирующие воздействия” (Ушаков и др., 2007, стр. 10). Считается, что “косвенно на основе изменения периода полувосстановления в системе после тестового стрессового воздействия можно оценивать состояние регуляторных систем организма” (Ушаков и др., 2007, стр. 365).

Действие возбуждающего флуоресценцию хлорофилла света на фотосинтетический аппарат (ФСА) адаптированных к темноте листьев растений представляет собой, по-видимому, также тестирующее воздействие, которое можно попытаться использовать для оценки состояния регуляторных систем ФСА листа.

Для оценки величины реакции исследуемого параметра ИФХ на рассматриваемое воздействие применяют интегральный логарифмический показатель I

(3)
$I = {\text{lg}}({{{{N}_{i}}} \mathord{\left/ {\vphantom {{{{N}_{i}}} {{{N}_{i}}_{0}}}} \right. \kern-0em} {{{N}_{i}}_{0}}}),$
где Ni – значение соответствующего параметра при исследуемом воздействии, Ni0 – значение параметра в начале исследования (Ушаков и др., 2007; Nesterenko et al., 2012).

Прогноз устойчивости строится на предположении, что фотосинтетический аппарат тех листьев, у которых имеется определенная исходная (до начала воздействия) недостаточность регуляторных систем, будет менее устойчивым к экстремальному воздействию. “Математически это может выражаться в том, что у наиболее устойчивых образцов логарифмический показатель I = lg(Nit  /N0i) приблизится к 0 (т.е. практически отсутствуют какие-либо значимые дефекты регуляторных систем, а их функциональная активность оптимальна)” (Ушаков и др., 2007, стр. 391). В статье Нестеренко с соавт. (Nesterenko et al., 2012) при использовании тестового воздействия – света разной интенсивности (диапазон 20–80 Вт/м2 ФАР) при регистрации кривых ИФХ листьев редиса было показано, что наименьшие значения параметра Т0.5 наблюдали для зрелого 18-суточного листа (–0.11). Это может, по-видимому, свидетельствовать о большей устойчивости его регуляторных систем к воздействию света высокой интенсивности по сравнению с устойчивостью для молодого листа, для которого значение интегрального логарифмического показателя для параметра I(Т0.5) равно –0.55, что связано, вероятно, с меньшей устойчивостью регуляторных систем его ФСА к световому воздействию или менее развитыми защитными механизмами от фотоингибирования (Demmig-Adams, Adams, 1992). Считается, что “скорость развертывания защитных механизмов при умеренных интенсивностях света имеет решающее значение для устойчивости фотосинтетического аппарата растения в первую очередь на начальном этапе адаптации к свету, происходящем преимущественно в течение первой минуты освещения” (Птушенко и др., 2013).

ОЦЕНКА РЕАКЦИИ ФСА ЛИСТЬЕВ НА СТАРЕНИЕ С ПОМОЩЬЮ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ИФХ Fp/FТ И Т0.5

Анализ данных по возрастной зависимости параметра Т0.5 и отношения Fp/Fт показал наличие периода относительной стабильности их значений, который соответствует периоду зрелости листьев и имеет разную продолжительность для отдельных видов растений, что подтверждается литературными данными (Нестеренко, Сидько, 1984; Kharuk et al., 1994; Šesták, Šiffel, 1997; Нестеренко, Тихомиров, 2003, 2005; Романова и др., 2011). В работе Нестеренко с соавт. (Nesterenko et al., 2019) значения параметра Т0.5 для почти сформировавшихся листьев огурца, пшеницы и редиса с площадью 80–90% от максимальной площади листа (Мокроносов, 1981) имели близкие значения. На протяжении онтогенеза листьев растений после их формирования и до момента старения для трех видов растений изменения значений Т0.5 в течение примерно двух недель (с 6–7 и до 20–22 сут) не превышали 80%. Только после старения листьев наблюдалось резкое повышение значений. Так для 25-суточного листа пшеницы 5-го яруса значение Т0.5 увеличивалось по сравнению со зрелыми листьями (16–20-суточными) более чем в 2 раза. Известно также, что некоторые авторы рассматривают старение растений как один из видов стресса (имеется ряд эндогенных изменений, ухудшающих внутреннюю среду) (Thomas, Stoddart, 1980; Нестеренко и др., 2007). Для оценки величины реакции исследуемых параметров ИФХ на рассматриваемое воздействие (старение) был применен интегральный логарифмический показатель I, который рассчитывался по формуле (3).

Сравнение pеакции показателей ИФX (Fp/FТ, Т0.5) лиcтьев растений огурца, редиса и пшеницы на старение листьев с помощью интегрального логарифмического параметра I (табл. 1) показало близкие значения I(Т0.5) для трех видов растений в широком возрастном диапазоне. В то же время значения логарифмического показателя для отношения Fp/Fт для тех же растений отличались существенно (табл. 1), что можно объяснить разным характером возрастной зависимости параметра Fp/FТ по сравнению с параметром Т0.5 (Nesterenko et al., 2012) и тем, что период относительной стабильности значений параметров ИФХ соответствует периоду зрелости листьев и имеет разную продолжительность для отдельных видов растений (Kharuk et al., 1994; Šesták, Šiffel, 1997; Нестеренко, Тихомиров, 2003, 2005).

Таблица 1.  

Оценка величины реакции показателей ИФX (Fp/FT и Т0.5) листьев растений огурца, редиса и пшеницы на старение листьев с помощью интегрального логарифмического показателя I (отн. ед.)

Растение Возраст листа, сут Площадь,
% от макс.
Т0.5, с Fp/FT,
отн. ед.
I(Т0.5) I(Fp/FT)
Огурец 7 75 8.2 ± 1.2 3.5 ± 0.2 0.25 ± 0.01 –0.26 ± 0.02
  22 100 14.6 ± 1.6 1.9 ± 0.5    
Редис 6 80 12.3 ± 1.5 3.3 ± 0.2 0.22 ± 0.02 –0.37 ± 0.03
  24 100 20.5 ± 1.0 1.4 ± 0.2    
Пшеница 7 80 10.1 ± 1.7 3.5 ± 0.2 0.21 ± 0.02 –0.16 ± 0.02
  20 100 16.2 ± 2.4 2.4 ± 0.2    

Примечание. Интегральный логарифмический показатель I = lg(Ni/Ni0), где Ni – значение соответствующего параметра ИФХ стареющих листьев (20–23 сут); Ni0 – значение параметра ИФХ зрелых листьев (7–9–суточных). Расчет интегрального логарифмического показателя I на основании данных работы Нестеренко с соавт. (Nesterenko et al., 2019).

В работах Нестеренко с соавт. (Нестеренко 2014, 2015; Nesterenko et al., 2015) на примере листьев пшеницы Triticum aestivum L. изучали возрастную зависимость основных характеристик ИФХ и влияние на их значения интенсивности действующего света (ДС). Определяли максимальный квантовый выход ФС II (Fv/Fm), эффективный квантовый выход ФС II – ΦPSII; qP, qN и NPQ – показатели фото- и нефотохимического тушения флуоресценции хлорофилла, соответственно; отношение Fp/FТ и индекс жизнеспособности Rfd.При невысокой интенсивности ДС, (примерно 380 мкмоль/(м2 · с)) для флуоресцентных показателей влияние возраста листьев практически не сказывалось на их значениях, кроме Rfd. Увеличение интенсивности ДС до 580 мкмоль фотонов/(м2 · с) ФАР и выше приводило к существенному влиянию возраста листа на значения флуоресцентных показателей. Наиболее чувствительными к возрастному состоянию листьев оказалось отношение Fp/FТ и показатели нефотохимического тушения флуоресценции: NPQ, qN (Nesterenko et al., 2015).

ОЦЕНКА РЕАКЦИИ ФСА ЛИСТЬЕВ РЕДИСА НА ИЗМЕНЕНИЯ ИНТЕНСИВНОСТИ ДЕЙСТВУЮЩЕГО СВЕТА С ПОМОЩЬЮ Fp/FТ И Т0.5

Свет для хлоропластов рассматривается и в качестве субстрата фотосинтеза, и в качестве раздражителя (Тарчевский и др., 1975).

