1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Онтогенез
  4. T. 54, № 6, 2023

Онтогенез, 2023, T. 54, № 6, стр. 415-428

Трансгенные линии индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека ICGi022-A-6 и ICGi022-A-7 с доксициклин-управляемыми вариантами программируемой нуклеазы AsCas12a

С. В. Павлова a, b, d, К. Р. Валетдинова a, Т. Б. Маланханова a, Д. Е. Поливцев a, c, А. А. Малахова a, b, d, Е. В. Григорьева a, b, d, А. И. Шевченко a, b, d, С. М. Закиян a, b, d, С. П. Медведев a, b, d, *

a ФГБНУ “Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук”
630090 Новосибирск, просп. акад. Лаврентьева, 10, Россия

b ФГБУ “Национальный медицинский исследовательский центр им. акад. Е.Н. Мешалкина Министерства здравоохранения Российской Федерации”
630055 Новосибирск, ул. Речкуновская, 15, Россия

c ФГАОУВО “Новосибирский национальный исследовательский государственный университет”
630090 Новосибирск, ул. Пирогова, 2, Россия

d ФГБУН “Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук”
630090 Новосибирск, просп. акад. Лаврентьева, 8, Россия

* E-mail: medvedev@bionet.nsc.ru

Поступила в редакцию 24.07.2023
После доработки 16.10.2023
Принята к публикации 18.10.2023

Аннотация

Редактирование геномов плюрипотентных стволовых клеток человека с применением программируемых нуклеаз позволяет создавать модели наследственных патологий с помощью направленного трансгенеза, нокаута генов и замены отдельных нуклеотидов в последовательностях ДНК. С использованием CRISPR/SpCas9-опосредованной гомологичной рекомбинации в локусе AAVS1 были получены клоны индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) человека ICGi022-A (Malakhova et al., 2020), которые несут трансгены двух вариантов нуклеазы AsCas12a (также известной как AsCpf1), распознающих разные консенсусы PAM (ICGi022-A-6 (AsCas12a, PAM 5'-TTTV-3') и ICGi022-A-7 (AsCas12a, PAM 5'-TYCV-3')), и трансген обратного доксициклин-зависимого трансактиватора M2rtTA. С помощью Вестерн-блот анализа было показано, что добавление в культуральную среду доксициклина вызывает активацию экспрессии белков AsCas12a(TTTV) и AsCas12a(TYCV). Полученные трансгенные клоны ИПСК были подвергнуты молекулярно-генетическому и цитогенетическому анализу. С помощью количественной ПЦР и иммуноцитохимического анализа было показано, что в них наблюдается высокий уровень экспрессии мРНК генов-маркеров плюрипотентных клеток – OCT4, NANOG и SOX2, а также специфичная экспрессия белков-маркеров – OCT4, SOX2, SSEA-4 и TRA-1-60. Кроме того, с помощью метода спонтанной дифференцировки ИПСК в эмбриоидных тельцах, было установлено, что трансгенные клоны могут давать производные всех трех примитивных зародышевых листков: эктодермы, мезодермы и энтодермы. Цитогенетический анализ показал, что трансгенные клоны ИПСК имеют нормальный кариотип 46,XX.

Ключевые слова: индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК), трансгенез, система CRISPR/Cas9, нуклеаза AsCas12a (AsCpf1), изогенные клеточные линии

Список литературы

  1. Медведев С.П., Маланханова Т.Б., Валетдинова К.Р., Закиян С.М. Создание и исследование клеточных моделей наследственных нейродегенеративных заболеваний с помощью направленного редактирования геномов // Нейрохимия. 2021. Т. 38. № 4. С. 313–319.

  2. Устьянцева Е.И., Медведев С.П., Ветчинова А.С. и др. Платформа для исследования механизмов нейродегенерации с помощью генетически кодируемых биосенсоров // Биохимия. 2019. Т. 84. № 3. С. 423–435.

  3. Cowan C.A., Klimanskaya I., McMahon J. et al. Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts // N. Engl. J. Med. 2004. V. 350. № 13. P. 1353–1356.

  4. DeKelver R.C., Choi V.M., Moehle E.A. et al. Functional genomics, proteomics, and regulatory DNA analysis in isogenic settings using zinc finger nuclease-driven transgenesis into a safe harbor locus in the human genome // Genome Res. 2010. V. 20. № 8. P. 1133–1142.

  5. Gao L., Cox D.B.T., Yan W.X. et al. Engineered Cpf1 variants with altered PAM specificities // Nat. Biotechnol. 2017. V. 35. № 8. P. 789–792.

  6. Grigor’eva E.V., Malankhanova T.B., Surumbayeva A. et al. Generation of GABAergic striatal neurons by a novel iPSC differentiation protocol enabling scalability and cryopreservation of progenitor cells // Cytotechnology. 2020. V. 72. P. 649–663.

  7. Hellemans J., Mortier G., De Paepe A. et al. qBase relative quantification framework and software for management and automated analysis of real-time quantitative PCR data // Genome Biol. 2008. V. 8. P. R19.

  8. Kim D., Kim J., Hur J.K. et al. Genome-wide analysis reveals specificities of Cpf1 endonucleases in human cells // Nat. Biotechnol. 2016. V. 34. № 8. P. 863–868.

  9. Kleinstiver B.P., Tsai S.Q., Prew M.S. et al. Genome-wide specificities of CRISPR-Cas Cpf1 nucleases in human cells // Nat. Biotechnol. 2016. V. 34. № 8. P. 869–874.

  10. Malakhova A.A., Grigor’eva E.V., Pavlova S.V. et al. Generation of induced pluripotent stem cell lines ICGi021-A and ICGi022-A from peripheral blood mononuclear cells of two healthy individuals from Siberian population // Stem Cell Res. 2020. V. 48. P. 101952.

  11. Ran F.A., Hsu P.D., Wright J. et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system // Nat. Protoc. 2013. V. 8. № 11. P. 2281–2308.

  12. Zetsche B., Gootenberg J.S., Abudayyeh O.O. et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system // Cell. 2015. V. 163. № 3. P. 759–771.

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Онтогенез

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал