Онтогенез, 2022, T. 53, № 2, стр. 155-160

ВВЕДЕНИЕ

Ген toothrin (tth) относится к эволюционно консервативному семейству генов d4. У позвоночных животных семейство представлено тремя генами, два из которых дифференциально экспрессируются в центральной и периферической нервной системе (Kulikova et al., 2013). У дрозофилы обнаружено два гена-гомолога этого семейства, но только один из них (drosophila d4 – dd4) кодирует белок с характерным С-концевым доменом парных цинковых пальцев PHD-типа, или D4-доменом (DPF). Было показано, что D4-домен белка DPF3/Cer-D4 человека способен связываться с метилированными и ацетилированными остатками лизинов гистонов 3 и 4 (Lange et al., 2008). Ранее мы показали специфический паттерн экспрессии мРНК гена dd4 в нервной системе и гонадах эмбрионов дрозофилы (Nabirochkina et al., 2002). Другой ген – tth – является особенным геном, кодирующим белок без домена D4, но с доменом 2/3, который также есть у D4-белков. Однако паттерн экспрессии TTH исследован не был. По литературным данным, домен 2/3 белка DPF3 семейства D4 человека играет роль коактиватора транскрипции в сигнальном пути NF-kB, который участвует в воспалительном ответе, пролиферации клеток и апоптозе (Ishizaka et al., 2012). Наличие гена, кодирующего белок только с доменом 2/3, дает возможность изучать роль этого домена и самого гена в онтогенезе на модельном организме Drosophila melanogaster.

Цель нашей работы состояла в изучении картины экспрессии белка TTH на личиночной стадии развития дрозофилы в имагинальных дисках и нервной системе. Для этого мы получили специфические к TTH антитела. Дополнительно, для более точного детектирования и визуализации продуктов его экспрессии in vivo, мы получили линию дрозофил, трансформированную генетической конструкцией для экспрессии GFP-меченного белка TTH.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Получение поликлональных антител к белку TTH.

Кроликов иммунизировали рекомбинантным белком, который состоял из последовательности С-концевых аминокислотных остатков (71 а. к. о.) белка TTH дрозофилы, полученной в бактериальной системе экспрессии E. coli (вектор pET-15b, Novagen). Антитела были очищены с помощью аффинной колонки, синтезированной на основе эпокси-активированной сефарозы 4B (GE healthcare), конъюгированной с рекомбинантным белком TTH.

2. Синтез конструкции, экспрессирующей гибридный белок TTH::GFP.

Синтез конструкции, несущей модифицированный ген tth мы осуществили в несколько этапов. На первом этапе была получена донорная конструкция. Для этого ген-репортер GFP встраивали в плазмидный вектор pBlueskript, содержащий клонированный в него ген устойчивости к канамицину, окруженный сайтами LoxP для Cre-специфической рекомбинации, и в полученную плазмиду клонировали фрагменты ДНК из области выше и ниже стоп-кодона tth (“плечи”). Второй этап представлен на рис. 1. Полученную донорную конструкцию встраивали в искусственную бактериальную хромосому BAC (клон CH322-14C11 из BACPAC Resources Center – https://bacpacresources.org), содержащую локус tth в фрагменте геномной ДНК размером 21.195 т. п. о. При встраивании, ген-репортер GFP попадает в рамку считывания гена tth со стороны 3'-концевой области. Внесение репортерных последовательностей в BAC-клон проводили согласно протоколу (Venken et al., 2008). С помощью электропорации модифицированный BAC-клон трансфецировали в клетки DY380. Трансформированные клетки выращивали при 30°С, затем инкубировали при 42°С 15 мин для индукции высокой рекомбинантной активности и делали их электрокомпетентными. Затем клетки электропорировали линеаризованной донорной плазмидной конструкцией для внесения в локус последовательности репортерного гена. Встраивание контролировали по появлению устойчивости к канамицину. Далее ген устойчивости к канамицину удаляли рекомбинацией Cre/Lox в штамме EL350. Правильно прошедшую рекомбинацию подтверждали с помощью ПЦР соответствующей области и секвенирования ПЦР-фрагмента. В результате модифицированный tth кодировал гибридный рекомбинантный белок TTH::GFP, содержащий GFP на С-конце.

Рис. 1.

Локализация гена tth и схема синтеза конструкции TTH::GFP. (а) Район локализации гена tth (выделен красным) на геномной карте D. melanogaster, взятой из P[acman] Genome Browser (https://bacpacresources.org). CH322-14C11 – границы BAC (CH322-14C11) (выделены зеленым); (б) схема создания конструкции для экспрессии белка TTH, несущего С-концевую модификацию GFP. attB-P(acman)-CamR BAC – бактериальная искусственная хромосома BAC (CH322-14C11), транскрибируемая область гена tth выделена зеленым. Обозначения: attB – сайт для сайт-специфической рекомбинации с attP сайтом, eGFP – зеленый флуоресцентный белок, white – маркерный ген, ответственный за пигментацию глаз дрозофилы, Kan^r –ген устойчивости к канамицину, LoxP – сайт для Cre-рекомбиназы, оранжевым кругом обозначен стоп-кодон.

3. Получение трансгенных дрозофил, экспрессирующих гибридный белок TTH::GFP.

Полученный в описанных выше экспериментах BAC-клон, имеющий в своем составе сайт attB для сайт-специфической рекомбинации (attB/attP) и маркер miniwhite для отбора трансформантов дрозофилы, наращивали в клетках EPI300 и выделяли с помощью набора для выделения плазмидной ДНК (QIAGEN Plasmid Midi Kit, Cat. no. 12143). ДНК модифицированного BAC-клона инъецировали в полярную плазму часовых эмбрионов дрозофилы линии attP2 (y¹ w^67c23; P{y^+t7.7=CaryP}attP2 DBSC #8622), мутантных по гену white и содержащих сайт attP для встраивания по нему attB-конструкций с помощью рекомбиназы PhiC31. Трансформантов выводили в линию гомозиготных дрозофил и использовали для исследования картины экспрессии гибридного белка TTH::GFP в тканях и органах личинок.

4. Приготовление препаратов и иммуноокрашивание.

Имагинальные диски, слюнные железы и центральную нервную систему выделяли из личинок третьего возраста в PBS, фиксировали 20 мин в растворе 4% параформальдегида в PBS на льду и отмывали в PBS. Окрашивали препарированные органы личинок третьего возраста, экспрессирующих бактериальную β-галактозидазу гена lacZ в глиальных клетках и клетках слюнных желез (repo>lacZ). Для окрашивания X-gal использовали реакционную смесь: 3 мM K4[FeII(CN)6], 3 мM K3[FeIII(CN)6], 1 мM MgCl₂, 150 мM NaCl, 0.25% X-gal в фосфатном буфере (pH 7.2) с добавлением 0.3% Triton-X100. Развитие окраски наблюдали в течение часа и останавливали, отмывая 3 раза в PBS. Далее проводили иммунохимическое окрашивание антителами к TTH, конъюгированными с пероксидазой хрена, по протоколу, изложенному в руководстве (Patel, 1994). Первичные кроличьи антитела против ТТН добавляли в разведении 1 : 25. В качестве вторичных использовали анти-кроличьи антитела, конъюгированные с HRP (пероксидаза хрена). Для окрашивания HRP добавляли раствор 0.5 мг/мл диаминобензидина (DAB) в PBS c 0.06% H₂O₂. Как негативный контроль использовали линию дрозофил с делецией гена tth.

5. Микроскопия.

Образцы анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа Carl Zeiss Axioscope 40 в проходящем свете после иммунохимического окрашивания, и с использованием флуоресцентных светофильтров при длине волны 509 для препаратов с GFP-флуоресценцией.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Сначала особенности экспрессии TTH изучали с помощью иммунохимического окрашивания с использованием полученных нами специфических антител против TTH. Оказалось, что белок локализован в ядрах клеток глазо-антенного имагинального диска, нервной системы (мозг и торакальный ганглий), и в личиночных секреторных органах: в ядрах клеток кольцевой и слюнных желез. В своих экспериментах мы использовали личинок, экспресирующих ген lacZ в глиальных клетках (repo>LacZ). Это позволило сравнить картины экспрессии TTH и β-галактозидазы (продукт LacZ) в нервной системе. Оказалось, что паттерн экспрессии белка TTH не совпадает с экспрессией β-галактозидазы (рис. 2б–2г). Это говорит о том, что белок TTH экспрессируется в основном в нейронах.

Рис. 2.

Картина экспрессии белка TTH и гибридного белка TTH::GFP на личиночной стадии развития D. melanogaster. (а) Схема личинки дрозофилы третьего возраста, зеленым отмечена экспрессия TTH::GFP; (б–г) Иммунохимическое окрашивание антителами против TTH (коричневый цвет) и окраска X-gal глиальных клеток и слюнной железы личинок repo>LacZ (голубой); (д–ж) Прижизненная визуализация органов личинки, экспрессирующей белок TTH::GFP (зеленый). Обозначения: КЖ – кольцевая железа, ГАИД – глазо-антенный имагинальный диск, М – мозг, ТГ – торакальный ганглий, СЖ – слюнная железа. Масштабная полоска – 50 мкм.