В работе Нестеренко с соавт. (Nesterenko et al., 2012) величина Т0.5 для зрелого 18-суточного листа редиса оставалась достаточно стабильной при вариации интенсивности возбуждающего флуоресценцию света в широком диапазоне (20–80 Вт/м2). Изменения не превышали 26%. В то же время для усредненного листа растения редиса (с учетом реакции разновозрастных листьев) значения логарифмического показателя для Т0.5 выше, чем для отношения Fp/FТ (табл. 2), что свидетельствует о большей чувствительности этого параметра к изменению интенсивности света в целом для растения, что важно при выборе более интегральной характеристики реакции ФСА на уровне растений.

Таблица 2.  

Интегральный логарифмический показатель I (отн. ед.) параметров Fp/FТ, Т0.5 разновозрастных листьев редиса при увеличении интенсивности света от 20 (40) до 80 Вт/м2 ФАР

Параметры
ИФХ
Интенсивность возбуждающего света при начальном измерении параметра ИФХ, Вт/м2 ФАР
     20      40
T0.5 0.30 ± 0.02 0.15 ± 0.02
Fp/FТ 0.19 ± 0.02 0.02 ± 0.01

Примечание. Вычисление интегрального логарифмического показателя I см. табл. 1, где Ni – значение соответствующего параметра ИФХ листьев редиса при интенсивности действующего света 80 Вт/м2 ФАР, Ni0 – значение параметра ИФХ при 20 (или 40) Вт/м2 ФАР. Расчет интегрального логарифмического показателя I на основании данных работы Нестеренко с соавт. (Nesterenko et al., 2012).

ОЦЕНКА СТЕПЕНИ ИЗМЕНЕНИЙ ЗНАЧЕНИЙ Т0.5 ПРИ ИЗМЕРЕНИИ ИФХ ЛИСТЬЕВ ПРИ ВОДНОМ ДЕФИЦИТЕ

Поведение параметра Т0.5 при стрессовом воздействии изучали на примере слабого обезвоживания. По данным работы В.Н. Шихова с соавторами (2016б) в условиях водного дефицита уже на третьи сутки значения Т0.5 для листьев листовой капусты резко возрастали (в 2.4 раза) и восстанавливались до прежних значений быстрее других характеристик ФСА (например, эффективный квантовый выход ФС II – ΦPSII, ETR) при восстановлении полива растений. Это может означать отсутствие нарушений в системе регуляции ФСА листьев растений, что подтверждается также восстановлением скорости электронного транспорта через фотосистему 2 после кратковременного водного дефицита (Li et al., 2013; Шихов и др., 2016б). Количественное сравнение чувствительности показателей ИФХ на стрессовое воздейтвие с помощью интегрального логарифмического показателя (I) приводится в табл. 3. Значения I для Т0.5 были самыми высокими как при обезвоживании, так и при репарациипо сравнению с показателями ΦPSII и EТR.

Таблица 3.  

Оценка реакции фотосинтетического аппарата листьев капусты сорта Бансэй Маруба на стрессовое воздействие (водный дефицит) и репарацию (оводнение) c помощью интегрального логарифмического показателя (I, отн. ед.) характеристик ИФX (Т0.5, ETR, ΦPSII)

Параметры
ИФХ
Условия
водный дефицит репарация
     четверо суток      одни сутки      четверо суток
T0.5 0.42 ± 0.03 –0.32 ± 0.03 –0.40 ± 0.03
ETR –0.13 ± 0.02 0.21 ± 0.01 0.19 ± 0.02
ΦPSII –0.13 ± 0.02 0.20 ± 0.02 0.18 ± 0.02

Примечание. Вычисление интегрального логарифмического показателя I см. табл. 1, где Ni – значение соответствующего параметра в результате воздействия (либо репарации–оводнения), Ni0 – значение параметра в начале исследования (или предыдущего воздействия – 4-суточного водного дефицита). Расчет интегрального логарифмического показателя I на основании данных работы В.Н. Шихова с соавт. (2016б).

Сравнение параметров флуоресценции хлорофилла двух сортов сахарной свеклы с разной устойчивостью их ФСА к засухе показало разную чувствительность параметров (F0, Fv/Fm, qP, qN) на данный стресс (Li et al., 2013). Наиболее чувствительным к водному стрессу среди параметров и характеристик ФСА оказался коэффициент нефотохимического тушения qN (изменения значений почти в 3 раза) (Li et al., 2013).

В ранее проведенной нами работе было показано, что изменения этой характеристики в онтогенезе листьев растений пшеницы находятся в пределах 30% (Нестеренко и др., 2015), что сопоставимо с изменениями значений параметра Т0.5 (табл. 1). По характеру изменений значений в онтогенезе и чувствительности к стрессовым воздействиям показатели ИФХ qN и Т0.5 сопоставимы, однако преимущество Т0.5 заключается в более простых условиях измерения по сравнению с qN (Nesterenko et al., 2019).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Наблюдаемые нами в экспериментах особенности в поведении Т0.5 и сравнение его с наиболее чувствительными к стрессам показателями ИФХ (qN, ETR, ΦPSII и Fp/FТ) дают основания предложить применение Т0.5 для косвенной оценки изменения активности ФСА в ситуациях, когда необходим оперативный интегральный контроль за состоянием ФСА. Для установления количественных закономерностей между активностью ФСА и флуоресцентным параметром T0.5 в конкретных стрессовых условиях необходимы дальнейшие исследования.

На основании полученных результатов (табл. 1–3) и анализа литературных данных по показателям ИФХ можно сделать вывод о перспективности применения параметра T0.5, представляющего время полуспада интенсивности флуоресценции хлорофилла в течение медленной стадии ИФХ, как одной из интегральных и оперативных косвенных оценок изменения активности ФСА листьев высших растений при определении его устойчивости к стрессовым воздействиям.

Работа проведена в рамках выполнения госзадания по теме № 56.1.4 Раздел VI Программы фундаментальных научных исследований госакадемий наук на 2013–2020 гг.

Список литературы

  1. Алекcеев А.А., Белов А.А., Киpжанов Д.В., Кукушкин А.К., 2012. Теоретическое исследование флуоресценции фотосинтетических пигментов при сложной зависимости интенсивности возбуждающего света от времени // Биофизика. Т. 57. С. 83–87.

  2. Ашофф Ю., 1984. Биологические ритмы. Т. 1. М.: Мир. 412 с.

  3. Булгаков Н.Г., 2002. Индикация состояния природных экосистем и нормирование факторов окружающей среды: обзор существующих подходов // Успехи соврем. биологии. Т. 122. № 2. С. 115–135.

  4. Бухов Н.Г., 2004. Динамическая световая регуляция фотосинтеза // Физиология растений. Т. 51. № 6. С. 825–837.

  5. Венедиктов П.С., Волгин С.Л., Казимирко Ю.В., Кренделева Т.Е., Кукарских Г.П., Макарова В.В., Лаврухина О.Г., Погосян С.И., Яковлева О.В., Рубин А.Б., 1999. Использование флуоресценции хлорофилла для контроля физиологического состояния зеленых насаждений в городских экосистемах // Биофизика. Т. 44. № 6. С. 1037–1047.

  6. Веселовский В.А., Веселова Т.В., 1990. Люминесценция растений. Теоретические и практические аспекты. М.: Наука. 200 с.

  7. Веселовский В.А., Веселова Т.В., Чернавский Д.С., 1993. Стресс растения. Биофизический подход // Физиология растений. Т. 40. № 4. С. 553–557.

  8. Гольцев В.Н., Каладжи Х.М., Паунов М., 2016. Использование переменной флуоресценции для оценки физиологического состояния фотосинтетического аппарата растений // Физиология растений. Т. 63. № 6. С. 881–907.

  9. Караваев В.А., Шагурина Т.Л., 1988. Медленная индукция флуоресценции и СО2-газообмен листьев бобов в присутствии различных химических агентов // Физиология растений. Т. 35. № 5. С. 962–968.

  10. Корнеев Д.Ю., 2002. Информационные возможности метода индукции флуоресценции хлорофилла. Киев: Алтерпресс. 188 с.

  11. Кочубей С.М., Шевченко В.В., Корнеев Д.Ю., 2006. Структурная организация и функциональные особенности световой фазы фотосинтеза. К.: Логос. 176 с.

  12. Лысенко В.С., Вардуни Т.В., Косенко П.O., Косенко Ю.В., Чугуева О.И., Семин Л.В., Горлачев И.А., Тарасов Е.К., Гуськова О.С., 2014. Исследование кинетических параметров флуоресценции хлорофилла в листьях Ficus benjamina методом видеорегистрации // Физиология растений. Т. 61. С. 449–453.