Тем не менее, в тканях с низкой экспрессией белка окраска антителами не всегда эффективна. Чтобы это предусмотреть, мы провели дополнительные эксперименты по получению линии трансгенных дрозофил, экспрессирующих GFP-меченый гибридный белок TTH::GFP (Материалы и методы). Флуоресцентные белки широко используются как репортеры для высокочувствительного молекулярного анализа in vitro и in vivo. Для этого, на основе бактериальной искусственной хромосомы (BAC), мы получили генетическую конструкцию, в которой в одной рамке считывания последовательно располагались участки, кодирующие биоспецифический и репортерный белки (Материалы и методы). Далее мы получили трансгенных дрозофил, несущих модифицированный ген tth, экспрессирующий гибридный белок TTH::GFP (Материалы и методы).

Прижизненная визуализация экспрессии белка TTH::GFP показала, что его распределение и локализация соответствует результатам, полученным с использованием специфических антител (рис. 2). Это говорит о том, что дополнительный локус tth (длиной 22 т. п. о.), функционирует как эндогенный. Мы установили, что TTH::GFP экспрессируется в ядрах клеток слюнных желез, кольцевой железы, хордотональных органах кутикулы, клетках органа Болвига, нейронах зрительной области ЦНС (в нейронах ламины), нейронах центрального нейропиля, а также в глазо-антенном имагинальном диске (дающем начало зрительным и обонятельным органам взрослого насекомого) и глазном стебельке (мембраны аксонов фоторецепторных нейронов).

Таким образом, мы впервые описали паттерн экспрессии белка TTH у модельного организма D. melanogaster и показали, что экспрессия этого белка прежде всего связана с нервной системой и структурами, отвечающими за формирование зрительного аппарата взрослого насекомого (глазо-антенный диск, орган Болвига, оптические доли мозга), а также с эндокринными (кольцевая и слюнные железы) органами личинок.

Известно, что белки семейства D4 входят в состав хроматин-ремоделирующих SWI/SNF-подобных комплексов BAP, которые по субъединичному составу соответствуют комплексам nBAF млекопитающих (Moshkin et al., 2012). Комплексы nBAF характерны для дифференцированных постмитотических нейронов, но не для нейральных клеток-предшественников (Lessard et al., 2007). Наши эксперименты показали, что родственный семейству D4 продукт гена tth, имеющий в своем составе только домен 2/3, локализуется в нейронах и нейробластах. Локализация нативного ТТН и TTH::GFP в ядрах клеток подтверждает функциональность сайта ядерной локализации, который характерен для домена 2/3, благодаря чему белки семейства D4 могут транспортироваться в ядро, например, в период развития нервной системы у высших организмов.

Таким образом, на основе наших предварительных данных, можно предположить, что ген tth участвует в развитии центральной и периферической нервной системы и, в частности, зрительных органов, а также в развитии и функционировании органов секреции, контролирующих гормональную регуляцию и пищеварение D. melanogaster.

В целом, анализ экспрессии TTH в имагинальных дисках, мозге и органах личинок дрозофилы показал, что этот белок локализован в ядрах нейронов мозга, а также в ядрах клеток кольцевой и слюнных желез. Локализация TTH в тканях кольцевой железы может свидетельствовать о вовлеченности этого белка в процесс гормональной регуляции развития дрозофилы, что согласуется с нашими ранними данными о влиянии экспрессии tth на скорость развития (Симонова и др., 2005). Высокая консервативность белковых доменов семейства D4 дрозофилы позволит экстраполировать их функцию на млекопитающих. У позвоночных животных нет генов, кодирующих белки без домена D4, однако существуют сплайс-варианты гена cer-d4 (DPF3), кодирующие такие их изоформы. По нашим данным (Ninkina et al., 2001), а также по данным MGI (Mouse Gene Expression Database http://www.informatics.jax.org), именно этот ген экспрессируется в сетчатке глаза мыши на очень высоком уровне. Для продолжения исследования роли TTH в развитии и функционировании нервной системы, мы планируем изучить особенности экспрессии TTH у дрозофилы на фоне известных белковых маркеров нейронов ЦНС, включая нейроны сетчатки зрительных органов.