  13. Мокроносов А.Т., 1981. Онтогенетический аспект фотосинтеза. М.: Наука. 196 с.

  14. Нестеренко Т.В., Сидько Ф.Я., 1984. Индукция флуоресценции хлорофилла а в онтогенезе флаг-листа пшеницы // Биофизические исследования экосистем / Отв. ред. Терсков И.А. Новосибирск: Наука СО АН СССР. С. 83–88.

  15. Нестеренко Т.В., Сидько Ф.Я., 1993. О количественном описании медленной индукции флуоресценции хлорофилла в онтогенезе листьев высших растений // Физиология растений. Т. 40. № 1. С. 10–15.

  16. Нестеренко Т.В., Тихомиров А.А., 2003. Онтогенентический подход в оценке устойчивости растений к стрессовому воздействию методом индукции флуоресценции хлорофилла // ДАН. Т. 388. № 1. С. 119–122.

  17. Нестеренко Т.В., Тихомиров А.А., 2005. Применение онтогенетического подхода для флуоресцентных исследований фотосинтетического аппарата растений в стрессовых условиях // Биофизика. Т. 50. № 2. С. 335–340.

  18. Нестеренко Т.В., Тихомиров А.А., Шихов В.Н., 2007. Индукция флуоресценции хлорофилла и оценка устойчивости растений к неблагоприятным воздействиям // Журн. общ. биологии. Т. 68. № 6. С. 455–469.

  19. Нестеренко Т.В., Шихов В.Н., Тихомиров А.А., 2014. Световая зависимость медленной индукции флуоресценции хлорофилла в онтогенезе листьев растений пшеницы // ДАН. Т. 454. № 6. С. 729–732.

  20. Нестеренко Т.В., Шихов В.Н., Тихомиров А.А., 2015. Флуоресцентные показатели возрастных изменений фотосинтетического аппарата листьев пшеницы // Физиология растений. Т.62. №3. С.332–339.

  21. Птушенко В.В., Караваев В.А., Солнцев М.К., Тихонов А.Н., 2013. Биофизические методы экологического мониторинга. Фотосинтетические показатели листьев древесных растений в условиях города Москвы // Биофизика. Т. 58. Вып. 2. С. 312–320.

  22. Ризниченко Г.Ю., Рубин А.Б., 2007. Модели регуляции фотосинтетического электронного транспорта // Проблемы регуляции в биологических системах. Биофизические аспекты / Под ред. Рубина А.Б. М.; Ижевск: НИЦ “Регулярная и хаотическая динамика”, Ин-т компьютерных исследований. С. 165–194.

  23. Романова А.К., Семенова Г.А., Новичкова Н.С., Игнатьев А.Р., Мудрик В.А., Иванов Б.Н., 2011. Физиолого-биохимические и флуоресцентные показатели старения листьев сахарной свеклы в вегетативной фазе роста // Физиология растений. Т. 58. С. 221–233.

  24. Рубин А.Б., 2007. Введение // Проблемы регуляции в биологических системах. Биофизические аспекты / Под ред. Рубина А.Б. М.; Ижевск: НИЦ “Регулярная и хаотическая динамика”, Ин-т компьютерных исследований. 480 с.

  25. Сааков В.С., 2000. Концепция энергетических основ устойчивости зеленой клетки к действию экстремальных факторов внешней среды // ДАН. Т. 375. № 2. С. 278–285.

  26. Семихатова О.А., 1990. Энергетика дыхания растений в норме и при экологическом стрессе. Л.: Наука. 73 с.

  27. Тарчевский И.А., Безуглов В.К., Заботин А.И., Петров В.Е., 1975. Реактивность фотосинтетического аппарата. Казань: Изд-во Казан. ун-та. 104 с.

  28. Удовенко Г.В., 1988. Общие требования к методам и принципам диагностики устойчивости растений к стрессам // Диагностика устойчивости растений к стрессовым воздействиям / Под ред. Удовенко Г.В. Л.: ВИР. С. 5–10.

  29. Ушаков И.Б., Штемберг А.С., Шафиркин А.В., 2007. Реактивность и резистентность организма млекопитающих. М.: Наука. 493 с.

  30. Хебер У., Ланге О.Л., Шувалов В.А., 2007. Запасание и диссипация энергии света растениями как взаимнодополняющие процессы, вовлеченные в поддержание жизни растения // Проблемы регуляции в биологических системах. Биофизические аспекты / Под ред. Рубина А.Б. М.; Ижевск: НИЦ “Регулярная и хаотическая динамика” Ин-т компьютерных исследований. С. 195–222.

  31. Чернышев М.К., Гаджиев М.Ю., 1983. Математическое моделирование иерархических систем. М.: Наука. 190 с.

  32. Шабала С.Н., Войнов О.А., 1994. Динамика физиологических характеристик растений как элемент системы экологического мониторинга // Успехи соврем. биологии. Т. 114. № 2. С. 144–159.

  33. Шихов В.Н., Величко В.В., Нестеренко Т.В., Тихомиров А.А., 2011. Онтогенетический подход при оценке методом индукции флуоресценции хлорофилла реакции растений чуфы на условия культивирования // Физиология растений. Т. 58. № 2. С. 290–295.

  34. Шихов В.Н., Нестеренко Т.В., Тихомиров А.А., 2016а. Влияние света разной интенсивности на флуоресценцию хлорофилла в листьях пшеницы. Использование PAM-флуорометра // Физиология растений. Т. 63. № 3. С. 443–449.

  35. Шихов В.Н., Нестеренко Т.В., Тихомиров А.А., 2016б. Использование онтогенетического подхода при регистрации кривой Каутского в ходе стрессового воздействия на растения листовой капусты // Вестн. КрасГАУ. № 7. С. 114–120.

  36. Ashraf M., Harris P.J.C., 2013. Photosynthesis under stressful environments: An overview // Photosynthetica. V. 51. P. 163–190.

  37. Adams W.W., Demmig-Adams B., 2004. In chlorophyll a fluorescence. A signature of photosynthesis / Eds Papageorgiou G.C., Govindjee E. Dordrecht: Springer. P. 583–604.

  38. Basu P.S., Sharma A., Sukumaran N.P., 1998. Changes in net photo-synthetic rate and chlorophyll fluorescence in potato leaves induced by water stress // Photosynthetica. V. 35. P. 13–19.

  39. Demmig-Adams B., Adams W.W., 1992. III. Photoprotection and other responses of plants to high light stress // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. V. 43. P. 599–626.

  40. Fracheboud Y., Leipner J., 2003. The application of chlorophyll fluorescence to study light, temperature, and drought stress // Practical Applications of Chlorophyll Fluorescence in Plant Biology / Eds DeEll J.R., Toivonen P.M.A. Boston; Dordrecht; L.: Kluwer Academic Publishers. P. 125–150.

  41. Fryer M.J., Andrews J.R., Oxborough K., Blowers D.A., Baker N.R., 1998. Relation between CO2 assimilation, photosynthetic electron transport, and active CO2 metabolism in leaves of maizt in the field during periods of low temperature // Plant Physiol. V. 116. P. 571–580.

  42. Genty B., Briantais J.-M., Baker N.R., 1989. The relationship between the quantum yield of photosynthetic electron transport and quenching of chlorophyll fluorescence // Biochim. Biophys. Acta. V. 990. P. 87–92.

  43. Govindjee E., 1995. Sixty-three years since Kautsky: Chlorophyll a fluorescence // Aust. J. Plant Physiol. V. 22. P. 131–160.

  44. Jahns P., Holzwarth A.R., 2012. The role of the xanthophyll cycle and of lutein in photoprotection of photosystem II // BBA-Bioenergetics. V. 1817. P. 182–193.

  45. Kalaji H.M., Schansker G., Ladle R.J., Goltsev V., Bosa K. et al., 2014. Frequently asked questions about in vivo chlorophyll fluorescence: Practical issues // Photosynth Res. V. 122. P. 121–158.

  46. Kalaji H.M., Schansker G., Brestic M., Bussotti F., Calatayud A., et al., 2017. Frequently asked questions about chlorophyll fluorescence, the sequel // Photosynth. Res. V. 132. P. 13–66.

  47. Kharuk V.I., Morgun V.N., Rock B.N., Williams D.L., 1994. Chlorophyll fluorescence and delayed fluorescence as potential tools in remote sensing: A reflection of some aspects of problems in comparative analysis // Remote Sens. Environ. V. 47. P. 98–105.

  48. Kooten O., van, Snel J.F., 1990. The use of chlorophyll fluorescence nomenclature in plant stress physiology // Photosynth. Res. V. 25. № 3. P. 147–150.

  49. Lichtenthaler H.K., 1990. Applications of chlorophyll fluorescence in stress physiology and remote sensing // Applications of Remote Sensing in Agriculture / Eds Steven M.D., Clark J.A. L.: Butterworth Scientific. P. 287–305.

  50. Lichtenthaler H.K., 1992. The Kautsky effect: 60 years of chlorophyll fluorescence induction kinetics // Photosynthetica. V. 27. № 1. P. 45–55.

  51. Lichtenthaler H.K., Rinderle U., 1988. The role of chlorophyll fluorescence in the detection of stress conditions in plants // CRC Crit. Rev. Anal. Chem. V. 19. P. S29–S85.

  52. Li G.L., Wu H.X., Sun Y.Q., Zhang S.Y., 2013. Response of chlorophyll fluorescence parameters to drought stress in sugar beet seedlings // Russ. J. Plant Physiol. V. 60. P. 337–342.

  53. Lyu H., Lazár D., 2017a. Modeling the light-induced electric potential difference (ΔΨ), the pH difference (ΔpH) and the proton motive force across the thylakoid membrane in C3 leaves // J. Theor. Biol. V. 413. P. 11–23.

  54. Lyu H., Lazár D., 2017b. Modeling the light-induced electric potential difference ΔΨ across the thylakoid membrane based on the transition state rate theory // BBA-Bioenergetics. V. 1858. P. 239–248.

  55. Mohammed G.H., Binder W.D., Gillies S.L., 1995. Chlorophyll fluorescence: A review of its practical forestry appliations and instrumentations // Scand. J. Forest Res. V. 10. P. 383–410.

  56. Mohammed G.H., Pablo-Zarco-Tejada, Miller J.R., 2003. Applications of chlorophyll fluorescence in forestry and ecophysiology // Practical applications of chlorophyll fluorescence in plant biology / Eds DeEll J.R., Toivonen P.M.A. Boston-Dordrecht-London: Kluwer Academic Publishers. P. 79–124.

  57. Nesterenko T.V., Tikhomirov A.A., Shikhov V.N., 2006. Ontogenetic approach to the assessment of plant resistance to prolonged stress using chlorophyll fluorescence induction method // Photosynthetica. V. 44. P. 321–332.

  58. Nesterenko T.V., Tikhomirov A.A., Shikhov V.N., 2012. Influence of excitation light intensity and leaf age on the slow chlorophyll fluorescence transient in radish // Biophysics. V. 57. № 4. P. 464–468.

  59. Nesterenko T.V., Shikhov V.N., Tikhomirov A.A., 2015. Effect of light intensity on the age dependence of nonphotochemical fluorescence quenching in wheat leaf // Photosynthetica. V. 53. № 4. P. 617–620.

  60. Nesterenko T.V., Shikhov V.N., Tikhomirov A.A., 2019. Estimation of changes in the activity of photosynthetic apparatus of plant leaves based on half-time of fluorescence intensity decrease // Photosynthetica. V. 57. № 1. P. 132-136.

  61. Roháček K., 2002. Chlorophyll fluorescence parameters: The definitions, photosynthetic meaning and mutual relationships // Photosynthetica. V. 40. № 1. P. 13–29.

  62. Roháček K., Barták M., 1999. Technique of the modulated chlorophyll fluorescence: Basic concepts, useful parameters, and some applications // Photosynthetica. V. 37. № 3. P. 339–363.

  63. Sayed O.H., 2003. Chlorophyll fluorescence as a tool in cereal crop research // Photosynthetica. V. 41. № 3. P. 321–330.

  64. Šesták Z., Šiffel P., 1997. Leaf-age related differences in chlorophyll fluorescence // Photosynthetica. V. 33. № 3. P. 347–369.

  65. Tikhomirov A.A., Sid’ko F.Ya., 1982. Photosynthesis and structure of radish and wheat canopies as affected by radiation of different energy and spectral composition // Photosynthetica. V. 16. P. 191–195.

  66. Thomas H., Stoddart J.L., 1980. Leaf senescence // Annu. Rev. Plant Physiol. V. 31. P. 83–111.